CRISPR

CRISPR (fra det engelske  clustered regularly interspaced short palindromic repeats  - short palindromic repeats regularly arranged in groups [1] ) er specielle loci af bakterier og archaea [2] bestående af direkte gentagne sekvenser , der er adskilt af unikke sekvenser ( spacere ). Spacere er lånt fra fremmede genetiske elementer , som cellen støder på ( bakteriofager , plasmider ). RNA transskriberet _fra CRISPR loci, sammen med associerede Cas - proteiner , giver adaptiv immunitet på grund af komplementær binding af RNA til nukleinsyrer af fremmede elementer og deres efterfølgende ødelæggelse af Cas-proteiner. Til dato er der dog meget bevis for involvering af CRISPR i processer, der ikke er relateret til immunitet .

Brugen af ​​CRISPR-Cas metoder til rettet genom redigering er en lovende retning i moderne genteknologi . For 2016 bruger forskere i vid udstrækning tilgange baseret på CRISPR-Cas-systemer; måske i fremtiden vil disse tilgange blive brugt i medicin til behandling af arvelige sygdomme [3] .

CRISPR-Cas er også vigtig for målrettet lægemiddellevering og deres frigivelse under ekstern påvirkning - til dette bruges materialer, der inkluderer DNA-sektioner [4] .

Studiehistorie

Det første CRISPR-locus blev opdaget i bakterien Escherichia coli i 1987 af en gruppe japanske videnskabsmænd ledet af Yoshizumi Isino . De bemærkede gentagne elementer i denne bakteries genom, adskilt af ikke-gentagende sekvenser ( spacere ) [5] ; dog tillagde videnskabsmænd ikke stor betydning for deres observation. En storstilet undersøgelse af CRISPR blev startet af den spanske forsker Francisco Mojica , som i 1993 opdagede gentagne sekvenser adskilt af huller i genomet af archaea Haloferax mediterranei . Han bemærkede, at gentagelserne i genomerne af denne archaea og E. coli er meget ens i struktur, men har intet til fælles i nukleotidsekvenser . Ifølge Mojic skal gentagelser, der er så ens i struktur, som systematisk er meget fjerne grupper af prokaryoter , udføre en meget vigtig funktion. Til at begynde med kaldte han den nye klasse af gentagelser "short regularly spaced repeats, SRSRs "  , men senere, efter hans forslag, blev dette navn ændret til "short palindromic repeats regularly arranged in groups" ( engelsk clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR ) . Mojica fortsatte med at søge efter CRISPR i genomerne af andre mikrober, og i 2000 havde han fundet dem i 20 mikroorganismer, inklusive pestbacillen Yersinia pestis og andre patogener [6] . I 2002 blev cas - generne opdaget  - generne for CRISPR-loci, der koder for Cas-proteiner [7] .  

På trods af opdagelsen af ​​CRISPR-Cas-systemer i en lang række prokaryoter, var lidt kendt om funktionerne af CRISPR indtil 2005. I 2005 offentliggjorde Mojica og kolleger [8] resultaterne af deres nye undersøgelser, hvor det blev fundet, at spacere svarer til sekvenser fra bakteriofaggenomer, såvel som plasmidregioner. De fandt også, at E. coli -stammer, hvis CRISPR-loci indeholder en spacer svarende til P1 -fagen, er resistente over for denne fag og konkluderede, at CRISPR-loci er forbundet med den adaptive immunitet af prokaryoter. Samme år udkom publikationer [9] [10] af yderligere to forskningsgrupper, som kom frem til samme konklusion [6] .

I 2006 blev en klassificering af kendte CRISPR'er udviklet, og en mulig mekanisme for CRISPR-baseret adaptiv immunitet blev foreslået [11] . I 2007 etablerede en forskergruppe ledet af Philipp Horvath endelig og beviste eksperimentelt [6] CRISPRs deltagelse i at sikre arbejdet med adaptiv immunitet specifik for målsekvenser; samtidig blev Cas-proteinernes nøglerolle i denne proces afsløret [12] . For denne præstation blev han i 2015 tildelt Massry -prisen sammen med andre videnskabsmænd, der har ydet et væsentligt bidrag til studiet af CRISPR ( Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier ) [13] .  I 2008 blev det vist, at CRISPR-systemet kræver specielt bearbejdet CRISPR RNA (crRNA) for at virke, og CRISPR-systemets evne til at udføre DNA- interferens blev også demonstreret . Interferens, målretning af RNA'er og målretning mod specifikke DNA-sekvenser er tre opdagelser i 2007-2008, der startede udviklingen af ​​CRISPR-baserede genteknologiske metoder [14] .

En række efterfølgende vigtige opdagelser vedrørende design af type II CRISPR-systemer (især behovet for Cas9 -proteinet og et yderligere lille RNA, kaldet tracrRNA, udover crRNA), gjorde det muligt i 2012 eksperimentelt at teste det første kunstigt udviklet type II CRISPR system. I begyndelsen af ​​2013 (med ca. to ugers mellemrum) viste flere grupper, at kunstige CRISPR-Cas-systemer ikke kun kan fungere i bakterielle og in vitro - celler, men også i eukaryote celler [14] .

De næste to et halvt år så udviklingen af ​​CRISPR metoder og anvendelsen af ​​denne metode i forskellige grupper af organismer . I april 2015 offentliggjorde en gruppe videnskabsmænd fra Kina resultaterne af deres undersøgelse, hvor genomerne af menneskelige embryoner blev redigeret ved hjælp af CRISPR-Cas9 [15] . Nøjagtigheden af ​​redigeringen i dette eksperiment var imidlertid meget lav [15] , og selve eksperimentet blev tvetydigt opfattet af det videnskabelige samfund [16] . I begyndelsen af ​​2016 rapporterede forskere fra USA, at de var i stand til at reducere antallet af fejl under driften af ​​CRISPR-Cas9 til næsten nul [17] . Til dato anses CRISPR for at være den vigtigste teknologiske innovation i biovidenskaberne siden opfindelsen af ​​polymerasekædereaktionen (PCR), opdaget tre årtier tidligere [14] . For introduktionen af ​​genredigeringsteknikker ved hjælp af CRISPR-Cas9 modtog Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentier 2020 Nobelprisen i kemi [18] .

I 2016 fandt en gruppe videnskabsmænd ud af, at CRISPR-Cas-systemer stammede fra transposoner , der mistede deres mobilitet og fikserede i genomet [19] [20] . En fylogenetisk undersøgelse har vist, at alle Cas- endonukleaser stammer fra en enkelt transposon af alle transposoner, der bærer IscB-endonukleasen [19] .

Generelle principper

CRISPR-Cas systemer adskiller sig både strukturelt og funktionelt. Alle CRISPR-Cas-systemer har dog en række fællestræk [14] .

CRISPR loci kan kun udføre funktionen af ​​immunitet i nærvær af cas gener , som normalt er placeret tæt på CRISPR. Sættet af cas - gener bestemmer typen af ​​CRISPR-Cas-system. CRISPR-loci er korte (normalt omkring 30-40 nukleotider lange) direkte gentagelser, der er adskilt fra hinanden af ​​ikke-gentagende spacere afledt af DNA'et fra de fremmede genetiske elementer, som cellen eller dens forstadier støder på. Længden af ​​afstandsstykker er normalt sammenlignelig med længden af ​​gentagelser. Før et antal repeats og spacere er der en ledersekvens, der som regel indeholder en promotor , hvorfra ensrettet transkription af CRISPR repeats og spacere begynder. Spacere er fuldt integreret i cellegenomet og overføres til dets efterkommere under deling [14] . Hos bakterier kombineres integrationen af ​​nye spacere i genomet med tabet af overflødige og fremmede gener; derfor formår bakterier at undgå en signifikant stigning i genomets størrelse - i modsætning til højere eukaryoter , hvor gentagne sekvenser afledt af eksogene genetiske elementer udgør en væsentlig del af genomet [21] .

Ud over strukturel lighed kombinerer forskellige CRISPR-Cas-systemer tre nøglestadier af CRISPR-medieret immunitet: tilegnelse ( engelsk  tilegnelse ) eller tilpasning ( engelsk  tilpasning ) [21] , udtryk ( engelsk  udtryk ) og interferens ( engelsk  interferens ). På akkvisitionsstadiet indsættes en ny spacer i CRISPR, dannet af et fremmed genetisk element, der er kommet ind i cellen. På ekspressionsstadiet finder CRISPR-transkription og -bearbejdning af korte CRISPR-RNA'er (crRNA'er) rettet mod et specifikt mål sted. Under interferens genkender crRNA-Cas ribonukleoproteinkomplekset målnukleinsyren på grund af komplementær baseparring af målet med crRNA, hvorefter det skærer målet på grund af endo- og/eller exonukleaseaktiviteten af ​​Cas-proteiner [14] [22] .

Interessant nok har arbejdet med CRISPR-Cas-systemer mange grundlæggende punkter til fælles med arbejdet i pattedyrets immunsystem . Således kan selv en defekt bakteriofag forårsage CRISPR- immunisering (det vil sige indsættelse af en ny spacer), ligesom pattedyrs immunrespons kan udvikle sig, når et dræbt patogen introduceres [21] .

CRISPR-Cas-systemer kan overføres fra mikroorganisme til mikroorganisme ved hjælp af horisontal genoverførsel . At modvirke invasion af fremmede genetiske elementer i en bakterie er ikke altid gavnligt for bakterien. For eksempel kan bakterien Staphylococcus epidermidis opleve et fald i antibiotikaresistens på grund af ødelæggelsen af ​​CRISPR-Cas-systemet af de konjugative plasmider, der gav denne resistens. Hos Staphylococcus aureus fører et reduceret antal CRISPR-loci til en stigning i antallet af profager , plasmider og transponerbare genetiske elementer i cellen, hvilket øger bakteriens virulens . Imidlertid kan CRISPR-Cas loci, som forhindrer spredningen af ​​mobile genetiske elementer, der er nyttige under givne forhold, forsvinde [21] [23] .

Indkøb af afstandsstykker

Fordi CRISPR-medieret adaptiv immunitet er kodet i DNA, involverer immuniseringsprocessen kopiering og indsættelse af fremmede genetiske elementer i CRISPR som nye spacere. Spacere udgør immunologisk hukommelse, som gemmer information om tidligere infektioner , og det er denne, der ligger til grund for responsen på den gentagne invasion af lignende genetiske elementer. De fleste af dataene om de molekylære mekanismer for erhvervelsen af ​​nye spacere blev opnået ved at studere CRISPR-systemet af type I Escherichia coli og type II Streptococcus thermophilus . Den korrekte orientering og indsættelse af en ny spacer sker med deltagelse af sekvensen umiddelbart over den første gentagelse; således tilføjes nye spacere til 5'-enden af ​​CRISPR-locuset. Integration af den nye spacer mellem ledersekvensen og den første gentagelse udføres af Cas1-Cas2-protospacer-komplekset. I nogle CRISPR-Cas-systemer er yderligere proteiner involveret i denne proces. Når en ny spacer indsættes, sker der en duplikering af gentagelsen, hvorved den korrekte struktur af locuset bevares, som bør begynde med en gentagelse [14] [24] .

