Tricarboxylsyrecyklussen (forkortet CTK , Krebs-cyklus , citratcyklus , citronsyrecyklus [1] [2] ) er den centrale del af den generelle katabolismevej , en cyklisk biokemisk proces, hvorunder acetyl -rester (CH 3 CO-) oxideres til kuldioxid (CO 2 ). I dette tilfælde dannes 2 molekyler CO 2 , 3 NADH , 1 FAD H 2 og 1 GTP i en cyklus (ellerATP ) [3] . Elektroner placeret på NADH og FADH 2 overføres efterfølgende til respirationskæden [2] , hvor ATP dannes under oxidative fosforyleringsreaktioner .
Tricarboxylsyrecyklussen er et nøgletrin i respirationen af alle celler , der bruger ilt , skæringspunktet for mange metaboliske veje i kroppen , et mellemtrin mellem glykolyse og elektrontransportkæden . Ud over en betydelig energirolle spiller kredsløbet også en betydelig plastisk funktion, det vil sige, at den er en vigtig kilde til forløbermolekyler, hvorfra i løbet af andre biokemiske transformationer så vigtige forbindelser for cellelivet som aminosyrer , kulhydrater , fedtsyrer osv. syntetiseres [4]
Citronsyreomdannelsescyklussen i levende celler (det vil sige tricarboxylsyrecyklussen) blev opdaget og undersøgt af den tyske biokemiker Hans Krebs , for dette arbejde blev han (sammen med F. Lipman ) tildelt Nobelprisen (1953) [1] .
Hos eukaryoter foregår alle reaktioner i Krebs-cyklussen inde i mitokondrierne , og i de fleste bakterier foregår cyklussens reaktioner i cytosolen [5] .
I begyndelsen af tricarboxylsyrecyklussen opgiver acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) sin acetylgruppe til en fire -carbon- forbindelse - oxaloacetat ( oxaloeddikesyre ), og seks-carbon- citrat (citronsyre) dannes. Acetyl-CoA er et oxidationsprodukt af forbindelser som glucose , aminosyrer og fedtsyrer [6] . Citratet isomeriseres derefter til isocitrat (isocitronsyre), som yderligere dehydrogeneres og decarboxyleres til en fem- carbonsyre , α-ketoglutarat . α-Ketoglutarat decarboxyleres igen og bliver til fire-carbon succinat (ravsyre). Succinatet omdannes derefter enzymatisk i tre trin til fire-carbon oxaloacetat, som er klar til at reagere med det nye acetyl-CoA-molekyle. I hver omgang af cyklussen kommer en acetylgruppe (det vil sige to carbonatomer ) ind i cyklussen i form af acetyl-CoA, og to carbonatomer forlader cyklussen i form af to CO 2 -molekyler ; et oxaloacetat-molekyle bruges til at danne citrat, og et bliver efterfølgende regenereret. Oxaloacetat forlader ikke cyklussen, og et oxaloacetatmolekyle kan teoretisk binde et ubegrænset antal acetylgrupper, og faktisk er oxaloacetat til stede i celler i meget lave koncentrationer. Fire af de otte stadier i cyklussen er oxidative processer, den oxidationsenergi, der frigives under disse processer, lagres effektivt i form af reducerede coenzymer NADH og FADH 2 [5] .
Selvom tricarboxylsyrecyklussen er central for energimetabolismen , er dens rolle ikke begrænset til at opnå og lagre energi. Fire- og fem-carbon-ringmellemprodukter tjener som forstadier til syntesen af mange forbindelser. For at genopbygge disse mellemforbindelser, der har forladt cyklussen, er der særlige anaplerotiske reaktioner i cellen [5] .
Som nævnt ovenfor forekommer alle reaktioner i tricarboxylsyrecyklussen i mitokondrier, og åndedrætskæden er placeret i mitokondrier (på den indre membran ). Hos de fleste bakterier er enzymerne i tricarboxylsyrecyklussen placeret i cytosolen, og plasmamembranen udfører funktioner, der ligner dem i mitokondriers indre membran [5] .
Tricarboxylsyrecyklussen omfatter 8 hovedstadier, som diskuteres i detaljer nedenfor.
Den første reaktion i cyklussen er den irreversible kondensation af acetyl-CoA med oxaloacetat til dannelse af citrat , katalyseret af enzymet citratsyntase (reaktion 1 i det generelle skema):
I denne reaktion sættes methylgruppen i acetyl-CoA's acetylgruppe til carbonylgruppen (andet carbonatom, C2-atom) i oxaloacetat . Under denne reaktion dannes en mellemforbindelse i det aktive center af enzymet - citroyl-CoA . Det hydrolyseres hurtigt og spaltes til frit CoA og citrat, som fjernes fra enzymets aktive sted . Hydrolyse af dette højenergi thioether mellemprodukt gør denne reaktion meget eksergonisk . En stor negativ ændring i den frie standardenergi af citratsyntasereaktionen er nødvendig for cykluskontrol, da den normale koncentration af oxaloacetat i cellen er meget lav, som tidligere nævnt. CoA frigivet under denne reaktion er yderligere involveret i den oxidative decarboxylering af det næste pyruvatmolekyle af pyruvatdehydrogenasekomplekset [ 7] .
