| pyruvatkinase | |
|---|---|
| Identifikatorer | |
| Kode KF | 2.7.1.40 |
| Enzymdatabaser | |
| IntEnz | IntEnz visning |
| BRENDA | BRENDA indgang |
| ExPASy | NiceZyme udsigt |
| MetaCyc | metabolisk vej |
| KEGG | KEGG indgang |
| PRIAM | profil |
| FBF strukturer | RCSB PDB PDBe PDBj PDBsum |
| Søg | |
| PMC | artikler |
| PubMed | artikler |
| NCBI | NCBI proteiner |
| Mediefiler på Wikimedia Commons | |
Pyruvatkinase er et enzym fra klassen af transferaser ( EF-kode 2.7.1.40 ) involveret i det sidste trin af glykolysen . Det katalyserer overførslen af en phosphatgruppe fra phosphoenolpyruvat (PEP) til adenosindiphosphat (ADP), hvilket producerer et pyruvatmolekyle og et ATP -molekyle [1] . Pyruvatkinase er til stede i dyr i fire forskellige vævsspecifikke isozymer, som hver har specifikke kinetiske egenskaber, der er nødvendige for at tilpasse sig de skiftende metaboliske behov i forskellige væv.
De fire isozymer af pyruvatkinase udtrykt i hvirveldyr er L (lever), R (erythrocytter), M1 (muskler og hjerne) og M2 (væv fra tidligt foster og de fleste voksne væv). L- og R-isoenzymerne udtrykkes af PKLR -genet , mens M1- og M2-isoenzymerne udtrykkes af PKM2 -genet . R- og L-isoenzymerne adskiller sig fra M1 og M2 ved, at de er allosterisk reguleret . Kinetisk har R- og L-isoenzymer af pyruvatkinase to distinkte konformationelle tilstande; en med høj substrataffinitet og en med lav substrataffinitet. R-tilstanden, karakteriseret ved høj substrataffinitet, tjener som en aktiveret form af pyruvatkinase og stabiliseres af PEP og fructose 1,6-bisphosphat (FBP) for at fremme den glykolytiske vej. T-tilstanden, karakteriseret ved lav substrataffinitet, tjener som en inaktiveret form for pyruvatkinase bundet og stabiliseret af ATP og alanin , hvilket forårsager pyruvatkinasephosphorylering og hæmning af glykolyse [2] . M2-isoenzymet af pyruvatkinase kan danne tetramerer eller dimerer. Tetramerer har en høj affinitet for PEP, mens dimerer har en lav affinitet for PEP. Enzymatisk aktivitet kan reguleres ved phosphorylering af højaktive PKM2-tetramerer til inaktive dimerer [3] .
PKM-genet består af 12 exoner og 11 introner . PKM1 og PKM2 er forskellige splejsningsprodukter af M-genet ( PKM1 indeholder exon 9 og PKM2 indeholder exon 10) og adskiller sig kun med 23 aminosyrer inden for 56-aminosyreregionen (a.a. 378-434) ved deres carboxy -terminus [4] [5] . PKM - genet reguleres af heterogene ribonukleotidproteiner såsom hnRNPA1 og hnRNPA2 [6] . Den humane PKM2-monomer består af 531 aminosyrer og er en enkelt kæde opdelt i domænerne A, B og C. Aminosyresekvensforskellen mellem PKM1 og PKM2 gør det muligt for PKM2 at blive allosterisk reguleret af FBP og danne dimerer og tetramerer, mens PKM1 kan danner kun tetramerer [7] .
Mange enterobakterier, herunder E. coli , har to isoformer af pyruvatkinase, PykA og PykF, som er 37 % identiske i E. coli (Uniprot: PykA Arkiveret 27. marts 2022 på Wayback Machine , PykF Arkiveret 15. april 2021 på Wayback Machine ). De katalyserer den samme reaktion som i eukaryoter, nemlig dannelsen af ATP fra ADP og phosphoenolpyruvat , det sidste trin i glykolyse , et trin, der er irreversibelt under fysiologiske forhold. PykF er allosterisk reguleret af FBP, hvilket afspejler den centrale position af PykF i cellulær metabolisme [8] . Transskription af PykF i E. coli er reguleret af den globale transkriptionsregulator Cra (FruR) [9] [10] [11] . PfkB har vist sig at blive hæmmet af MgATP ved lave koncentrationer af Fru-6P, og denne regulering er vigtig for glukoneogenese [12] .