Da spacere overføres fra forfædre til efterkommere under celledeling, i nærvær af lignende spacere, kan der etableres fylogenetiske relationer mellem stammer , der har fælles forfædres spacere, såvel som stammer, der har nye, nyligt erhvervede spacere [14] .

I type I og II systemer kan spacer-indsættelse kun forekomme fra de fremmede elementer, hvor en speciel PAM-sekvens ( protospacer adjacent motiv) støder   op til protospaceren [24] . Derudover skal bakterien skelne fremmed genetisk materiale fra sit eget for ikke at indsætte et fragment af sit eget kromosom som spacer og ikke målrette CRISPR-Cas-systemet til dets genom, hvilket ville være fatalt for cellen. E. coli type I CRISPR-Cas-systemet adskiller sit DNA ved tilstedeværelsen af ​​Chi-sites  — 8-nukleotidmotiver , der gentages i dets genom i gennemsnit hver 5. tusinde basepar [25] . Selvom mange spacere kan dannes ud fra det samme fremmede genetiske element, viser nogle motiver sig i et genetisk element at være mere at foretrække, når man skal vælge en fremtidig spacer. Sandsynligvis blev sådanne motiver fastsat som et resultat af naturlig udvælgelse forbundet med effektiviteten af ​​afstandsstykkerne; for eksempel giver nogle spacere anledning til crRNA'er, der målretter Cas-proteiner til delvist komplementære sekvenser [14] .

Når de konfronteres med den samme fag, vil forskellige celler indsætte lidt forskellige fragmenter af dens genom som en spacer, så store populationer , der har en lang række spacere mod den samme fag, tilbyder mere effektiv resistens: hvis fagen muterer , så en af ​​eksisterende spacere i befolkningen bliver ineffektive, andre vil stadig yde beskyttelse [26] .

Ekspression og dannelse af crRNA

Efter integration i CRISPR af dele af fremmede genetiske elementer, er det nødvendigt at transformere dem til en form, der er i stand til at målrette Cas-proteiner til målsekvenser for deres genkendelse og ødelæggelse. Denne form er guide-crRNA'et, som indeholder en unik sekvens, der er komplementær til et specifikt mål. Først transskriberes et antal CRISPR-gentagelser og spacere til et enkelt langt transkript, præ-crRNA, som derefter skæres i korte crRNA'er. De fleste gentagelser i CRISPR er palindromer , så deres tilsvarende præ-crRNA-regioner danner hårnåle . I mange tilfælde er det disse hårnåle, der genkendes af Cas-proteiner, der behandler præ-crRNA til crRNA [14] .

Typisk er CRISPR-transkription ledersekvensafhængig og forekommer kontinuerligt, men med en langsom hastighed. Imidlertid stiger hastigheden markant under stressende forhold, eller når cellen kolliderer med fager, hvilket giver den hurtig og effektiv beskyttelse. Promotorelementer blev ikke kun fundet i ledersekvensen, men også i gentagelser. Selvom et helt locus kan transskriberes på én gang, har det vist sig, at nogle spacere i et locus transskriberes hyppigere end andre, såsom de første par spacere efter ledersekvensen og den første gentagelse. Faktisk er det langt mere fordelagtigt for en celle at have et stærkere forsvar mod invasive elementer, som den har mødt i den seneste tid, end mod dem, den har mødt for længe siden [14] .

Interferens

På interferensstadiet binder crRNA'er til deres mål ved baseparring og dirigerer dermed Cas- endonukleaser til at skære og ødelægge målet. Dannelsen af ​​et kompleks af crRNA- og Cas-proteiner giver endonukleolytisk ødelæggelse af komplementære crRNA NA-sekvenser. Selvom mål primært er dobbeltstrenget DNA (dsDNA), kan nogle CRISPR-Cas-systemer nedbryde komplementære enkeltstrengede RNA'er (ssRNA'er). CRISPR-Cas-systemer, der genkender dsDNA, er krævende med hensyn til sekvenser, der støder op til protospaceren: Især i type I- og II-systemer genkendes kun mål, der indeholder PAM-motivet (kravet om tilstedeværelse af PAM kan tjene til at beskytte mod skæring cellegenomet af CRISPR-Cas-systemet). Systemer, der arbejder med ssRNA, har ikke sådanne krav. Efter det indledende endonukleolytiske angreb (at bryde målet) af Cas, kan yderligere ødelæggelse af målet forekomme under påvirkning af andre nukleaser [14] .

Forskellige CRISPR-Cas-systemer

Alle kendte CRISPR-Cas-systemer kan opdeles i to hovedklasser, 5 typer og 16 undertyper, baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af visse cas -gener , strukturen af ​​cas - operonen , aminosyresekvenserne af Cas-proteiner og de mekanismer, der sikre driften af ​​CRISPR-medieret immunitet [27] [28] .

Derudover er der CRISPR-Rx-systemet (CRISPR-CasRx), som retter sig mod RNA (i modsætning til andre CRISPR'er, især CRISPR-Cas9, som retter sig mod DNA). På grund af dette kan CRISPR-Rx undertrykke genekspression med en uændret genetisk kode [29] [30] .

De første klasses systemer er karakteriseret ved multiprotein effektorkomplekser (Cascade, Cmr, Csm). Denne klasse omfatter systemer af type I, III og IV. Type I-systemer er de mest almindelige CRISPR-Cas-systemer. Deres mål er dsDNA indeholdende PAM-motivet, og destruktion udføres af Cascade- effektor -multiproteinkomplekset forbundet med Cas3-proteinet. Type III-systemer er almindelige i archaea og er karakteriseret ved Csm- og Cmr-multiproteinkomplekser. De kan genkende både DNA og RNA, og DNA-genkendelse kræver ikke PAM. I systemer af denne type udføres destruktionen af ​​mål af Cas10-proteinet sammen med effektor-nukleaser, nemlig Cmr4 i subtype IIIA ( RNase , som er en del af Cmr-komplekset) og Csm3 i subtype IIIB (RNase, som er en del af Cmr-komplekset). af Csm-komplekset). Type IV-systemer er ret sjældne, deres fordeling og virkningsmekanisme er ikke godt forstået [27] .

Klasse II-systemer har et enkelt effektorprotein. Denne klasse omfatter type II og V. Type II-systemer bruges aktivt i genteknologi; de er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​Cas9- endonukleasen . I systemer af denne type er guide-RNA'et ikke ét crRNA, men en dupleks af crRNA og et yderligere RNA, tracrRNA. crRNA:tracrRNA-dupleksen dirigerer RuvC og HNH Cas9 nicase domænerne til at introducere stumpende brud i mål-DNA'et, som bør have en PAM nær 3'-enden[ afklare ] . Type V-systemer er sjældne og er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​Cpf1-nukleasen, som ledes af crRNA til mål-DNA'et. Denne RuvC -lignende nuklease laver et snit på et sted distalt for 3'-enden af ​​PAM. I modsætning til Cas9 skærer denne nuklease dsDNA med dannelsen af ​​klæbrige, snarere end stumpe, ender 5 nukleotider lange [31] .

Tabellen nedenfor viser signaturgenerne for de undersøgte CRISPR-Cas-systemer, såvel som funktionerne af de proteiner, de koder for. Tilstedeværelsen af ​​visse signaturgener tjener som et karakteristisk træk ved typer og undertyper af CRISPR-Cas-systemer.

Signaturgener af undertyper af CRISPR-Cas-systemer
Undertype signaturgener Funktioner af proteinprodukter [14] [27] [28] [32]
IA Cas8a2, Csa5 Cas8a2 er involveret i interferens (binder crRNA og target). Csa5 - lille underenhed af effektorkomplekset
IB Cas8b Deltager i interferens (genkender RAM)
IC Cas8c Deltager i interferens (genkender RAM)
ID Cas10d Deltager i interferens (binder crRNA og target og introducerer et brud i target)
IE Cse1, Cse2 Cse1 interagerer muligvis med Cas3 og rekrutterer det til effektorkomplekset [33] . Cse2 - lille underenhed af effektorkomplekset
HVIS Csy1, Csy2, Csy3, Cas6f Csy2 og i mindre grad Csy1 og Csy3 er involveret i dannelsen af ​​crRNA [34] . Cas6f er en metalafhængig endoribonuklease involveret i dannelsen af ​​crRNA
II-A Csn2 Involveret i erhvervelsen af ​​spacere, hvilket muligvis beskytter kromosomalt DNA mod at indføre dobbeltstrengsbrud
II-B Cas9 Den indeholder to endonukleasedomæner, der enkeltvis introducerer enkeltstrengsbrud og virker sammen - et dobbeltstrengsbrud. Deltager i behandlingen af ​​crRNA, dets akkumulering samt ødelæggelsen af ​​målet
II-C ukendt —
III-A cm2 Lille underenhed af effektorkomplekset
III-B cmr5 Lille underenhed af effektorkomplekset
IV Csf1 Deltager i interferens (genkender RAM)
V Cpf1 Deltager i interferens (indeholder nukleasedomæne)

Type I og III systemer

Som nævnt ovenfor anvender både type I- og type III-systemer multiproteineffektorkomplekser. De er også forenet ved brugen af ​​Cas6-proteinet til præ-crRNA-behandling (nogle gange erstattes det af en ortolog , Cas5). Disse og nogle andre ligheder mellem type I og III systemer taler til fordel for deres afstamning fra en fælles forfader [14] .

Jeg skriver

Type I-systemer er underopdelt i seks undertyper (IA, IB, IC, ID, IE, IF) baseret på aminosyresekvenserne af proteinerne i effektorkomplekset og den indbyrdes arrangement af deres gener ( synthenia ) [35] . IE-undertypesystemet af E. coli [14] er det mest undersøgte .

I type I-systemer inkluderer effektorkomplekset-Cascade-Cas6 som en integreret underenhed , så crRNA-behandling sker inden for effektorkomplekset, og modent crRNA forbliver forbundet med det. Komplekset søger derefter efter dets målsekvens; samtidig genkender den sandsynligvis først sin PAM og først derefter tjekker den protospacerens nøglepositioner for crRNA- komplementaritet . Da der ikke er nogen PAM i CRISPR-gentagelser, er genomet af en bakterie, der har et type I CRISPR-Cas-system, pålideligt beskyttet mod ødelæggelse af dette system. Når den er bundet til Cascade, danner protospaceren en R-løkke i mål-dsDNA'et , som kræver negativ supercoiling ; dette letter sandsynligvis DNA-afvikling uafhængigt af nukleotidtriphosphater (NTP'er). Cascade-protospacer-komplekset genkendes af Cas3-proteinet. Cas3 har et HD-nukleasedomæne såvel som et afviklings-translokerende domæne, der kræver NTP'er for dets drift. Cas3 kan afvikle DNA:DNA og DNA:RNA duplekser. HD-domænet er normalt placeret ved N-terminalen af ​​Cas3 [32] . HD-domænet introducerer et nick i målet nær PAM'en, hvorefter Cas3 løsner sig fra Cascade og bruger dets nukleosidtrifosfathydrolysedomæne til at bevæge sig længere langs DNA'et, hvilket introducerer yderligere nicks undervejs [14] .