Citratsyntase blev krystalliseret og røntgendiffraktion analyseret i nærvær og fravær af dets substrat og inhibitorer . Hver underenhed af dette homodimere enzym er et enkelt polypeptid med to domæner , hvoraf det ene er stort og stift, og det andet er mindre og mere plastisk; mellem disse domæner er det aktive sted for enzymet. Oxaloacetat, det første af de citratsyntasebindende substrater, inducerer betydelige konformationelle ændringer i plastdomænet, hvilket skaber et bindingssted for det andet substratmolekyle, acetyl-CoA (se til højre). Når citroyl-CoA dannes på det aktive sted af enzymet, sker der en anden konformationsændring i enzymet på grund af hydrolyse af thioesteren for at frigive CoA. Disse konformationelle ændringer, forårsaget først af binding til substratet og derefter til mellemproduktet, forhindrer for tidlig og uproduktiv spaltning af thioetherbindingen i acetyl-CoA. Kinetiske undersøgelser af citratsyntase bekræfter to-substrat-mekanismen for dens funktion beskrevet ovenfor. Ovenstående citratsyntasereaktion er en aldolkondensation [8] [9] (dog betragter nogle forfattere den som en Claisen-kondensation [7] ). Nedenfor er mekanismen for citratsyntasereaktionen:
Enzymet aconitase (mere præcist, aconitathydratase) katalyserer den reversible isomerisering af citrat til isocitrat gennem dannelsen af en mellemforbindelse - tricarboxylsyre- cis-aconitat , som normalt ikke forlader det aktive center. Aconitase tilføjer vand til dobbeltbindingen af cis -aconitatet forbundet med dets aktive center på to forskellige måder: Som et resultat af den ene af dem dannes citrat, som et resultat af den anden, isocitrat (reaktion 2 og 3 generelt skema) [7] :
Selvom ligevægtsblandingen ved pH 7,4 og 25 ° C indeholder mindre end 10 % isocitrat, forskydes reaktionen til højre i cellen, da isocitrat hurtigt trækkes ind i næste fase af cyklussen, og dets koncentration falder. Aconitase indeholder en jern-svovl-klynge , som tjener både til at binde substratet på det aktive sted og katalytisk hydrere eller dehydrere. I celler, der ikke indeholder nok jern , mister aconitase sin jern-svovl-klynge og får en regulerende rolle i jernmetabolismen (se IRE (biologi) for detaljer ). Aconitase er således et af mange enzymer med to forskellige funktioner [10] .
Nedenfor er et diagram, der illustrerer, hvordan aconitase-jern-svovl-klyngen binder isocitrat og omdanner det til cis -aconitat:
I det næste trin katalyserer enzymet isocitrat dehydrogenase den oxidative decarboxylering isocitrat til dannelse af α-ketoglutarat (oxoglutarat). Mn 2+ (eller Mg 2+ ) ionen [11] i enzymets aktive sted interagerer med carbonylgruppen i mellemproduktet oxalosuccinat , som dannes hurtigt, men ikke forlader det aktive sted, før det er decarboxyleret og omdannet til α-ketoglutarat [10] .
Disse transformationer diskuteres i detaljer nedenfor (reaktion 4 og 5 i det generelle skema):
To forskellige former (isozymer) af isocitrat dehydrogenase er blevet fundet i celler. For at den ene af dem fungerer, er NAD + nødvendig , for den anden NADP + (desuden kræver aktiviteten af sidstnævnte Mg 2+ ionen og ikke Mn 2+ [11] ). De reaktioner, de udfører, er ellers identiske. I eukaryoter er det NAD-afhængige isozym lokaliseret i mitokondriematrixen og er involveret i tricarboxylsyrecyklussen. Hovedfunktionen af det NADP-afhængige isozym, som forekommer både i mitokondriematrixen og i cytosolen, kan være dannelsen af NADPH , som er nødvendig for genoprettende anabolske processer [13] .
I det næste trin af tricarboxylsyrecyklussen sker der også oxidativ decarboxylering, hvor α-ketoglutarat omdannes til succinyl-CoA og CO 2 under påvirkning af α-ketoglutarat-dehydrogenasekomplekset ; NAD + fungerer som en elektronacceptor , mens CoA fungerer som en succinylgruppebærer. Oxidationsenergien af α-ketoglutarat lagres under dannelsen af en thioetherbinding i succinyl-CoA [13] (reaktion 6 i det generelle skema):
Denne reaktion er næsten identisk med pyruvatdehydrogenasereaktionen ved den oxidative decarboxylering af pyruvat, og a-ketoglutaratdehydrogenasekomplekset er ekstremt tæt på pyruvatdehydrogenasekomplekset (PDC) i struktur og funktion. Det omfatter 3 enzymer , der er homologe med enzymerne E 1 , E 2 og E 3 MPC, og dets cofaktorer er også thiaminpyrophosphat , lipoat , FAD, NAD og coenzym A. Begge komplekser har utvivlsomt en fælles evolutionær forfader. Selvom E 1 - enzymerne i begge komplekser er strukturelt ens, er deres aminosyresekvenser forskellige, og de er selvfølgelig specifikke for forskellige substrater: E 1 af PDC-komplekset binder pyruvat, og E 1 af α-ketoglutarat-dehydrogenasekomplekset binder α-ketoglutarat. E 2 enzymerne i begge komplekser er også meget ens og binder begge kovalent til lipoatet. E 3 -underenhederne af begge komplekser er identiske [14] .