Pyruvatkinasereaktion under glykolyse sker i to trin. For det første overfører PEP phosphatgruppen til ADP og producerer ATP og pyruvatenolat . For det andet skal der tilføjes en proton til pyruvatenolatet for at opnå den funktionelle form af pyruvat, som cellen har brug for [13] . Da substratet for pyruvatkinase er en simpel phospho-sukker, og produktet er ATP, er pyruvatkinase et muligt primært enzym for udviklingen af glykolysecyklussen og kan være et af de ældste enzymer i alt jordbaseret liv. Phosphoenolpyruvat kunne være til stede abiotisk og har vist sig at blive produceret i højt udbytte fra den primitive trioseglykolysevej [14] .
I gærceller blev interaktionen mellem gærpyruvatkinase (YPK) med PEP og dets allosteriske effektorfructose 1,6-bisphosphat (FBP) fundet at blive forstærket af tilstedeværelsen af Mg2 + . Det blev således konkluderet, at Mg2 + er en vigtig cofaktor i katalysen af PEP til pyruvat med pyruvatkinase. Derudover har metalionen Mn 2+ vist sig at have en lignende, men stærkere effekt på YPK end Mg 2+ . Binding af metalioner til metalbindingssteder på pyruvatkinase øger hastigheden af denne reaktion [15] .
Reaktionen katalyseret af pyruvatkinase er det sidste trin i glykolysen. Dette er et af de tre stadier af denne sti, der begrænser hastigheden. Hastighedsbegrænsende trin er langsommere, kontrollerede trin på banen og bestemmer dermed banens samlede hastighed. I glykolyse er de hastighedsbegrænsende trin forbundet med enten ATP-hydrolyse eller ADP-phosphorylering, hvilket gør denne vej energetisk gunstig og i det væsentlige irreversibel i celler. Dette sidste trin er stærkt reguleret og bevidst irreversibelt, da pyruvat er en vigtig mellembyggesten for yderligere metaboliske veje [16] . Når pyruvat er produceret, går det enten ind i Krebs-cyklussen for yderligere ATP-produktion under aerobe forhold eller omdannes til mælkesyre eller ethanol under anaerobe forhold.
Pyruvatkinase tjener også som et regulerende enzym for gluconeogenese , den biokemiske vej, hvorved leveren producerer glucose fra pyruvat og andre substrater. Gluconeogenese bruger ikke-kulhydratkilder til at give glukose til hjernen og røde blodlegemer under faste, når direkte glukoselagre er opbrugt [16] . Under udsultning hæmmes pyruvatkinase, hvilket forhindrer "lækage" af phosphoenolpyruvat i at blive omdannet til pyruvat; i stedet omdannes phosphoenolpyruvat til glucose gennem en kaskade af gluconeogenese-reaktioner. Selvom det bruger lignende enzymer, er gluconeogenese ikke det modsatte af glykolyse. I stedet er det en vej, der undgår de irreversible trin i glykolyse. Desuden forekommer gluconeogenese og glykolyse ikke samtidigt i en celle på et givet tidspunkt, da de er gensidigt reguleret af cellulær signalering. Efter afslutning af gluconeogenese-vejen udskilles den producerede glucose fra leveren, hvilket giver energi til vitale væv i sulttilstand.
Glykolyse er stærkt reguleret i tre katalytiske trin: phosphorylering af glucose ved hexokinase , phosphorylering af fructose-6-phosphat ved phosphofructokinase og overførsel af phosphat fra PEP til ADP med pyruvatkinase. Under vildtypeforhold er alle tre af disse reaktioner irreversible, har en stor negativ fri energi og er ansvarlige for reguleringen af denne vej [16] . Pyruvatkinaseaktivitet er mest udbredt reguleret af allosteriske effektorer, kovalente modifikatorer og hormonkontrol. Den vigtigste regulator af pyruvatkinase er imidlertid fructose 1,6-bisphosphat (FBP), som tjener som en allosterisk effektor for enzymet.
Allosterisk regulering er bindingen af en effektor til et andet proteinsted end det aktive sted, hvilket forårsager en konformationsændring og en ændring i aktiviteten af det pågældende protein eller enzym. Pyruvatkinase har vist sig at være allosterisk aktiveret af FBP og allosterisk inaktiveret af ATP og alanin [17] . Pyruvatkinase-tetramerisering lettes af FBP og serin, mens tetramer-dissociation lettes af L-cystein [18] [19] [20] .