Kaskadestrukturen (fri og DNA-bundet) af E. coli blev visualiseret ved næsten atomær opløsning . Målet genkendes af Watson-Crick-baseparring , selvom hvert sjette protospacer-nukleotid ikke er komplementært til det tilsvarende crRNA-nukleotid. I denne henseende svarer den generelle geometri af DNA-crRNA-komplekset ikke til den dobbelte helix : de gentagne semi-spiralformede drejninger af dupleksen afbrydes af uparrede baser , hvilket gør det muligt for DNA'et at bøje sig over crRNA'et uden omvikling omkring det. Kaskadebinding til målet og dets relaterede sekvens har forskellige kinetikker og strukturelle træk, hvilket gør det muligt for komplekset at skelne mellem målet og sekvenser tæt på det. I det første tilfælde følger interferens og ødelæggelse af målet, og i det andet, indsættelsen af ​​en ny spacer. En sådan rettet tilpasning kræver, i modsætning til den primære, "naive" tilpasning, arbejdet fra ikke kun Cas1- og Cas2-proteiner, men også Cas3 [14] .

Ud over 6 undertyper af type I-systemer (IA - IF) kendes en anden undertype, IU (U fra engelsk  uncharacterized  - uncharacterized, da mekanismen til at skære præ-crRNA og arkitekturen af ​​effektorkomplekset er ukendt for det). I modsætning til de fleste type I-systemer er HD-domænet af Cas3-proteinet i IU placeret ved C-terminalen [32] .

Type III

Type III-systemer er opdelt i to undertyper: III-A og III-B. De er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​Cas10-proteinet, den største underenhed af effektorkomplekset Csm (i tilfælde af subtype III-A) og Cmr (i tilfælde af subtype III-B). Derudover koder alle type III-systemer for ét Cas5-protein og som regel flere paraloge Cas7-proteiner [32] . Begge undertyper er kendetegnet ved brugen af ​​Cas6-ortologen til præ- crRNA -behandling, selvom processeringsenzymet ikke altid er en stabil komponent i det tilsvarende effektorkompleks (som i type I-systemer). I 2008 blev III-A-systemet af Staphylococcus epidermidis vist at arbejde med DNA-mål, og i 2009 blev III-B-systemet af Pyrococcus furiosus  fundet at arbejde med RNA. For vellykket målgenkendelse kræver system III-A og III-B ikke tilstedeværelsen af ​​et PAM-motiv [14] .

Yderligere undersøgelse af type III-systemer afslørede nye mysterier i substratspecificiteten af ​​subtype III-A og III-B. Det viste sig således, at III-A-systemet af S. epidermidis kun kan fungere med transskriberede protospacere. Derudover viste det sig, at Csm-komplekserne af S. thermophilus og Thermus thermophilus har latent RNA-nedbrydende aktivitet, og de introducerer brud i RNA for hver 6. nukleotid. Den samme aktivitet blev også vist for Cmr-komplekserne. System III-A af S. epidermidis ødelægger ikke kun syntetiserede transkripter, men skærer også mål-DNA'et på en transkriptionsafhængig måde på bekostning af specifikke Cas10-aminosyrerester, der ikke er forbundet med målgenkendelse. RNA- hydrolyse medieret af Csm- og Cmr-komplekserne katalyseres ikke af Cas10-proteinet, men af ​​henholdsvis Csm3- og Cmr4-underenhederne. Således kan III-A systemet nedbryde både DNA og RNA; det antages, at den velbeskrevne RNA-nedbrydende aktivitet af III-B-systemer er komplementeret af evnen til at nedbryde DNA [14] .

Da type III-systemer ikke kræver tilstedeværelsen af ​​PAM i mål, skal der i deres tilfælde være en anden mekanisme end type I-systemer for at skelne mellem selv- og fremmed dsDNA. I tilfælde af Csm-komplekset er crRNA ikke kun komplementært til CRISPR-spaceren, men også til den tilstødende gentagelse. Ved binding til målmolekylet vil crRNA således kun binde til protospaceren, og ved binding til celle-DNA vil det også binde til nabogentagelsen, på grundlag af hvilket system III kan skelne celle-DNA fra fremmed. Interessant nok skæres DNA i type III-systemer meget tæt på de steder, hvor de tilsvarende baser af crRNA og mål-DNA ikke er parret. Der vides praktisk talt intet om mekanismerne for anskaffelse af nye afstandsstykker i type III-systemer [14] .

Ud over de almindeligt anerkendte undertyper III-A og III-B blev det i 2015 foreslået også at skelne mellem undertyperne III-C og III-D, som forekommer i nogle arkæer. I type III-C systemer udviser Cas10 proteinet inaktivering af cyclase domænet; derudover adskiller dens aminosyresekvens sig væsentligt fra den for Cas10 systemerne III-A og III-B. I III-D-systemer mangler Cas10 et HD-domæne; derudover er der et unikt csx10 -gen, der ligner cas5 . Både III-C og III-D systemer mangler cas1 og cas2 generne [32] .

I februar 2016 fremkom oplysninger om, at i nogle bakterier med type III CRISPR-Cas-systemer (for eksempel marinebakterien Marinomonas mediterranea ), i stedet for det sædvanlige Cas1-protein, et kimært Cas1-RT-protein tværbundet med revers transkriptase -funktioner . På grund af tilstedeværelsen af ​​et sådant protein kan en bakterie integreres i dets genom-spacere dannet fra patogengenomer med RNA-genomer via omvendt transkription [36] .

Type III-systemer, især Cas10, har vist sig at producere cykliske oligoadenylat sekundære budbringere, der omdanner ATP til et cyklisk produkt, der allosterisk aktiverer Csm6, som derefter hjælper med at nedbryde viralt RNA [37] .

Type II-systemer

Type II CRISPR-Cas-systemer skiller sig ud på grund af deres usædvanlige genetiske grundlag og molekylære mekanismer. Især multiproteinkomplekserne, der behandler crRNA i type I- og III-systemer, erstattes i type II-systemer af et enkelt protein, Cas9, som er involveret i alle tre grundlæggende trin i dette system. Type II-systemer er således den enkleste type CRISPR-Cas-system [32] . Desuden er yderligere elementer, der er unikke for type II-systemer, involveret i crRNA- biogenese . Type II-systemer findes kun i bakterier, og blandt type I, II og III er systemerne de mindst almindelige. Det er dog type II-systemer, der har fundet anvendelse som et værktøj til redigering af genomer [14] .

Type II-systemer er opdelt i tre undertyper baseret på tilstedeværelsen og sekvenserne af associerede cas -gener : II-A, II-B og II-C. Ud over cas1 - og cas2-generne , som er fælles for alle type I-III-systemer, har type II-systemer et yderligere cas9 -gen , som koder for Cas9-endonukleasen. Cas9 er involveret i ny spacer-opsamling, crRNA-akkumulering og interferens. Derudover indeholder systemer II-A csn2 -genet , hvis proteinprodukt er involveret i erhvervelsen af ​​spacere. I II-B-systemer er dette gen erstattet af cas4 -genet , og II-C-systemer har hverken csn2 eller cas4 . Længden af ​​Cas9 varierer i forskellige undertyper, og system II-C er som regel karakteriseret ved de korteste ortologer [14] . Kernedelen af ​​Cas9, som består af nukleasedomænet og den argininrige klynge, der er karakteristisk for dette protein, er højst sandsynligt kodet af gener afledt af mobile genetiske elementer, der på ingen måde er forbundet med CRISPR. I betragtning af den betydelige lighed i aminosyresekvenser mellem Cas9 og dets homologer, som ikke er forbundet med CRISPR-Cas-systemer, kan Cas9 ikke betragtes i den fulde betydning af signaturproteinet i type II-systemer. Det kan dog betragtes som et kendetegn ved disse systemer [32] .

Biogenesen af ​​crRNA i type II-systemer har en række unikke egenskaber. Det kræver især behandling af RNase III og binding af specifikke trans -kodede CRISPR RNA'er (tracrRNA'er) til præ-crRNA . TracrRNA'et indeholder en region, der er komplementær til regionen af ​​crRNA, der blev transskriberet fra CRISPR-gentagelsen. Under crRNA-behandling binder tracrRNA til crRNA'er, der endnu ikke er blevet skåret ud i præ-crRNA'et, hvilket resulterer i dannelsen af ​​modne crRNA'er. Det resulterende modne crRNA-tracrRNA-Cas9-kompleks indeholder et kort crRNA, hvor 20-24 nukleotider er komplementære til 3'-enden af ​​spaceren, og 20-24 nukleotider er komplementære til 5'-enden af ​​gentagelsen. Det første trin i præ-crRNA-behandling sker i regioner, der er komplementære til CRISPR-gentagelser; som et resultat dannes 3'-enden af ​​crRNA. Den efterfølgende 5'-ende trunkering af ukendte nukleaser forekommer inden for sekvenser svarende til CRISPR spacere. Akkumulering af crRNA i celler kræver Cas9-proteinet, selvom det ikke vides, om dette skyldes Cas9s involvering i crRNA-behandling, stabilisering af crRNA efter bearbejdning af Cas9 eller begge dele [14] .

CrRNA-tracrRNA-Cas9-komplekset genkender mål-DNA'er, der er komplementære til crRNA og indeholder PAM. Som i type I-systemer forhindrer fraværet af PAM i CRISPR-loci cellulært DNA i at blive skåret. Først genkender Cas9 PAM, og derefter kontrolleres det tilstødende DNA for crRNA-komplementaritet. Skæring af mål-DNA'et udføres ved at indføre to enkeltstrengede brud med RuvC- og HNH-motiverne af Cas9-proteinet, hvilket resulterer i, at der dannes et dobbeltstrengsbrud med stumpe ender i enden af ​​protospaceren i R'et. -loop tættest på PAM, tre nukleotider før PAM [14] .

I system III-C (især i Neisseria meningitidis CRISPR-Cas-systemet ) er en alternativ mekanisme for crRNA-biogenese blevet beskrevet, som bruger promotorer placeret i CRISPR-gentagelser. Alternativ transkriptionsretning kan forekomme selv uden deltagelse af RNase III [14] .

Funktioner uden for immuniteten af ​​prokaryoter

På trods af det faktum, at funktionerne i CRISPR-Cas-systemer normalt er forbundet med den adaptive immunitet af prokaryoter , er der en masse beviser for disse systemers deltagelse i helt forskellige processer, der ikke er relateret til beskyttelse mod fremmede genetiske elementer (f. , i reguleringen af ​​gruppeadfærd , virulens , DNA-reparation og genomevolution ). Nogle kendte eksempler på CRISPR-Cas involvering i ikke-immune processer er kort listet nedenfor [38] .