Succinyl-CoA indeholder ligesom acetyl-CoA en thioetherbinding med en stor negativ standard fri hydrolyseenergi (ΔG'® ≈ -36 kJ/mol). I det næste trin af tricarboxylsyrecyklussen bruges den energi, der frigives under spaltningen af thioetherbindingen til at danne phosphoanhydridbindingen i GTP eller ATP, mens succinyl-CoA omdannes til succinat [14] (reaktion 6 i den generelle ordning):
Denne reversible reaktion katalyseres af enzymet succinyl-CoA-syntetase (succinylthiokinase); begge navne på dette enzym antyder, at nukleosidtrifosfat er involveret i denne reaktion [14] .
Denne energilagrende reaktion omfatter mellemtrin, hvor selve enzymmolekylet bliver phosphoryleret ved histidinresten i det aktive sted. Denne phosphorylgruppe, som har et højt overførselspotentiale, overføres til ADP eller GDP for at danne henholdsvis ATP eller GTP. Dyreceller har to isozymer af succinyl-CoA-syntetase, hvoraf den ene er specifik for ADP og den anden for BNP. Succinyl-CoA-syntetase består af to underenheder: α-underenheden (M r = 32.000) indeholder en phosphoryleret histidinrest (His 246 ) og et CoA-bindingssted, og β-underenheden (M r = 42.000) giver bindingsspecificitet til ADP eller BNP. Det aktive sted er placeret i rummet mellem underenhederne. Krystalstrukturen af succinyl-CoA syntetase indeholder to "power helices" ( engelsk power helices ), en i hver underenhed, og disse spiraler er orienteret på en sådan måde, at deres elektriske dipolmomenter skifter delvist positive ladninger til et negativt ladet histidinphosphat ( P-His ); på grund af dette stabiliseres den mellemliggende phosphorylerede form af enzymet [15] . Følgende er et reaktionsskema katalyseret af succinyl-CoA-syntetase:
Dannelsen af ATP (eller GTP) fra den energi, der er lagret under den oxidative decarboxylering af α-ketoglutarat, er en substratphosphoryleringsreaktion , ligesom syntesen af ATP under glycolyse , katalyseret af glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase og pyru . GTP syntetiseret af succinyl-CoA-syntetase kan donere sin terminale phosphorylgruppe til ADP for at danne ATP i en reversibel reaktion katalyseret af nukleosid-diphosphatkinase :
GTP + ADP → GDP + ATP, ΔG′ o = 0 kJ/mol.Slutresultatet af aktiviteten af ethvert isozym af succinyl-CoA-syntetase er således lagringen af energi i form af ATP. Ændringen i Gibbs-energien i nukleosid-diphosphatkinasereaktionen er nul, og ATP og GTP er energimæssigt ækvivalente med hinanden [16] .
Succinat dannet ud fra succinyl-CoA oxideres til fumarat under påvirkning af flavoproteinet succinatdehydrogenase [17] (reaktion 8 i det generelle skema):
I eukaryoter er succinatdehydrogenase tæt bundet til den mitokondrielle indre membran ; hos bakterier er den placeret på plasmamembranen. Dette enzym indeholder 3 forskellige jern-svovl-klynger og et molekyle kovalent bundet FAD, som er enzymets protesegruppe . Elektroner fra succinat passerer gennem FAD og jern-svovl-klynger, og derefter kommer de som elektronbærere ind i den respiratoriske elektrontransportkæde, der er placeret på den indre mitokondriemembran (plasmamembran i bakterier). FAD reduceres til FADH 2 , men ubiquinon er en yderligere elektronacceptor [2] . Overførslen af elektroner fra succinat gennem disse bærere til den endelige elektronacceptor, oxygen , er forbundet med syntesen af ATP, og der dannes 1,5 ATP-molekyler pr. elektronpar. Malonat , normalt fraværende i celler, er en stærk kompetitiv hæmmer af succinatdehydrogenase, og tilsætningen af denne forbindelse til mitokondrier blokerer aktiviteten af tricarboxylsyrecyklussen [17] .
Den reversible hydrering af fumarat til dannelse af L - malat katalyseres af enzymet fumarase (mere præcist, fumarathydratase ). Overgangsproduktet af denne reaktion er en carbanion [17] (reaktion 9 i det generelle skema):
Mekanismen for fumarasereaktionen er præsenteret mere detaljeret nedenfor:
Fumarase er et stereospecifikt enzym: det katalyserer hydreringen af dobbeltbindingen i fumarat ( trans - isomeren ), men ikke i maleat ( cis - isomeren af fumarat). Fumarase udviser også stereospecificitet i den omvendte reaktion: D-malat kan ikke tjene som et substrat for det [17] .