Fructose 1,6-bisphosphatFBP er den vigtigste kilde til regulering, fordi det kommer fra glykolysevejen. FBP er et glykolysemellemprodukt, der er et resultat af phosphoryleringen af fructose-6-phosphat . FBP binder til et allosterisk bindingssted i C-domænet af pyruvatkinase og ændrer konformationen af enzymet, hvilket får pyruvatkinaseaktiviteten til at blive aktiveret. [21] Som et mellemprodukt til stede i den glykolytiske vej giver FBP direkte stimulering , fordi jo højere koncentrationen af FBP er, desto højere er den allosteriske aktivering og størrelsen af pyruvatkinaseaktivitet. Pyruvatkinase er den mest følsomme over for virkningen af FBP. Som et resultat tjener de resterende reguleringsmekanismer som en sekundær modifikation [8] [22] .
Kovalente modifikatorer tjener som indirekte regulatorer, der kontrollerer phosphorylering, dephosphorylering, acetylering, succinylering og oxidation af enzymer, hvilket fører til aktivering og hæmning af enzymatisk aktivitet [23] . I leveren aktiverer glucagon og epinephrin proteinkinase A , som fungerer som en kovalent modificeringsmiddel ved phosphorylering og deaktivering af pyruvatkinase. Omvendt aktiverer insulinsekretion som reaktion på stigende blodsukker phosphoproteinphosphatase I , hvilket forårsager dephosphorylering og pyruvatkinaseaktivering til at øge glykolysen. Den samme kovalente modifikation har den modsatte effekt på enzymerne af gluconeogenese. Dette reguleringssystem er ansvarligt for at forhindre en ubrugelig cyklus ved at forhindre den samtidige aktivering af pyruvatkinase og de enzymer, der katalyserer gluconeogenese [24] .
Carbohydrate Response Element Binding Protein (ChREBP)ChREBP viste sig at være et vigtigt protein i transkriptionen af gener for L-isoenzymet af pyruvatkinase. ChREBP-domænerne er målsteder for regulering af pyruvatkinase med glucose og cAMP. Især ChREBP aktiveres af høj glucose og hæmmes af cAMP. Glucose og cAMP modsætter sig hinanden ved at regulere kovalente modifikatorer. CAMP binder til Ser196- og Thr666-bindingsstederne i ChREBP, hvilket forårsager phosphorylering og inaktivering af pyruvatkinase; glucose binder til Ser196- og Thr666-bindingsstederne i ChREBP, hvilket forårsager dephosphorylering og aktivering af pyruvatkinase. Som et resultat har cAMP og overskydende kulhydrater vist sig at spille en indirekte rolle i reguleringen af pyruvatkinase [25] .
For at forhindre en ubrugelig cyklus er glykolyse og gluconeogenese stramt reguleret for at sikre, at de aldrig arbejder i en celle på samme tid. Som et resultat stopper inhibering af pyruvatkinase af glucagon, cyklisk AMP og adrenalin ikke kun glykolyse, men stimulerer også gluconeogenese. På den anden side interfererer insulin med virkningen af glukagon, cyklisk AMP og adrenalin, hvilket får pyruvatkinase til at fungere normalt og stoppe glukoneogenese. Derudover har glucose vist sig at hæmme og forringe gluconeogenese uden at påvirke pyruvatkinaseaktivitet og glykolyse. Generelt spiller interaktionen mellem hormoner en nøglerolle i funktionen og reguleringen af glykolyse og glukoneogenese i cellen [26] .
Den hæmmende virkning af metforminMetformin eller dimethylbiguanid er den primære behandling for type 2-diabetes. Metformin har vist sig indirekte at påvirke pyruvatkinase gennem hæmning af gluconeogenese. Specifikt er metformintilskud forbundet med et markant fald i glucose-flux og en stigning i laktat/pyruvat-flux fra forskellige metaboliske veje. Selvom metformin ikke direkte påvirker pyruvatkinaseaktivitet, forårsager det et fald i ATP-koncentrationen. På grund af de allosteriske hæmmende virkninger af ATP på pyruvatkinase, resulterer et fald i ATP i nedsat hæmning og efterfølgende stimulering af pyruvatkinase. Derfor styrer en stigning i pyruvatkinaseaktivitet den metaboliske flux gennem glykolyse snarere end gennem gluconeogenese [27] .
Heterogene ribonukleotidproteiner (hnRNP'er) kan virke på PKM-genet for at regulere ekspressionen af M1- og M2-isoformerne. PKM1- og PKM2-isoformerne er splejsningsvarianter af PKM-genet, der adskiller sig med en exon. Forskellige typer af hnRNP, såsom hnRNPA1 og hnRNPA2, kommer ind i kernen under hypoxiske forhold og modulerer ekspression, så PKM2 aktiveres. [28] Hormoner såsom insulin øger PKM2-ekspression, mens hormoner som tri-iodothyronin (T3) og glucagon reducerer PKM2-niveauer [29] .