CRISPR-funktioner, der ikke er forbundet med adaptiv immunitet [38]
Fungere Systemtype Mekanisme Involvering af cas gener CRISPR involvering Udsigt Eksperimentel bekræftelse
Genregulering III-B Komplementær mRNA- destruktion Ja Ja Pyrococcus furiosus Ikke
Gener, der regulerer
gruppeadfærd		 HVIS

IC		 Baseret på
delvis komplementaritet
Ukendt		 Ja

Ja		 Ja

Ukendt		 Pseudomonas aeruginosa

Myxococcus xanthus		 Ja

Ja
Virulensreguleringsgener
_		 II-C

II-B


II-B
CRISPR-type ukendt		 Cas9-afhængig
celleoverflademodifikation
Cas9-medieret
nedregulering af bakteriel lipoproteinproduktion
Ukendt Regulering af feoAB-
operonen ved delvis komplementaritet
 Ja

Ja

Ja
Nej		 Nej

Nej

Nej
Ja		 Campylobacter jejuni

Francisella novicida

Legionella pneumophila
Listeria monocytogenes 		Ja

Ja

Ja
Ja
Genom ombygning HVIS Fjernelse af områder af genomet
gennem selvmålretning		 Ja Ja Pectobacterium Ja
DNA reparation IE DNA reparation med
Cas1		 Ja Ikke Escherichia coli Ja
Konkurrence mellem
mobile genetiske elementer (MGE)		 HVIS Specifik målretning af
SHM-konkurrenter		 Ja Ja Fag ICP1
Vibrio cholerae		 Ja
Resten af ​​cellerne Ikke bestemt Cas1 og Cas2 fungerer på samme måde
som toksin-antitoksin-systemerne , hvilket
udløser dvale og efterfølgende celledød
under faginfektion .		 Ja Ikke Ikke bestemt Ikke

Et eksempel er CRISPR-Cas-systemet i den predatoriske delta-proteobacterium Myxococcus xanthus , som er allestedsnærværende i jorden . Dens livscyklus inkluderer stadierne af frugtlegemedannelse og spordannelse, hvor individuelle celler samles til aggregater og differentieres til myxosporer , og danner en frugtlegeme. Adskillelse, myxosporer bliver til individuelle bakterieceller, og denne proces er stramt reguleret af quorum sensing -signaler og intracellulære signalkaskader . CRISPR-Cas-systemet af denne bakterie tilhører IC-typen og inkluderer 7 Cas-gener og CRISPR-locuset, der indeholder 22 spacere. Ved mangel på næringsstoffer udløser systemet syntesen i celler af A-signalet, bestående af aminosyrer og peptider , hvilket aktiverer transkriptionen af ​​fruA-genet ( cas - operonen kan også aktivere dette gen gennem Cas8c-proteinet). Når celler kommer i kontakt med hinanden, danner de et C-signal kodet af csgA -genet , som også aktiverer fruA , som så fremmer ekspressionen af ​​cas -gener . Cas-generne er således en del af den positive feedback-loop sammen med fruA -genet og er involveret i dannelsen af ​​frugtlegemet og spordannelse af bakterien [38] .

CRISPR-Cas-systemer kan være involveret i reguleringen af ​​virulens i patogene bakterier. For eksempel har Francisella novicida et type II-system bestående af fire cas -gener og et omvendt orienteret CRISPR-locus indeholdende 13 spacere. Det regulerer negativt ekspressionen af ​​bakterielt lipoprotein (BLP), en overfladevirulensfaktor. Det er sidstnævnte, der genkendes af Toll-lignende receptorer 2 i værtens immunsystem , så BLP-nedregulering er nødvendig for vellykket infektion. Det antages, at komplekset af Cas9, lille crRNA (scaRNA) og tracrRNA binder til blp- transkriptet og ødelægger det ved en ukendt mekanisme. CRISPR-Cas-systemer er involveret i reguleringen af ​​virulens hos bakterier som Campylobacter jejuni , Neisseria meningitidis , Legionella pneumophila (i tilfælde af denne bakterie er kun cas2 ud af alle cas -gener involveret i reguleringen af ​​virulens ), Listeria monocytogenes ( se tabel) [38] .

I mange bakterier bruges CRISPR-Cas-systemer til at regulere deres egne gener, der ikke er relateret til virulens. Især i Pseudomonas aeruginosa er IF-type systemet involveret i reguleringen af ​​gener forbundet med biofilmdannelse . Derudover er der forslag om, at Cas1- og Cas2-proteinerne kan yde beskyttelse mod bakteriofager, der virker på samme måde som toksin-antitoksinsystemer, det vil sige forårsage hvile og efterfølgende død af inficerede celler. Der er bevis for involvering af CRISPR-Cas-systemer i DNA-reparation. Cas1, som er en del af E. coli IE-typen , kan således fysisk interagere med reparations- og rekombinationsenzymer . Deletion af cas1 -genet eller associerede CRISPR-loci resulterede i øget følsomhed over for DNA-skadelige midler og forstyrrelser i kromosomadskillelse under deling [38] .

CRISPR-Cas-systemer rettet mod det bakterielle kromosom kan spille en vigtig rolle i genomiske omlejringer i bakterier og give det genetiske grundlag for evolution  - på trods af at selvmålrettede Cas-proteiner i de fleste tilfælde fører til celledød. I bakterien Pectobacterium atrosepticum har crRNA'er rettet mod kromosomøer erhvervet gennem horisontal genoverførsel vist sig typisk at resultere i celledød, men store kromosomale deletioner er blevet observeret i nogle overlevende celler, herunder fuldstændig fjernelse af en målø omkring 100 basepar. I disse sjældne tilfælde øgede deletioner mutanternes generelle fitness [38] .

Interessant nok er CRISPR-Cas-systemer til stede ikke kun i prokaryoter, men også i bakteriofager og en række andre mobile genetiske elementer (MGE'er). Måske er denne omstændighed forbundet med spredningen af ​​CRISPR-Cas-systemer i bakterier og archaea ved horisontal genoverførsel. CRISPR-Cas-systemer af sådanne elementer kan målrettes mod andre FEM'er, hvilket giver mekanismer til konkurrence mellem FEM'er. MGE'er, der bærer CRISPR-Cas-systemer, kan konkurrere med bakteriel patogenicitetsøer , der fra genomet under faginfektion og overføres til andre bakterier i fagkapsider . Ved at bruge fag-capsider til deres egen transmission kan patogenicitetsøer fuldstændig blokere fagreproduktion. Et eksempel er CRISPR-Cas-systemet af ICP1-fagen Vibrio cholerae , som tilhører IF-typen og har 2 cas -gener og 9 spacere (det er tilsyneladende homologt med Yersinia pestis -systemet ). En af spacerne er komplementær til Vibrio cholerae pathogenicity island , således at fagen kan konkurrere med patogenicitetsøer om capsider. Derudover kan CRISPR-Cas ICP1-systemet erhverve nye spacere, som gør det muligt for fagen at udvikle sig sammen med værtsbakterien [38] [39] .

I 2016 fremkom oplysninger om, at store nuklear-cytoplasmatiske DNA-holdige vira har et beskyttende system, der ligner CRISPR og designet til at beskytte mod virofager (især Zamilon-virofagen i Mimivirus ). Dette forsvarssystem fik navnet MIMIVIRE [40] .

Modstand mod CRISPR

Det er blevet fastslået, at som reaktion på spredningen af ​​visse CRISPR-spacere i bakteriepopulationen (og følgelig spredningen af ​​resistens mod de tilsvarende bakteriofager), muterer bakteriofager intenst og mister endda de dele af genomet, der oftest tjener som mål. for CRISPR-Cas-systemer og integreres i bakteriegenomet som spacere [21] .

Nogle fager koder for specifikke proteiner (anti-CRISPR-proteiner, Acr), der interfererer med CRISPR-Cas-systemer og fremmer infektion. Analyse af Pseudomonas aeruginosa- fager gjorde det muligt at isolere flere varianter af Acr-proteiner. Indledningsvis blev Acr-proteiner beskrevet i stammer af P. aeruginosa , der bærer profager i deres kromosomer. Selvom de fleste af disse stammer havde et aktivt type IF CRISPR-Cas-system, forblev systemet i nogle stammer inaktivt selv i nærværelse af fag-målrettede spacere. Molekylær analyse af stammer med inaktive systemer afslørede en række små fag-kodede proteiner, der var ansvarlige for udviklingen af ​​den fag-responsive fænotype . Acr-proteiner kan undertrykke driften af ​​CRISPR-Cas-systemer på forskellige måder, især (i tilfælde af IF-type systemer) gennem binding til Cascade-komplekset og blokering af dets binding til mål-DNA'et eller gennem binding til Cas-proteiner, hvilket fører til tabet af deres nukleaseaktivitet [41] .

Acr-proteinet er kendt, hvilket forhindrer bindingen af ​​helicase -nukleasen Cas3 til komplekset af crRNA og andre Cas-proteiner, der allerede har bundet sig til dets mål-DNA. Da komplekset af Cas og crRNA forbundet med DNA ikke tillader transkriptionsapparatet at binde til DNA, gør dette Acr-protein komplekset af crRNA og Cas til en transkriptionel repressor. Fra oktober 2015 er dette det første kendte eksempel på regulering af aktiviteten af ​​CRISPR-Cas-systemet ved hjælp af en proteinfaktor [42] . Acr-proteiner kan udvise stærk specificitet for CRISPR-Cas-systemet; især proteiner, der blokerede P. aeruginosa IF-systemet, havde ingen effekt på P. aeruginosa IE- eller E. coli IF-systemet . Nogle fager med suppressorgener for P. aeruginosa IF-systemet kodede dog også for små suppressorproteiner, der undertrykker P. aeruginosa IE-systemet , men ikke E. coli IE [41] .

Fremkomsten af ​​beskyttende mekanismer mod CRISPR-interferens i fager anses for at være resultatet af en lang co-evolution af fager og deres værter [22] .

Evolutionær betydning

Ifølge E. V. Kunin kan driften af ​​CRISPR-Cas-systemer betragtes som en evolutionær proces, der opfylder Lamarcks evolutionære scenarie , nemlig følgende kriterier:

  • Genomiske ændringer i CRISPR loci (indsættelse af nye spacere) er forårsaget af påvirkning fra miljøet (mere præcist, fremmede genetiske elementer).
  • Ændringer er begrænset til specifikke genomiske loci.
  • Ændringer giver tilpasning til en specifik påvirkning (til et specifikt fremmed genetisk element) [43] [44] .

Dette syn på CRISPR er dog blevet kritiseret. Ifølge A. Wyss er overensstemmelsen mellem CRISPR-Cas og de Lamarckske kriterier kun overfladisk [43] .

CRISPR-Cas-systemer udviser nogle af egenskaberne ved darwinistisk evolution  - især forekomster i hele befolkningen af ​​tilfældig erhvervelse af spacere, efterfulgt af udvælgelse af overlevende kloner med den bedste egnethed [21] .

Identifikation

CRISPR-Cas-systemer er udbredt blandt bakterier og archaea [45] , og deres karakteristiske træk er vekslen mellem gentagne sekvenser og spacere. På grund af denne funktion er CRIPSR-loci ret nemme at finde i lange DNA-sekvenser, da med en stigning i antallet af gentagelser i et locus falder sandsynligheden for et falsk positivt fund. Blandt de programmer, der bruges til at søge efter CRISPR baseret på at finde gentagelser adskilt af huller i lange sekvenser, er CRT [46] , PILER-CR [47] og CRISPRfinder [48] .