I den sidste reaktion af tricarboxylsyrecyklussen katalyserer det NAD-afhængige enzym L - malatdehydrogenase oxidationen af L-malat til oxaloacetat [17] (reaktion 10 i det generelle skema):
Under standard termodynamiske betingelser er ligevægten af denne reaktion stærkt forskudt til venstre, men i en levende celle er oxaloacetat konstant involveret i den meget eksergoniske citratsyntasereaktion (trin 1). Dette opretholder en ekstrem lav koncentration af oxaloacetat i cellen (< 10 −6 M), på grund af hvilken ligevægten af malatdehydrogenasereaktionen skifter til højre [17] .
Selvom enzymerne i tricarboxylsyrecyklussen sædvanligvis beskrives som opløselige komponenter i mitokondriematrixen (undtagen membranbundet succinatdehydrogenase), er der stigende beviser for, at disse enzymer eksisterer som multienzymkomplekser i mitokondrierne . Cyklusenzymer blev med succes isoleret fra ekstrakter af ødelagte celler, men multiproteinkomplekser dannet på grund af ikke-kovalente interaktioner af et protein med et andet eller med cellens strukturelle komponent ( membran , mikrotubuli , mikrofilament ) blev ødelagt. Men ved fremstilling af et celleekstrakt fortyndes indholdet af cellerne, inklusive enzymer, 100 eller 1000 gange [18] .
En række beviser tyder på, at multienzymkomplekser i celler giver en effektiv overgang af reaktionsprodukterne fra et enzym til det næste enzym i reaktionsvejen. Sådanne komplekser kaldes metaboloner . Adskillige enzymer i tricarboxylsyrecyklussen er blevet isoleret som en del af supramolekylære komplekser eller er blevet fundet forbundet med den mitokondrielle indre membran eller har vist sig at have langsommere diffusionshastigheder end individuelle proteiner i opløsning. Dette giver stærke beviser for substratudveksling mellem multienzymkomplekser og i andre metaboliske veje, og mange enzymer, der menes at være "opløselige", danner faktisk højt organiserede komplekser, der udveksler mellemprodukter [18] .
Reaktionerne, der udgør en omgang af tricarboxylsyrecyklussen, blev betragtet ovenfor. Acetylgruppen med to carbonatomer kommer ind i cyklussen ved at kombineres med oxaloacetat. To carbonatomer forlader kredsløbet i form af to CO 2 -molekyler dannet under oxidationen af isocitrat og α-ketoglutarat. Den energi, der frigives under disse oxidationsreaktioner, lagres i form af reducerede tre NADH-molekyler, et FADH 2 - molekyle og et ATP- eller GTP-molekyle. Ved slutningen af cyklussen regenereres oxaloacetatmolekylet. Det er værd at bemærke, at de to carbonatomer, der forlader kredsløbet i form af to CO2-molekyler, er forskellige fra de to carbonatomer, der kom ind i kredsløbet (i denne omgang) som en acetylgruppe. Kulstofatomerne medbragt af acetylgruppen kan kun forlade kredsløbet i form af CO 2 ved efterfølgende omdrejninger af cyklussen [3] .
Selvom citronsyrecyklussen kun producerer ét ATP-molekyle pr. omdrejning direkte (når succinyl-CoA omdannes til succinat), giver de fire oxidative reaktioner i cyklussen åndedrætskæden et betydeligt antal elektroner leveret af NADH og FADH 2 , og dermed give en betydelig mængde ATP i under oxidativ phosphorylering [3] .
Under glykolyse producerer et molekyle glucose to pyruvatmolekyler, 2 ATP og 2 NADH. Under oxidativ phosphorylering producerer en to-elektron overgang fra NADH til O 2 2,5 ATP, og en to-elektron overgang fra FADH 2 til O 2 producerer 1,5 ATP. Når begge pyruvatmolekyler oxideres til 6 CO 2 af pyruvatdehydrogenasekomplekset og under tricarboxylsyrecyklussen, og elektroner overføres til O 2 under oxidativ phosphorylering, er det samlede ATP-udbytte 32 molekyler pr. glucosemolekyle [3] :
| Reaktion | Output af ATP eller reducerede coenzymer | Samlet ATP-output |
|---|---|---|
| glucose → glucose-6-phosphat | −1 ATP | −1 |
| fructose 6-phosphat → fructose 1,6-bisphosphat | −1 ATP | −1 |
| 2 glyceraldehyd-3-phosphat → 2 1,3-bisphosphoglycerat | 2 NADH | 3 eller 5 |
| 2 1,3-bisphosphoglycerat → 2 3-phosphoglycerat | 2 ATP | 2 |
| 2 phosphoenolpyruvat → 2 pyruvat | 2 ATP | 2 |
| 2 pyruvat → 2 acetyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 isocitrat → 2 α-ketoglutarat | 2 NADH | 5 |
| 2 a-ketoglutarat → 2 succinyl-CoA | 2 NADH | 5 |
| 2 succinyl-CoA → 2 succinat | 2 ATP (eller 2 GTP) | 2 |
| 2 succinat → 2 fumarat | 2 FADH 2 | 3 |
| 2 malat → 2 oxaloacetat | 2 NADH | 5 |
| I alt : 30-32 |
32 ATP-molekyler svarer til 32 × 30,5 kJ / mol = 976 kJ / mol, hvilket er 34% af det teoretiske maksimum for fuldstændig oxidation af glukose - 2.840 kJ / mol. Disse beregninger blev foretaget under hensyntagen til standardværdierne for fri energiændringer, men hvis vi tager højde for cellens reelle behov for fri energi indeholdt i ATP, nærmer effektiviteten af oxidationsprocessen sig 65% af den teoretiske maksimum [19] .