Genetiske defekter i dette enzym forårsager sygdommen kendt som pyruvatkinase-mangel . I denne tilstand bremser manglen på pyruvatkinase processen med glykolyse. Denne effekt er især skadelig for celler, der mangler mitokondrier , da disse celler skal bruge anaerob glykolyse som deres eneste energikilde, da Krebs-cyklussen ikke er tilgængelig. For eksempel bliver røde blodlegemer, der er i en tilstand af pyruvatkinase-mangel, hurtigt ATP-mangelfulde og kan gennemgå hæmolyse . Derfor kan pyruvatkinase-mangel forårsage kronisk nonsfærocytisk hæmolytisk anæmi (CNSHA) [30] .
Mutation af PK-LR-genetPyruvatkinase-mangel er forårsaget af et autosomalt recessivt træk. Pattedyr har to pyruvatkinase gener, PK-LR (som koder for L og R pyruvat kinase isozymerne) og PK-M (som koder for M1 pyruvat kinase isozym), men kun PKLR koder for det røde blod isozym, der forårsager pyruvat kinase mangel. Over 250 mutationer i PK-LR-genet er blevet identificeret og er forbundet med pyruvatkinase-mangel. DNA-test har ført til opdagelsen af placeringen af PKLR på kromosom 1 og udviklingen af direkte gensekventeringstests til den molekylære diagnose af pyruvatkinase-mangel [31] .
Reaktive oxygenarter (ROS) er reaktive oxygenarter. I humane lungeceller har ROS vist sig at hæmme M2-isoenzymet af pyruvatkinase (PKM2). ROS opnår denne hæmning ved at oxidere Cys358 og inaktivere PKM2. Som et resultat af PKM2-inaktivering omdannes glukosefluxen ikke længere til pyruvat, men bruges i stedet i pentosephosphatvejen, hvilket fører til et fald og afgiftning af ROS. Således forstærkes de skadelige virkninger af ROS og forårsager større oxidativ stress på lungeceller, hvilket fører til potentiel tumordannelse. Denne hæmmende mekanisme er vigtig, fordi den kan tyde på, at regulatoriske mekanismer i PKM2 er ansvarlige for at fremme cancercellers modstand mod oxidativt stress og øge tumorigenese [32] [33] .
Phenylalanin hæmningPhenylalanin har vist sig at fungere som en kompetitiv hæmmer af pyruvatkinase i hjernen. Selvom graden af inhiberende aktivitet af phenylalanin er den samme i både føtale og voksne celler, er enzymer i føtale hjerneceller betydeligt mere sårbare over for hæmning end enzymer i voksne hjerneceller. En undersøgelse af PKM2 hos børn med den genetiske hjernesygdom phenylketonuri (PKU) viste forhøjede niveauer af phenylalanin og et fald i effektiviteten af PKM2. Denne hæmningsmekanisme giver indsigt i pyruvatkinases rolle i hjernecelleskade [34] [35] .
Kræftceller har en karakteristisk accelereret metabolisk mekanisme, og pyruvatkinase menes at spille en rolle i kræftudvikling. Sammenlignet med raske celler har kræftceller forhøjede niveauer af PKM2-isoformen, især dimeren med lav aktivitet. Derfor bruges serum-PKM2-niveauer som cancermarkører. Dimeren med lav aktivitet tillader akkumulering af phosphoenolpyruvat (PEP), hvilket efterlader store koncentrationer af glykolytiske mellemprodukter til syntesen af biomolekyler, som i sidste ende vil blive brugt af cancerceller [7] . Fosforylering af PKM2 af mitogen -aktiveret proteinkinase 1 (ERK2) inducerer en konformationsændring, der tillader PKM2 at komme ind i kernen og regulere glykolytisk genekspression, der kræves til tumorudvikling [36] . Nogle undersøgelser hævder, at der under carcinogenese er et skift i udtryk fra PKM1 til PKM2. Tumormikromiljøet, såsom hypoxi, aktiverer transkriptionsfaktorer, såsom hypoxi-inducerbar faktor , for at fremme PKM2-transkription, som danner en positiv feedback-loop for at forbedre sin egen transkription.
Et reversibelt enzym med en lignende funktion, pyruvatphosphatdikinase (PPDK), findes i nogle bakterier og er blevet overført til en række eukaryote anaerobe grupper (f.eks. Streblomastix , Giardia , Entamoeba og Trichomonas ), tilsyneladende via et horisontalt translationsgen i to eller flere tilfælde. I nogle tilfælde vil den samme organisme have både pyruvatkinase og PPDK [37] .
| Enzymer | |
|---|---|
| Aktivitet | |
| Regulering | |
| Klassifikation | |
| Typer |
|