Det er sværere at finde CRISPR i metagenomiske data : ved hjælp af standardalgoritmer kan CRISPR-loci ikke indsamles på grund af tilstedeværelsen af ​​mange gentagelser, såvel som stammespecifikke variationer. Polymerase kædereaktion kan bruges til at øge antallet af CRISPR loci og derefter analysere indholdet af spacerne, men denne metode giver kun information om et specifikt CRISPR locus og er kun anvendelig for organismer, hvis genomer er tilgængelige i databaser (så egnede primere kan oprettes ) [49] [ 50] [51] [52] [53] .

Ansøgninger i genteknologi

Forud for opdagelsen af ​​CRISPR-Cas-systemernes funktioner og virkningsmekanismer som metoder til locus-specifik genomredigering, blev metoder baseret på brugen af ​​nukleaser indeholdende zinkfingre ( engelsk.  Zinc-finger nucleases, ZFNs ), som såvel som TAL-endonukleaser , var mest intensivt udviklet ( Transcription activator-like effector nuclease, TALEN ) .  Disse metoder er ret besværlige, ikke særlig effektive og dyre: For hvert nyt mållocus kræves udvikling, ekspression og verifikation af et helt nyt par polypeptider , hvilket væsentligt begrænser omfanget af disse metoder [14] [54] .

Men i 2012-2013 dukkede fundamentalt nye metoder til at manipulere genetisk materiale baseret på brugen af ​​CRISPR-Cas-systemer op inden for genteknologi. Disse metoder er velegnede til målrettet redigering af genomerne af både prokaryoter og eukaryoter (selvom sidstnævnte ikke har deres egne CRISPR-Cas-systemer, viste det sig dog, at elementer af CRISPR-Cas-systemet af bakteriel oprindelse kunstigt indført i en eukaryot celle er i stand til at fungere i et nyt miljø). Samtidig bruger moderne CRISPR-Cas-teknologier Cas9-proteinet, som er det samme for alle målloci, og virkningsspecificiteten bestemmes ikke af proteinet, men af ​​crRNA. Metoder baseret på ZFN og TALEN bruges stadig i dag og foretrækkes endda til klinisk forskning, men enkelheden, effektiviteten og omkostningseffektiviteten af ​​metoder, der anvender CRISPR-Cas9-systemet, har gjort dem til det første valg blandt metoder til rettet genomredigering og -binding. med DNA [14] [54] .

Metoder baseret på CRISPR-Cas9 er tæt på disse systemers naturlige virkningsmekanismer: RNA bruges til at genkende en målsekvens, der er placeret i nærheden af ​​PAM, og Cas9-nukleasen rettet af den producerer et dobbeltstrengsbrud på målstedet. Når man redigerer det eukaryote genom, er resultatet af arbejdet med CRISPR-Cas9 imidlertid ikke ødelæggelsen af ​​hele DNA-molekylet, men reparationen af ​​det dobbeltstrengede brud produceret af Cas9. Reparation kan udføres både ved ikke -homolog endesamling ( NHEJ ) og ved homolog rekombination . Ikke-homolog end-joining reparation resulterer ofte i små insertioner eller deletioner , der kan forstyrre læserammen for proteinkodende gener, hvilket resulterer i tab af målgenfunktion. Ved at forårsage mange dobbeltstrengsbrud kan store deletioner og endda inversioner opnås [14] .  

I modsætning hertil involverer reparation ved homolog rekombination at erstatte den slettede sekvens med en ny sekvens, der er komplementær til den reparationsskabelon, som forskeren selv skaber. Homolog rekombination kan således bruges til at fjerne uønskede mutationer , skabe nye alleler, indsætte eller fusionere funktionelle domæner. Derudover konverterer mutationel inaktivering af RuvC- eller HNH Cas9-domænerne dette protein til en RNA-styret nickase, der producerer enkeltstrengsbrud snarere end dobbeltstrengsbrud. Inaktivering af begge domæner konverterer Cas9 til et RNA-styret DNA-bindende protein , der ikke skærer målet. I dette tilfælde kan et domæne med andre funktioner knyttes til det DNA-bindende domæne, hvilket igen kan forårsage forskellige ændringer i mållocuset: aktivering eller undertrykkelse af transkription, kromatinmodifikation , øget løkkedannelse og mange andre. Derudover tjener den inaktiverede form af Cas9 (dCas9, "død" Cas9) som grundlag for nye forskningsteknikker, såsom billeddannelse gennem fluorescens eller skabelse af mærker til efterfølgende fysisk isolering af loci [14] .

På trods af effektiviteten af ​​brugen af ​​CRISPR-Cas-systemer pålægger oprindelsen af ​​Cas9 nogle begrænsninger for valget af DNA-mål: for eksempel, når Streptococcus pyogenes Cas9 bruges , er det kun sekvenser efterfulgt af PAM, nemlig 5'-NGG (hvor N er ethvert nukleotid). Behovet for PAM pålægger imidlertid ikke alvorlige restriktioner for brugen af ​​CRISPR-Cas9-systemer: I det menneskelige genom forekommer sådanne sekvenser næsten hver 8-12 nukleotider. Inden det bruges i genetiske konstruktioner, bør Cas9-genet foreløbigt optimeres til de kodoner , der anvendes i overensstemmelse med den organisme, hvis genom formodes at være modificeret [55] : S. pyogenes cas9 -genet har et lavt GC-indhold (35 %), og for organismer, hvis genomer har en høj GC-sammensætning, kan Cas9-kodonoptimering være nødvendig [56] .

I øjeblikket bruges CRISPR-Cas II-typen til genomredigering, og SpyCas9-proteinet (Cas9-nuklease fra bakterien S. pyogenes ) bruges oftest; dog udvikles alternative Cas9-proteiner, der vil øge omfanget af CRISPR-Cas. For eksempel kan trunkerede former af Cas9 genkende forskellige PAM-sekvenser. Selvom genomredigering kan udføres effektivt med crRNA og tracrRNA transskriberet separat, har udviklingen af ​​single guide RNA (sgRNA) teknologi forenklet dette system. I dette tilfælde erstattes firekomponentsystemet RNase III:crRNA:tracrRNA:Cas9 af tokomponentsystemet sgRNA:Cas9. I øjeblikket bruges sgRNA meget hyppigere end separat crRNA og tracrRNA. Endelig arbejdes der på at forbedre specificiteten af ​​Cas9 og reducere bivirkninger [14] [54] . I begyndelsen af ​​2016 blev resultaterne af amerikanske forskeres arbejde offentliggjort, som formåede at reducere antallet af fejl til næsten nul [17] .

Levering af sgRNA og Cas9 til målceller tilvejebringes ved forskellige metoder. For eksempel kan plasmider, der koder for sgRNA og Cas9, anvendes til dette, og celler kan transficeres (eller transformeres , i tilfælde af prokaryoter) med dem. Sådanne plasmider kan leveres ind i celler ved elektroporation [57] . I nogle tilfælde viser det sig at være mere bekvemt at bruge plasmider, der koder for Cas9 og levere RNA i form af PCR-genererede amplikoner [55] .

I 2015 blev en ny metode foreslået til levering af sgRNA og Cas9 ind i cellen inde i specielle nanocoils. En sådan nanocoil består af én tæt sammenflettet DNA-kæde, hvor en af ​​sektionerne er komplementære til det overførte sgRNA; således er sgRNA:Cas9-komplekset fikseret inde i spolen. Desuden er nanospolen i stand til at samle sig selv. Mange forskellige sgRNA:Cas9-komplekser kan knyttes til en nanocoil. Ved kontakt med cellen går nanospolen ind i endosomet , dog sikrer en speciel polymer , der dækker nanospolen, ødelæggelsen af ​​endosomet og tillader sgRNA:Cas9 at nå kernen [58] .

Metodeændringer

Til rettet redigering af genomet af eukaryote celler anvendes ikke kun Cas9 fra S. pyogenes , men også Cas9 fra Streptococcus thermophilus , Neisseria meningitidis [59] [60] samt Cas9 fra Staphylococcus aureus (SaCas9), som er 25 % mindre end SpyCas9, hvilket gør det muligt at pakke den ind i en adeno-associeret virus (AAV) til levering af vektoren ind i cellerne i en levende organisme som et terapeutisk middel [61] .

En form for Cas9 (dCas9), der ikke er i stand til at skære DNA, har fundet bred anvendelse. Anvendelsen af ​​dCas9 tværbundet til et fluorescerende protein ligger til grund for den nye CASFISH ( CRISPR-Cas9-medieret fluorescens in situ hybridisering ) metode , som tillader fluorescerende mærkning af målloci [62] . Ved hjælp af denne dCas9 kan man spore længden af ​​telomerer , samt observere dynamikken af ​​visse loci under cellecyklussen [63] .

dCas9-formen kan bruges til at undertrykke transkription af et målgen (når det binder til sidstnævnte i promotorregionen , regulatoriske regioner eller begyndelsen af ​​den kodende region); desuden kan et repressorpeptid ligeres til dCas9 for at undertrykke transkription . Tværtimod kan dCas9 tværbundet med transkriptionsaktiverende proteiner (transkriptionsfaktorer og effektorer [64] ) aktivere målgentransskription. Derudover kan kunstige restriktionsendonukleaser knyttes til dCas9 , samt enzymer, der modificerer epigenomet ( DNA-methyltransferaser , histonacetyltransferaser ) og derved regulerer aktiviteten af ​​målgener [65] [66] [67] . I 2016 blev embryonale stamceller fra mus omprogrammeret til to ekstra-embryonale linjer ( trofoblast- og ekstra-embryonale endodermceller ) ved at aktivere Cdx2 og Gata6 generne ved hjælp af CRISPR-medierede aktivatorer [68] .

Yderligere kan dCas9 tværbindes med FokI endonukleasemonomeren , der fungerer som dimerer . Fokl-dimerer kan introducere dobbeltstrengsbrud i målsekvenser. To sgRNA'er bruges til at dirigere dCas9 tværbundet til FokI-monomeren, hvilket signifikant øger systemets nøjagtighed. Når to monomerer, som hver er styret af sit eget sgRNA, er placeret i en afstand på omkring 30 basepar fra hinanden, dimeriserer FokI og introducerer et dobbeltstrengsbrud [69] .

For at rydde loci forbundet med sgRNA kan dCas9, der bærer visse epitoper , anvendes . Faktisk er denne metode en speciel variant af kromatin-immunpræcipitation [70] .

Der er fundet analoger af Cas9, der kan spalte RNA-molekyler i stedet for DNA. Brugen af ​​disse proteiner vil gøre det muligt at redigere eller selektivt undertrykke aktiviteten af ​​miRNA'er [71] [72] . Francisella novicida Cas9 ( FnCas9) kan omprogrammeres til at målrette mod hepatitis C-virus- RNA-genomet , hvilket resulterer i undertrykkelse af virusets livscyklus i eukaryote celler. Baseret på dette system er det muligt at skabe hundredvis af midler mod forskellige vira [73] .