| Scene | en | 2 | 3 | fire | 5 | 6 | 7 | otte |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ΔG'°, kJ/mol | -32.2 | 13.3 | -7.1 | -33,5 | -2.9 | 0 | -3.8 | 29,7 |
Reguleringen af enzymer i den metaboliske vej kan udføres ved hjælp af allosteriske effektorer og kovalente modifikationer, ved at holde koncentrationen af mellem- og slutprodukter i cellen konstant og forhindre deres overdrevne dannelse. Overgangen af carbonatomer fra pyruvat til tricarboxylsyrecyklussen er fint reguleret på to niveauer: omdannelsen af pyruvat til acetyl-CoA, startforbindelsen for cyklussen (pyruvatdehydrogenasereaktion), og aktiv acetats indtræden i cyklussen ( citratsyntasereaktion). Acetyl-CoA dannes ikke kun af pyruvatdehydrogenasekomplekset (PDH), men også af oxidation af fedtsyrer (β-oxidation) og nogle aminosyrer, så kontrol af disse veje er også vigtig for reguleringen af pyruvatoxidation og tricarboxylsyrecyklus. Desuden reguleres cyklussen af isocitrat dehydrogenase og α-ketoglutarat dehydrogenase reaktioner. Nedenfor vil vi overveje reguleringen af selve tricarboxylsyrecyklussen [20] ; for regulering af oxidativ decarboxylering af pyruvat, se artiklen Oxidativ decarboxylering af pyruvat .
Således er metabolitternes indtræden i tricarboxylsyrecyklussen strengt reguleret. Indtagelsen af metabolitter bestemmes af tre faktorer: tilgængeligheden af substratet, undertrykkelsen af akkumulerede produkter og allosterisk feedbackundertrykkelse af enzymer, der katalyserer de indledende stadier af cyklussen [21] .
Hvert af de tre eksergoniske trin i cyklussen - de trin, der katalyseres af citratsyntase, isocitratdehydrogenase og α-ketoglutaratdehydrogenase - kan under visse betingelser blive hastighedsbegrænsende . Tilgængeligheden af substrater for citratsyntase (acetyl-CoA og oxaloacetat) varierer afhængigt af cellens tilstand og hæmmer nogle gange hastigheden af citratdannelse. NADH, oxidationsproduktet af isocitrat og α-ketoglutarat, akkumuleres under visse betingelser, og ved et højt [NADH]/[NAD + ]-forhold undertrykkes begge dehydrogenasereaktioner alvorligt. Tilsvarende er malatdehydrogenasereaktionen i cellen i streng ligevægt (det vil sige, den er begrænset af substratet), og ved en høj værdi af [NADH]/[NAD + ]-forholdet og en lav koncentration af oxaloacetat, første fase af cyklussen bremses. Akkumuleringen af produkter begrænser alle tre begrænsende stadier af cyklussen: succinyl-CoA hæmmer α-ketoglutarat dehydrogenase (såvel som citratsyntase); citrat blokerer citratsyntase; slutproduktet, ATP, hæmmer citratsyntase og isocitratdehydrogenase. ADP, en allosterisk aktivator af citratsyntase, reducerer den hæmmende virkning af ATP på dette enzym. Ca 2+ ioner i hvirveldyrs muskelvæv , som tjener som signal for kontraktion og ledsager en stigning i behovet for ATP, aktiverer isocitrat dehydrogenase og α-ketoglutarat dehydrogenase samt pyruvat dehydrogenase komplekset (PDH). Koncentrationen af substrater og mellemprodukter i tricarboxylsyrecyklussen bestemmer således en sådan kulstofstrøm derigennem, ved hvilken koncentrationerne af ATP og NADH dannet vil være optimale [22] .
Normalt er glykolysehastighederne og tricarboxylsyrecyklussen tæt beslægtede, så kun en sådan mængde glucose omdannes til pyruvat, der forsyner cyklussen med en tilstrækkelig mængde "brændstof" - acetylgrupperne i acetyl-CoA. Koncentrationer af pyruvat, lactat og acetyl-CoA holdes normalt konstant. Glykolysehastigheden er relateret til hastigheden af citronsyrecyklussen, ikke kun gennem hæmningen af glykolysen ved høje niveauer af ATP og NADH, hvilket er karakteristisk for både glykolyse og det respiratoriske trin af glukoseoxidation, men også ved citratkoncentration. Citrat, det første produkt af tricarboxylsyrecyklussen, er en vigtig allosterisk hæmmer af phosphofructokinase-1 , et glykolytisk enzym [18] .
Den otte-trins cykliske proces med oxidation af en simpel acetyl-to-carbon-gruppe til CO 2 kan virke unødvendigt kompliceret og opfylder ikke det biologiske princip om maksimal økonomi . Tricarboxylsyrecyklussens rolle er imidlertid ikke begrænset til oxidationen af acetationen (og dermed kulhydrater, fedtsyrer og nogle aminosyrer, under oxidationen, som den dannes). Denne vej udgør kernen i metabolismen af mellemprodukter. De fire- og femkulstofslutprodukter fra mange kataboliske processer kommer ind i kredsløbet i mellemtrin. Oxaloacetat og α-ketoglutarat er for eksempel produkter af katabolismen af asparaginsyre og glutaminsyre , som dannes ved nedbrydning af proteiner. Mange cyklusmellemprodukter er involveret i nogle metaboliske processer og tjener som forløbere i mange anabolske processer. Tricarboxylsyrecyklussen er således en amfibolsk vej; den forbinder kataboliske og anabolske processer [23] .
Pyruvat er et produkt af kulhydratoxidation. Ydermere omdannes pyruvat til acetyl-CoA og er involveret i tricarboxylsyrecyklussen. Derudover er acetyl-CoA også et produkt af fedtsyreoxidation, så tricarboxylsyrecyklussen er også involveret i fedtkatabolisme [24] . Det er værd at bemærke, at pyruvat kan være involveret i tricarboxylsyrecyklussen uden at blive omdannet til acetyl-CoA, men ved at blive omdannet til malat under påvirkning af et æblesyreenzym [25] .
Fra α-ketoglutarat, dannet i tricarboxylsyrecyklussen, syntetiseres aminosyrerne glutamin , glutamat, prolin og arginin . Succinyl-CoA fungerer som en forløber i syntesen af porphyriner og hæm . Citrat er involveret i syntesen af fedtsyrer og steroler (acetyl-CoA dannes af citrat, derudover fungerer det som regulator [26] ). Malat kan transporteres fra mitokondrierne til cytoplasmaet, hvor det reversibelt omdannes til oxaloacetat. Det resulterende oxaloacetat kan tjene som en forløber for syntesen af aminosyrerne aspartat, asparagin , methionin , threonin og isoleucin samt pyrimidiner . Det kan også omdannes til phosphoenolpyruvat på bekostning af GTP, og phosphoenolpyruvat (PEP) kan tjene som en forløber i biosyntesen af phenylalanin , tyrosin , tryptophan , serin , glycin og cystein . Pyruvat, produceret af PEP under glykolyse, kan blive en forløber for alanin , leucin og valin , og kan også være involveret i gluconeogenese [24] [25] .
Mellemprodukter af tricarboxylsyrecyklussen, der har forladt cyklussen og er involveret i syntesen af forskellige forbindelser, erstattes af specielle anaplerotiske reaktioner . Under normale forhold er de reaktioner, hvori cyklusmellemprodukter er involveret i andre metaboliske veje, og de reaktioner, der erstatter deres afgang, i dynamisk ligevægt, så koncentrationen af citronsyrecyklusmellemprodukter holdes konstant [25] .
Tabellen nedenfor viser de vigtigste anaplerotiske reaktioner [25] :
| Reaktion | Enzym | væv/organisme |
|---|---|---|
| pyruvat + HCO 3 − + ATP ⇌ oxaloacetat + ADP + F n | pyruvatcarboxylase | lever , nyrer |
| phosphoenolpyruvat + CO 2 + BNP ⇌ oxaloacetat + GTP | phosphoenolpyruvat carboxykinase | hjerte , skeletmuskler |
| phosphoenolpyruvat + HCO 3 − ⇌ oxaloacetat + F n | phosphoenolpyruvat carboxylase | højere planter , gær , bakterier |
| pyruvat + HCO 3 − + NAD(P)H ⇌ malat + NAD(P) + | malik-enzym | udbredt blandt eukaryoter og bakterier |
I pattedyrets lever og nyre er den vigtigste anaplerotiske reaktion den reversible carboxylering af pyruvat til dannelse af oxaloacetat, katalyseret af enzymet pyruvatcarboxylase . Når der er et fald i oxaloacetat eller andre mellemprodukter i citratcyklussen, carboxyleres pyruvat for at danne yderligere oxaloacetat. Den enzymatiske tilføjelse af en carboxylgruppe til pyruvat kræver energi, som er taget fra ATP: den frie energi, der kræves for at tilføje en carboxylgruppe til pyruvat, er næsten lig med den frie energi, der kan opnås fra ATP. Pyruvatcarboxylase er et regulatorisk enzym og inaktiveres i fravær af acetyl-CoA, en positiv allosterisk modulator. Når acetyl-CoA, "brændstoffet" til tricarboxylsyrecyklussen, er til stede i overskud, stimulerer det pyruvatcarboxylasereaktionen og fremmer derved dannelsen af oxaloacetat, som igen gør det muligt at inddrage mere acetyl-CoA i tricarboxylsyrecyklus. Til implementering af pyruvatcarboxylase-reaktionen kræves vitaminet biotin , som fungerer som en protesegruppe af enzymet, der bærer CO 2 . Biotin skal være til stede i menneskets kost, det findes i mange fødevarer og syntetiseres af tarmbakterier [27] .