I efteråret 2015 blev der foreslået en ny metode, et alternativ til CRISPR-Cas9 - CRISPR-Cpf1 . Cpf1 er en endonuklease, der er et effektorprotein af type V CRISPR-Cas-systemer. Det er mindre end Cas9 og kræver kun crRNA for at fungere, ikke tracrRNA. I denne forbindelse er det muligt, at CRISPR-Cpf1-metoden i nogle tilfælde vil være mere bekvem end CRISPR-Cas9-metoden [74] .

I 2015 blev der også foreslået en ny selvklonende CRISPR- metode .  I dette tilfælde indføres et plasmid indeholdende et selvklonende palindromisk sgRNA i cellerne, såvel som et kort dobbeltstrenget DNA, der indeholder sekvensen, der koder for det ønskede sgRNA. Når plasmidet transskriberes, binder det resulterende sgRNA kompleksbundet med Cas9 komplementært til sekvensen i plasmidet, der koder for sgRNA'et. Cas9 introducerer et dobbeltstrengsbrud, som repareres ved homolog rekombination under anvendelse af det indførte dobbeltstrengede DNA som skabelon; som et resultat heraf indeholder plasmidet igen sekvensen, der koder for det ønskede sgRNA. I modsætning til standard CRISPR-metoden, som kræver en lang og besværlig produktion af specielle plasmider for hvert nyt mållocus, kan den selvklonende CRISPR-metode reducere eksperimenttiden fra seks dage til tre timer og reducere omkostningerne med seks gange [75] .

I øjeblikket udvikles kemiske metoder intensivt til at kontrollere driften af ​​CRISPR-Cas: dosis, virkningsvarighed, specificitet og andre parametre [76] [77] .

Bioteknologiske og medicinske implikationer

I øjeblikket anvendes CRISPR-Cas-metoder med succes til genteknologi af forskellige organismer: både flercellede og encellede ( gær ) eukaryoter og prokaryoter [56] [78] . Brugen af ​​CRISPR-Cas i mikroorganismer gør det muligt at modificere deres metaboliske veje , hvilket åbner muligheder for udvikling af nye bioteknologiske strategier [79] . Derudover er skabelsen af ​​stammer af teknologisk vigtige bakterier resistente over for forskellige fager på grund af CRISPR-Cas af stor betydning for bioteknologien [21] .

Metoder til redigering af genomer ved hjælp af CRISPR-Cas er blevet udviklet til modelorganismer (for eksempel mus [80] , frugtfluen Drosophila melanogaster [81] , nematoden Caenorhabditis elegans [82] , zebrafisk [83] og andre). Sådanne metoder er blevet brugt til at redigere svampens genom [84] , især den trådformede svamp Aspergillus oryzae , som bruges i industrien til fermentering af soja [85] og champignon [86] . Af stor betydning er arbejdet med redigering ved hjælp af CRISPR-Cas cellekulturer af pattedyr , herunder mennesker [87] . I 2017 blev genomet af menneskelige embryoner redigeret ved denne metode [88] .

Der arbejdes på at redigere genomer ved hjælp af CRISPR-Cas i kvæg [89] , svin [90] og andre dyr af stor økonomisk betydning, såsom bier [91] . I november 2015 blev resultaterne af et forsøg offentliggjort, hvor 62 endogene retrovira blev inaktiveret i grisegenomet ved hjælp af CRISPR-Cas-teknologi . Forfatterne af undersøgelsen håber, at på grund af disse resultater vil xenotransplantation af organer fra en gris til et menneske blive mulig i fremtiden [92] . Endelig kan CRISPR-Cas mutagenese bruges til at kontrollere invasive arter (f.eks. den invasive flue Drosophila suzukii)[93].

CRISPR-Cas-teknologien er med succes blevet anvendt i gensplejsning af planter [94] , herunder prydplanter (for eksempel petunia [95] ) og mange vigtige afgrøder: ris [96] , sojabønner [97] , hvede , sorghum , majs , tomat [98] og appelsin [99] . Muligheden for at introducere CRISPR-Cas-systemer i dyrkede planter for at skabe antiviral immunitet er ved at blive undersøgt [100] [101] . CRISPR-Cpf1-systemet [102] kan også bruges til plantegenteknologi .

Metoder baseret på CRISPR-Cas kan også bruges i medicin [103] til behandling af en lang række sygdomme: virale (herunder HIV-infektion [ 104] [105] og herpesvirusinfektioner [106] ), allergier og immunologiske sygdomme ( herunder autoimmune [107] ) [108] , onkologiske [109] [110] [111] , hjerte- kar-sygdomme [112] og endda gigt [113] samt arvelige lidelser [114]  såsom Downs syndrom , seglcelleanæmi [ 115] , retinitis pigmentosa [116] og β-thalassæmi [117] . I 2013 udkom en publikation [118] , der rapporterede, at forskere var i stand til at redigere et unormalt gen i stamcellerne hos en patient med cystisk fibrose . Det er muligt, at CRISPR-Cas-systemet kan hjælpe i behandlingen af ​​Duchenne-muskulær dystrofi (DMD): det har vist sig, at CRISPR-Cas kan genoprette dystrofingenet i DMD -cellekultur [119] . Det antages, at sådanne celler med et "repareret" genom kan transplanteres ind i patientens krop, hvor de kan erstatte syge celler og udføre de nødvendige funktioner [54] . I oktober 2016 blev et voksent humant genom redigeret i Kina ved hjælp af CRISPR/Cas: en patient med lungekræft blev injiceret med T-lymfocytter modificeret med CRISPR-Cas [120] . Forskere mener, at redigering af malariamyggens genom ved hjælp af CRISPR-Cas kan hjælpe med at bekæmpe malaria [121] [122] . Muligheden for at redigere genomet af en anden vigtig patogen protozo, Toxoplasma gondii , ved hjælp af CRISPR-Cas blev vist [123] .

CRISPR-Cas-systemet kan bruges til at opnå inflammationsresistent væv fra humane pluripotente celler [124] .

CRISPR-Cas-metoder har vist sig at være effektive til at manipulere PRPN-locuset , som koder for et prionprotein, der er ansvarligt for en række neurodegenerative sygdomme hos mennesker og andre pattedyr [125] .

Cellelinjer modificeret med CRISPR-Cas kan bruges som modeller for forskellige menneskelige sygdomme. For eksempel blev celler med mutationer svarende til to nyresygdomme ( polycystisk nyresygdom og fokal segmental glomerulosklerose ) opnået fra en human pluripotent cellelinje ved anvendelse af CRISPR-Cas . Senere blev miniorganer svarende til nyrerne hos en person med disse sygdomme dyrket fra disse celler [126] . Den samme metode er blevet brugt til at modellere langt QT-syndrom på kardiomyocytter . Sådanne modeller kan hjælpe i studiet af sygdomme og udviklingen af ​​nye lægemidler [127] .

DNA-redigering for at modvirke HIV-infektion

I november 2018 blev det kendt, at et hold kinesiske videnskabsmænd ledet af He Jiankui formåede at skabe verdens første mennesker med kunstigt modificerede gener ( CCR5 deaktiveret ) - to tvillingepiger , der formodes at være immune over for den humane immundefektvirus [128] [129] . Dette eksperiment er blevet kritiseret for at overtræde adskillige videnskabelige og etiske regler [130] .

Offentlig reaktion

I 2015 annoncerede mindst fire laboratorier i USA, laboratorier i Kina og Storbritannien samt det amerikanske bioteknologiske firma Ovascience deres planer om at modificere genomerne af menneskelige embryoner ved hjælp af CRISPR-Cas [131] . I lyset af disse begivenheder talte mange videnskabsmænd for indførelsen af ​​et internationalt moratorium for brugen af ​​CRISPR-Cas-teknologi i menneskelige embryoner og kønsceller , herunder til medicinske formål [132] [133] . Disse videnskabsmænd støttede yderligere grundlæggende CRISPR-forskning, men efter deres mening er CRISPR-Cas-teknologien endnu ikke tilstrækkeligt udviklet til at garantere fraværet af uønskede mutationer og arvelige defekter hos patienter, når de anvendes i klinisk praksis [134] .

I april 2015 offentliggjorde en gruppe kinesiske videnskabsmænd en artikel i tidsskriftet Protein & Cell , der rapporterede resultaterne af deres forsøg på at ændre DNA fra ikke-levedygtige menneskelige embryoner ved hjælp af CRISPR-Cas. De forsøgte at rette den mutation, der førte til beta-thalassæmi [15] . Ifølge hovedforskeren afviste Nature and Science papiret på grund af etiske overvejelser [135] . Resultaterne af eksperimentet var ikke særlig optimistiske på grund af de talrige mutationer, der fandt sted uden for målgenet. Forfatterne af undersøgelsen udtalte, at CRISPR-Cas-teknologien endnu ikke er klar til brug i reproduktionsmedicin [15] .

I december 2015 blev det internationale topmøde om redigering af menneskelige gener afholdt i Washington under ledelse af David Baltimore . Under dette topmøde diskuterede repræsentanter for de nationale videnskabsakademier i USA, Storbritannien og Kina de etiske spørgsmål om genmodifikation i menneskelige kønsceller. Under mødet blev det besluttet at fortsætte yderligere grundlæggende og klinisk forskning på passende juridiske og etiske grunde. Særlig opmærksomhed er blevet henledt på forskellen mellem den kliniske brug af somatiske celler , hvor spredningen af ​​producerede mutationer er begrænset til et individ, og kimcelleceller , hvis genomiske abnormiteter kan nedarves af den næste generation. Sidstnævnte kan have uforudsete og vidtrækkende konsekvenser for menneskets evolution  , både genetiske og kulturelle [136] .  

I februar 2016 fik en gruppe britiske videnskabsmænd tilladelse til at genetisk modificere menneskelige embryoner ved hjælp af CRISPR-Cas og relaterede metoder [137] [138] .

I 2012 og 2013, i begyndelsen af ​​gennembruddet med CRISPR inden for genteknologi, blev CRISPR-Cas-metoden nomineret til prisen for Årets Gennembrud af tv-programmet Science Magazine . I 2015 vandt han denne pris [139] .