De andre anaplerotiske reaktioner, der er anført i tabellen ovenfor, styres også for at tilvejebringe en tilstrækkelig koncentration af mellemprodukter til tricarboxylsyrecyklussens funktion. For eksempel aktiveres phosphoenolpyruvatcarboxylase af fructose-1,6-bisphosphat, et glykolysemellemprodukt, der akkumuleres under forhold med overskydende pyrodruesyre [27] .
I planter og bakterier kan acetyl-CoA under glyoxylatcyklussen omdannes til succinat. Disse organismer kan således udføre anaplerotisk nedbrydning af neutrale fedtstoffer (for flere detaljer om glyoxylatcyklussen, se nedenfor) [4] .
Der er andre anaplerotiske måder. Aminosyrerne histidin, prolin, arginin, glutamin og glutamat kan omdannes til α-ketoglutarat og genoprette dets koncentration; isoleucin, valin, methionin, tryptophan - til succinyl-CoA, aspartat, phenylalanin og tyrosin - til fumarat; aspartat og aspragin til oxaloacetat. Aminosyrerne alanin, serin, threonin, cystein og glycin kan omdannes til pyruvat, som er nødvendigt for tricarboxylsyrecyklussen [24] .
Som nævnt ovenfor eksisterer en ufuldstændig cyklus af tricarboxylsyrer i nogle anaerobe organismer. For dem tjener det ikke til at opnå energi, men til at opnå forløbere til biosyntetiske processer. Disse organismer bruger de første tre reaktioner i cyklussen til at producere α-ketoglutarat, men da de mangler α-ketoglutarat dehydrogenase, kan de ikke udføre alle transformationerne i cyklussen. De har imidlertid 4 enzymer, der katalyserer den sekventielle omdannelse af oxaloacetat til succinyl-CoA, så de kan danne malat, fumarat, succinat og succinyl-CoA fra oxaloacetat i reaktioner, der er det omvendte af de "normale" (oxidative) reaktioner af cyklussen. Denne vej er en fermentering , hvorunder NADH, dannet under oxidationen af isocitrat , omdannes til NAD + ved reduktion af oxaloacetat til succinat [23] .
Hos planter , nogle hvirvelløse dyr og nogle mikroorganismer (f.eks. gær, Escherichia coli ), omdannes acetyl-CoA til succinat gennem glyoxylatcyklussen , tæt beslægtet med tricarboxylsyrecyklussen. Den generelle ligning for glyoxylatcyklussen ser sådan ud:
2 acetyl-CoA + NAD + + 2H2O → succinat + 2CoA + NADH + H +Det resulterende succinat er yderligere involveret i biosyntetiske processer. Hos planter er glyoxylatcyklussen lokaliseret i specielle organeller , glyoxisomer [28] [4] .
Nogle bakterier er i stand til at udføre den omvendte cyklus af tricarboxylsyrer . Under denne proces udføres reaktionerne i tricarboxylsyrecyklussen i den modsatte retning: hvor kulstofatomer kommer ind i kredsløbet i form af acetyl-CoA og efterfølgende oxideres til CO 2 , i den modsatte cyklus, tværtimod, acetyl -CoA er frigivet. Til implementeringen er der behov for elektrondonorer, og til disse formål bruger bakterier brint , sulfider eller thiosulfater . Andre enzymer i omvendt cyklus end de tilsvarende fremadgående cyklusenzymer inkluderer ATP-citratlyase , 2-oxoglutarat: ferredoxinoxyreduktase , pyruvatsyntase . Den omvendte cyklus af tricarboxylsyrer betragtes som et alternativ til fotosyntese gennem dannelsen af kulhydrater [29] .
Tricarboxylsyrecyklussen er en fælles vej for oxidation af acetylgrupper, hvortil stort set alle metaboliske veje for levende organismer er reduceret. Det er slet ikke den korteste vej for oxidation af acetat til CO 2 , men det har vist sig ved naturlig selektion at have de største fordele. Tidlige anaerober kan have brugt nogle af reaktionerne fra tricarboxylsyrecyklussen i lineære biosyntetiske processer. Faktisk bruger nogle moderne anaerobe mikroorganismer en ufuldstændig cyklus af tricarboxylsyrer, ikke som en energikilde, men som en kilde til forløbere for biosyntetiske processer (for flere detaljer, se afsnittet Modifikationer ). Sammen med udviklingen af cyanobakterier , som danner O 2 fra vand, blev jordens atmosfære aerob, og under påvirkning af naturlig selektion udviklede man aerob metabolisme i organismer, meget mere effektiv end anaerob gæring [23] .
Når de regulatoriske mekanismer af veje såsom tricarboxylsyrecyklussen forstyrres, kan der opstå alvorlig sygdom. Cyklusenzymer er kodet af husholdningsgener , og fraværet af funktionelle kopier af disse gener kan forklares ved tilstedeværelsen af vævsspecifikke træk ved cyklussen [30] . Blandt mennesker er mutationer , der påvirker cyklusenzymgener, meget sjældne, men de, der forekommer, er skadelige.