Se også

Noter

  1. ↑ Biomolekyle. CRISPR-systemer: immunisering af prokaryoter .
  2. ↑ Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evolution and classification of the CRISPR- Cas-systemer  // Naturanmeldelser. mikrobiologi. - 2011. - Bd. 9, nr. 6. - S. 467-477. - doi : 10.1038/nrmicro2577 . — PMID 21552286 .
  3. ↑ Panchin, Alexander. Homo sapiens: arbejde på fejltagelser // Popular Mechanics  : journal. - 2016. - Maj. - S. 38-41.
  4. ↑ Engelsk, Max A. Programmerbare CRISPR-responsive smarte materialer: [ eng. ]  / Max A. English, Luis R. Soenksen, Raphael V. Gayet … [ et al. ] // Science : J. - 2019. - Vol. 365, nr. 6455 (23. august). - S. 780-785. - doi : 10.1126/science.aaw5122 . — PMID 31439791 .
  5. ↑ Ishino Y., Shinagawa H., Makino K., Amemura M., Nakata A.  Nukleotidsekvens af iap -genet, ansvarlig for alkalisk phosphatase-isozymkonvertering i Escherichia coli og identifikation af genproduktet  // Journal of Bacteriology. - 1987. - Bd. 169, nr. 12. - P. 5429-5433. — PMID 3316184 .
  6. ↑ 1 2 3 Lander E. S. The Heroes of CRISPR  // Cell. - 2016. - Bd. 164, nr. 1-2. - S. 18-28. - doi : 10.1016/j.cell.2015.12.041 . — PMID 26771483 .
  7. ↑ Jansen R., Embden J. D., Gaastra W., Schouls L. M.  Identifikation af gener, der er forbundet med DNA-gentagelser i prokaryoter  // Molecular Microbiology. - 2002. - Bd. 43, nr. 6. - P. 1565-1575. — PMID 11952905 .
  8. ↑ Mojica F. J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E.  Intervenerende sekvenser af regelmæssigt fordelte prokaryote gentagelser stammer fra fremmede genetiske elementer  // Journal of Molecular Evolution. - 2005. - Bd. 60, nr. 2. - S. 174-182. - doi : 10.1007/s00239-004-0046-3 . — PMID 15791728 .
  9. ↑ Pourcel C., Salvignol G., Vergnaud G.  CRISPR-elementer i Yersinia pestis opnår nye gentagelser ved præferenceoptagelse af bakteriofag-DNA og giver yderligere værktøjer til evolutionære undersøgelser  // Mikrobiologi. - 2005. - Bd. 151, pkt. 3. - S. 653-663. - doi : 10.1099/mic.0.27437-0 . — PMID 15758212 .
  10. ↑ Bolotin A., Quinquis B., Sorokin A., Ehrlich S. D.  Clustered regular interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) har spacere af ekstrakromosomal oprindelse  // Mikrobiologi. - 2005. - Bd. 151, pkt. 8. - P. 2551-2561. - doi : 10.1099/mic.0.28048-0 . — PMID 16079334 .
  11. ↑ Makarova K. S., Grishin N. V., Shabalina S. A., Wolf Y. I., Koonin E. V.  Et formodet RNA-interferens-baseret immunsystem i prokaryoter: beregningsmæssig analyse af det forudsagte enzymmaskineri, funktionelle analogier med eukaryot RNAi og hypotetiske virkningsmekanismer  // Biologiske direkte virkningsmekanismer . - 2006. - Bd. 1, nr. 1. - S. 7. - doi : 10.1186/1745-6150-1-7 . — PMID 16545108 .
  12. ↑ Barrangou R., Fremaux C., Deveau H., Richards M., Boyaval P., Moineau S., Romero D. A., Horvath P.  CRISPR giver erhvervet resistens mod virus i prokaryoter  // Videnskab. - 2007. - Bd. 315, nr. 5819. - P. 1709-1712. - doi : 10.1126/science.1138140 . — PMID 17379808 .
  13. ↑ DuPont-videnskabsmand Philippe Horvath tildelt Massry-prisen 2015 .
  14. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 . _  _  _ Genterapi. - 2015. - Bd. 26, nr. 7. - S. 413-424. - doi : 10.1089/hum.2015.091 . — PMID 26078042 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Liang Puping, Xu Yanwen, Zhang Xiya, Ding Chenhui, Huang Rui, Zhang Zhen, Lv Jie, Xie Xiaowei, Chen Yuxi, Li Yujing, Sun Ying, Bai Yaofu, Songyang Zhou, Ma Wenbin, Zhou Canquan, Huang Junjiu.  CRISPR/Cas9-medieret genredigering i humane tripronukleære zygoter  // Protein & Cell. - 2015. - Bd. 6, nr. 5. - S. 363-372. - doi : 10.1007/s13238-015-0153-5 . — PMID 25894090 .
  16. ↑ Reardon Sara. Genredigeringstopmøde støtter noget forskning i menneskelige embryoner  // Nature. - 2015. - 3. december. — ISSN 1476-4687 . - doi : 10.1038/nature.2015.18947 .
  17. ↑ 1 2 Slaymaker I. M., Gao Linyi, Zetsche B., Scott D. A., Yan W. X., Zhang Feng.  Rationelt konstruerede Cas9 nukleaser med forbedret specificitet  // Videnskab. - 2016. - Bd. 351, nr. 6268.-S. 84-88. - doi : 10.1126/science.aad5227 . — PMID 26628643 .
  18. ↑ Severinov, K. Genredigering for Dummies  : Hvordan Jennifer Doudna og Emmanuelle Charpentiers opdagelse ændrede biologien og vandt dem en Nobelpris: [ ark. 10. oktober 2020 ] // Forbes. - 2020. - 7. oktober.
  19. ↑ 1 2 Naimark, 2021 .
  20. ↑ Kapitonov et al., 2016 .
  21. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Barrangou R.  CRISPR-Cas-systemernes roller i adaptiv immunitet og videre  // Current Opinion in Immunology. - 2015. - Bd. 32. - S. 36-41. - doi : 10.1016/j.coi.2014.12.008 . — PMID 25574773 .
  22. ↑ 1 2 Nemudry A. A., Valetdinova K. R., Medvedev S. P., Zakian S. M.  TALEN og CRISPR/Cas genomredigeringssystemer er opdagelsesværktøjer  // Acta Naturae . - 2014. - Nr. 3 (22) . - S. 20-42 .
  23. ↑ Jiang Wenyan, Maniv I., Arain F., Wang Yaying, Levin B.R., Marraffini L. A.  Håndtering af den evolutionære ulempe ved CRISPR-immunitet: Bakterier og gavnlige plasmider  // PLoS-genetik. - 2013. - Bd. 9, nr. 9. - P. e1003844. - doi : 10.1371/journal.pgen.1003844 . — PMID 24086164 .
  24. ↑ 1 2 Samson J. E., Magadan A. H., Moineau S. . CRISPR-Cas-immunsystemet og genetiske overførsler: At nå en ligevægt // Plasmider: Biologi og virkning i bioteknologi og opdagelse / Red. af M. E. Tolmasky, J. C. Alonso. - Washington: ASM Press, 2015. - 718 s. - ISBN 978-1-5558-1897-5 .  - S. 209-218. - doi : 10.1128/microbiolspec.PLAS-0034-2014 . — PMID 26104549 .
  25. ↑ Marraffini L. A.  CRISPR-Cas immunitet i prokaryoter  // Nature . - 2015. - Bd. 526, nr. 7571. - S. 55-61. - doi : 10.1038/nature15386 . — PMID 26432244 .
  26. ^ van Houte S. , Ekroth AK , Broniewski JM , Chabas H. , Ben Ashby , Bondy-Denomy J. , Gandon S. , Boots M. , Paterson S. , Buckling A. , Westra ER De mangfoldighedsgenererende fordele ved en prokaryot adaptivt immunsystem.  (engelsk)  // Nature. - 2016. - doi : 10.1038/nature17436 . — PMID 27074511 .
  27. ↑ 1 2 3 Barrangou R.  Diversity of CRISPR-Cas immunsystemer og molekylære maskiner  // Genome Biology. - 2015. - Bd. 16. - S. 247-257. - doi : 10.1186/s13059-015-0816-9 . — PMID 26549499 .
  28. ↑ 1 2 Makarova K. S., Koonin E. V.  Annotering og klassificering af CRISPR-Cas-systemer  // Methods in Molecular Biology. - 2015. - Bd. 1311. - S. 47-75. - doi : 10.1007/978-1-4939-2687-9_4 . — PMID 25981466 .
  29. ↑ Minina E. Hvordan man forvandler glia til neuroner i en levende organisme  : [ arch. 18. maj 2020 ] / Elizaveta Minina // Neuronovity. - 2020. - 15. maj.
  30. ↑ Zhou, H. Glia-til-neuronkonvertering af CRISPR-CasRx lindrer symptomer på neurologiske sygdomme hos mus: [ eng. ]  / H. Zhou, J. Su, X. Hu … [ et al. ] // Celle : log. - 2020. - Bd. 181, nr. 3 (30. april). — S. 590–603.e16. - doi : 10.1016/j.cell.2020.03.024 . — PMID 32272060 .
  31. ↑ Zetsche B. et al. Cpf1 er en enkelt RNA-styret endonuklease af et klasse 2 CRISPR-Cas  system  // Celle . - Cell Press , 2015. - Vol. 163 , nr. 3 . - s. 759-771 .
  32. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Makarova K. S., Wolf Y. I., Alkhnbashi O. S., Costa F., Shah S. A., Saunders S. J., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Haft D. H., Horvath P., Mojeau F. J., Terns R. M., Terns M. P., White M. F., Yakunin A. F., Garrett R. A., van der Oost J., Backofen R., Koonin E. V.  An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems  // Nature reviews. mikrobiologi. - 2015. - Bd. 13, nr. 11. - P. 722-736. - doi : 10.1038/nrmicro3569 . — PMID 26411297 .
  33. ↑ UniProtKB - Q53VY1 (CSE1_THET8) .
  34. ↑ Cady K. C., O'Toole G. A.  Ikke-identitetsmedieret CRISPR-bakteriofag-interaktion medieret via Csy- og Cas3-proteinerne  // Journal of Bacteriology. - 2011. - Bd. 193, nr. 14. - P. 3433-3445. - doi : 10.1128/JB.01411-10 . — PMID 21398535 .
  35. ↑ Cass S. D., Haas K. A., Stoll B., Alkhnbashi O. S., Sharma K., Urlaub H., Backofen R., Marchfelder A., ​​​​Bolt E. L.  Rollen af ​​Cas8 i type I CRISPR-interferens  // Bioscience Reports. - 2015. - Bd. 35, nr. 3. - P. e00197. - doi : 10.1042/BSR20150043 . — PMID 26182359 .
  36. ↑ Silas S., Mohr G., Sidote D. J., Markham L. M., Sanchez-Amat A., Bhaya D., Lambowitz A. M., Fire A. Z.  Direkte CRISPR-spacer-opsamling fra RNA med et naturligt revers transkriptase-Cas1-fusionsprotein  // Science . - 2016. - Bd. 351, nr. 6276. - S. 4234. - doi : 10.1126/science.aad4234 . — PMID 26917774 .
  37. ↑ Niewoehner O. et al., & Jinek M/ (2017). Type III CRISPR-Cas-systemer producerer cykliske oligoadenylat sekundære budbringere . Nature doi : 10.1038/nature23467
  38. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Westra E. R., Buckling A., Fineran P. C.  CRISPR-Cas systems: beyond adaptive immunity  // Nature Reviews. mikrobiologi. - 2014. - Bd. 12, nr. 5. - S. 317-326. - doi : 10.1038/nrmicro3241 . — PMID 24704746 .