Defekter i fumarasegenet fører til glatte muskeltumorer ( leiomyomer ) og nyrer ; mutationer i succinatdehydrogenase forårsager binyrekræft ( fæokromocytom ) . Cellekulturer med sådanne mutationer akkumulerer fumarat ( i tilfælde af fumarasemutationer) og i mindre grad succinat (i tilfælde af succinatdehydrogenasemutationer), og denne akkumulering aktiverer den hypoxi - inducerede transkriptionsfaktor HIF-1α . Udviklingen af kræft kan være en konsekvens af tilstanden af pseudohypoxi. I celler med disse mutationer er der en øget ekspression af gener , der normalt reguleres af HIF-1α. Sådanne konsekvenser af mutationer i fumarase- og succinatdehydrogenasegenerne gør det muligt at klassificere dem som tumorundertrykkere [31] .
Forholdet mellem fumarase-defekter og forstyrrelser i nervesystemet er blevet vist [32] .
Mutationer, der ændrer aktiviteten af α-ketoglutarat dehydrogenase, fører til ophobning af aminosyrenedbrydningsprodukter i urinen, hvilket får urinen til at lugte som ahornsirup . Denne sygdom kaldes leucinose ( eng. Maple sirup urine disease ) [33] .
Adskillige forbindelser og reaktioner i tricarboxylsyrecyklussen blev opdaget i 1930 af Albert Szent-Györgyi , især etablerede han rollen som fumarat, en nøglekomponent i cyklussen. For sine opdagelser blev Szent-Györgyi tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medicin i 1937 [34] . Den komplette sekvens af reaktioner og dannede forbindelser blev etableret i 1937 af Hans Adolf Krebs, som han modtog Nobelprisen for i 1953 (sammen med F. Lipman) [35] (til hans ære fik tricarboxylsyrecyklussen et af sine navne) . I 1948 fastslog E. Kennedy og Albert Lehninger , at i eukaryoter forekommer alle reaktioner i cyklussen i mitokondrier [5] .
Da den tunge kulstofisotop 13 C og de radioaktive isotoper 11 C og 14 C blev tilgængelige for omkring 60 år siden , blev de brugt til at spore kulstofatomernes vej i tricarboxylsyrekredsløbet. Et af disse eksperimenter gav meget uventede resultater. Hydroxyl-mærket acetat blev kombineret med umærket oxaloacetat til dannelse af mærket citrat. Da citrat er et symmetrisk molekyle, blev det antaget, at det ville blive omdannet til α-ketoglutarat, blandt hvilket der ville være molekyler mærket ved forskellige carbonatomer. Imidlertid var der kun blevet isoleret én "sort" α-ketoglutarat-molekyler fra celler, og forskerne konkluderede, at citrat og ethvert andet symmetrisk molekyle ikke kunne være et mellemprodukt på vejen fra acetat til α-ketoglutarat; de foreslog, at kondensation af acetat og oxaloacetat producerede en usymmetrisk tricarboxylsyre, såsom cis -aconitat eller isocitrat . I 1948 etablerede Alexander Ogston prochiraliteten af citrat (tendensen til asymmetriske reaktioner i fravær af et chiralt center ), og forklarede derved resultaterne af eksperimenter og bekræftede, at det er citrat, der dannes i den første fase af cyklussen [36] .
For lettere at huske de syrer, der er involveret i Krebs-cyklussen, er der en mnemonisk regel :
A Whole Ananas And A Slice Of Soufflé Today Actually My Lunch , som svarer til serien - citrat, cis -aconitat, isocitrat, alfa-ketoglutarat, succinyl-CoA, succinat, fumarat, malat, oxaloacetat.
Der er også følgende mnemoniske digt (dets forfatter er assistent ved Institut for Biokemi i KSMU E. V. Parshkova [37] ):
Gedde ved acetyl citronslam , Men påskeliljen med en hest var bange Han er isolimon over ham, men Alfa-ketoglutar als. Succinyl Xia coenzym , Amber ils fumar ovo, Apple ek gemte til vinteren, Vendte om gedde åh igen.(oxaloeddikesyre, citronsyre, cis -aconitsyre, isocitronsyre, a-ketoglutarsyre, succinyl-KoA, ravsyre, fumarsyre, æblesyre, oxaloeddikesyre).
En anden version af digtet:
Gedden spiste acetatet, det viser sig citrat via cis -aconitate vil det være isocitrat give hydrogener OVER, det mister CO2 meget glad for det alfa-ketoglutarat oxidation kommer: NAD vil stjæle brint B1 og lipoat med coenzym A i en fart, tage CO2 og energien er knap dukkede op i succinyl straks blev gtf født og succinat blev tilbage. så han kom til FAD, der har brug for brint tabte brinter, han blev bare en fumarat. fumarat drak vand, og det blev til malat her kom jeg til at malate NAD, købte brinter Gedden dukkede op igen og stille gemte sig Beskytter acetatet...