  39. ↑ Seed K. D., Lazinski D. W., Calderwood S. B., Camilli A.  Abacteriophage koder for sin egen CRISPR/Cas-adaptive respons for at undgå værtens medfødte immunitet  // Nature . - 2013. - Bd. 494, nr. 7438.-P. 489-491. - doi : 10.1038/nature11927 . — PMID 23446421 .
  40. ↑ Levasseur A. , Bekliz M. , Chabrière E. , Pontarotti P. , La Scola B. , Raoult D.  MIMIVIRE er et forsvarssystem i mimivirus, der giver resistens mod virofager  // Nature. - 2016. - Bd. 531, nr. 7593. - S. 249-252. - doi : 10.1038/nature17146 . — PMID 26934229 .
  41. ↑ 1 2 van der Oost J., Brouns S. J.  CRISPR sabotage  // Genome Biology. - 2015. - Bd. 16. - S. 248. - doi : 10.1186/s13059-015-0820-0 . — PMID 26553202 .
  42. ↑ Bondy-Denomy J., Garcia B., Strum S., Du Mingjian, Rollins M. F., Hidalgo-Reyes Y., Wiedenheft B., Maxwell K.L., Davidson A. R.  Flere mekanismer for CRISPR-Cas-hæmning af anti-CRISPR-proteiner  // natur . - 2015. - Bd. 526, nr. 7571. - S. 136-139. - doi : 10.1038/nature15254 . — PMID 26416740 .
  43. ↑ 1 2 Weiss A.  Lamarckian Illusions  // Trends in Ecology & Evolution. - 2015. - Bd. 30, nr. 10. - S. 566-568. - doi : 10.1016/j.tree.2015.08.003 . — PMID 26411613 .
  44. ↑ Kunin E. V. . sagslogik. Om den biologiske evolutions natur og oprindelse. - M. : Tsentrpoligraf, 2014. - 527 s. - ISBN 978-5-227-04982-7 .  - S. 311.
  45. ↑ Chylinski K., Makarova K. S., Charpentier E., Koonin E. V.  Klassificering og udvikling af type II CRISPR-Cas-systemer  // Nucleic Acids Research. - 2014. - Bd. 42, nr. 10. - P. 6091-6105. - doi : 10.1093/nar/gku241 . — PMID 24728998 .
  46. ↑ Bland C., Ramsey T. L., Sabree F., Lowe M., Brown K., Kyrpides N. C., Hugenholtz P.  CRISPR-genkendelsesværktøj (CRT): et værktøj til automatisk detektion af klynger med regelmæssigt mellemrum mellem palindromiske gentagelser  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Bd. 8. - S. 209. - doi : 10.1186/1471-2105-8-209 . — PMID 17577412 .
  47. ↑ Edgar R. C.  PILER-CR: hurtig og præcis identifikation af CRISPR-gentagelser  // BMC Bioinformatics. - 2007. - Bd. 8. - S. 18. - doi : 10.1186/1471-2105-8-18 . — PMID 17239253 .
  48. ↑ Grissa I., Vergnaud G., Pourcel C.  CRISPRFinder: et webværktøj til at identificere klynger med regelmæssigt mellemrum, korte palindromiske gentagelser  // Nucleic Acids Research. - 2007. - Bd. 35. - S. 52-57. - doi : 10.1093/nar/gkm360 . — PMID 17537822 .
  49. ↑ Horvath P., Romero D. A., Coûté-Monvoisin A. C., Richards M., Deveau H., Moineau S., Boyaval P., Fremaux C., Barrangou R.  Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus  // Tidsskrift for Bakteriologi. - 2008. - Bd. 190, nr. 4. - P. 1401-1412. - doi : 10.1128/JB.01415-07 . — PMID 18065539 .
  50. ↑ Pride D. T., Sun C. L., Salzman J., Rao N., Loomer P., Armitage G. C., Banfield J. F., Relman D. A.  Analyse af streptokok-CRISPR'er fra menneskeligt spyt afslører betydelig sekvensdiversitet inden for og mellem forsøgspersoner over tid  // Genomforskning. - 2011. - Bd. 21, nr. 1. - S. 126-136. - doi : 10.1101/gr.111732.110 . — PMID 21149389 .
  51. ↑ Pride D. T., Salzman J., Relman D. A.  Sammenligninger af klynger med regelmæssigt indbyrdes mellemrum korte palindromiske gentagelser og viromer i menneskespyt afslører bakterielle tilpasninger til spytvirus  // Environmental Microbiology. - 2012. - Bd. 14, nr. 9. - P. 2564-2576. - doi : 10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x . — PMID 22583485 .
  52. ↑ Held N. L., Herrera A., Whitaker R. J.  Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus  // Environmental Microbiology. - 2013. - Bd. 15, nr. 11. - P. 3065-3076. - doi : 10.1111/1462-2920.12146 . — PMID 23701169 .
  53. ↑ Held N. L., Herrera A., Cadillo-Quiroz H., Whitaker R. J.  CRISPR-associeret diversitet inden for en population af Sulfolobus islandicus  // PLoS One . - 2010. - Bd. 5, nr. 9. - P. e12988. - doi : 10.1371/journal.pone.0012988 . — PMID 20927396 .
  54. ↑ 1 2 3 4 Vlasov V. V. , Medvedev S. P., Zakian S. M.  "Redaktører" af genomer. Fra zinkfingre til CRISPR  // Videnskab første hånd. - 2014. - Nr. 2 (56) . - S. 44-53 .
  55. ↑ 1 2 Ran F. A., Hsu P. D., Wright J., Agarwala V., Scott D. A., Zhang F.  Genomteknik ved hjælp af CRISPR-Cas9-systemet  // Nature Protocols. - 2013. - Bd. 8, nr. 11. - P. 2281-2308. - doi : 10.1038/nprot.2013.143 . — PMID 24157548 .
  56. ↑ 1 2 Peters J. M., Silvis M. R., Zhao Dehua, Hawkins J. S., Gross C. A., Qi L. S.  Bacterial CRISPR: achievements and prospects  // Current Opinion in Microbiology. - 2015. - Bd. 27. - S. 121-126. - doi : 10.1016/j.mib.2015.08.007 . — PMID 26363124 .
  57. ↑ Shinmyo Y., Tanaka S., Tsunoda S., Hosomichi K., Tajima A., Kawasaki H.  CRISPR/Cas9-medieret gen-knockout i musehjernen ved hjælp af in utero elektroporation  // Scientific Reports. - 2016. - Bd. 6. - P. 20611. - doi : 10.1038/srep20611 . — PMID 26857612 .
  58. ↑ Sun W. , Ji W. , Hall JM , Hu Q. , Wang C. , Beisel CL , Gu Z. Selvsamlede DNA nanoclews til effektiv levering af CRISPR-Cas9 til genomredigering.  (engelsk)  // Angewandte Chemie (International udg. på engelsk). - 2015. - Bd. 54, nr. 41 . - S. 12029-12033. - doi : 10.1002/anie.201506030 . — PMID 26310292 .
  59. ↑ Hou Zhonggang, Zhang Yan, Propson N. E., Howden S. E., Chu Li-Fang, Sontheimer E. J., Thomson J. A.  Effektiv genomteknik i humane pluripotente stamceller ved hjælp af Cas9 fra Neisseria meningitidis  // Proc. Nat. Acad. sci. USA . - 2013. - Bd. 110, nr. 39. - P. 15644-15649. - doi : 10.1073/pnas.1313587110 . — PMID 23940360 .
  60. ↑ Fonfara I., Le Rhun A., Chylinski K., Makarova K. S., Lécrivain A. L., Bzdrenga J., Koonin E. V., Charpentier E.  Phylogeny of Cas9 bestemmer funktionel udskiftelighed af dual-RNA og Cas9 blandt ortologe type II CRISPR-Cas-systemer  // Nukleinsyreforskning. - 2014. - Bd. 42, nr. 4. - P. 2577-2590. - doi : 10.1093/nar/gkt1074 . — PMID 24270795 .
  61. ↑ Ran F. A., Cong Le, Yan W. X., Scott D. A., Gootenberg J. S., Kriz A. J., Zetsche B., Shalem O., Wu Xuebing, Makarova K. S., Koonin E. V., Sharp P. A., Zhang Feng.  In vivo genomredigering ved hjælp af Staphylococcus aureus Cas9  // Nature . - 2015. - Bd. 520, nr. 7546. - S. 186-191. - doi : 10.1038/nature14299 . — PMID 25830891 .
  62. ↑ Deng Wulan, Shi Xinghua, Tjian R., Lionnet T., Singer R. H.  CASFISH: CRISPR/Cas9-medieret in situ-mærkning af genomiske loci i fikserede celler  // Proc. Nat. Acad. sci. USA . - 2015. - Bd. 112, nr. 38. - P. 11870-11875. - doi : 10.1073/pnas.1515692112 . — PMID 26324940 .
  63. ↑ Chen Baohui, Gilbert L. A., Cimini B. A., Schnitzbauer J., Zhang Wei, Li Gene-Wei., Park J., Blackburn E. H., Weissman J. S., Qi L. S., Huang Bo.  Dynamisk billeddannelse af genomiske loci i levende humane celler med et optimeret CRISPR/Cas-system  // Cell. - 2013. - Bd. 155, nr. 7. - P. 1479-1491. - doi : 10.1016/j.cell.2013.12.001 . — PMID 24360272 .
  64. ↑ Kearns N. A., Genga R. M. J., Enuameh M. S., Garber M., Wolfe S. A., Maehr R.  Cas9 effektor-medieret regulering af transkription og differentiering i humane pluripotente stamceller  // Udvikling (Cambridge, England). - 2014. - Bd. 141, nr. 1. - S. 219-223. - doi : 10.1242/dev.103341 . — PMID 24346702 .
  65. ↑ Gilbert L. A., Larson M. H., Morsut L., Liu Zairan, Brar G. A., Torres S. E., Stern-Ginossar N., Brandman O., Whitehead E. H., Doudna J. A., Lim W. A., Weissman J. S., Qi L. S.  modular guidet regulering af transkription i eukaryoter  // Celle. - 2013. - Bd. 154, nr. 2. - S. 442-451. - doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . — PMID 23849981 .
  66. ↑ Perez-Pinera P., Kocak D. D., Vockley C. M., Adler A. F., Kabadi A. M., Polstein L. R., Thakore P. I., Glass K. A., Ousterout D. G., Leong K. W., Guilak F., Crawford G. E., Reddys  -RNA-guide aktivering af CRISPR-Cas9-baserede transkriptionsfaktorer  // Nature Methods. - 2013. - Bd. 10, nr. 10. - S. 973-976. - doi : 10.1038/nmeth.2600 . — PMID 23892895 .
  67. ↑ Hilton I. B., D'Ippolito A. M., Vockley C. M., Thakore P. I., Crawford G. E., Reddy T. E., Gersbach C. A.  Epigenome-redigering af en CRISPR-Cas9-baseret acetyltransferase aktiverer gener fra promotorer og forstærkere  // Nature Biotechnology. - 2015. - Bd. 33, nr. 5. - S. 510-517. - doi : 10.1038/nbt.3199 . — PMID 25849900 .
  68. ↑ Wei Shu, Zou Qingjian, Lai Sisi, Zhang Quanjun, Li Li, Yan Quanmei, Zhou Xiaoqing, Zhong Huilin, Lai Liangxue. Konvertering af embryonale stamceller til ekstraembryonale afstamninger ved hjælp af CRISPR-medierede aktivatorer  // Scientific Reports. - 2016. - Bd. 6. - P. 19648. - doi : 10.1038/srep19648 . — PMID 26782778 .
  69. ↑ Tsai S. Q., Wyvekens N., Khayter C., Foden J. A., Thapar V., Reyon D., Goodwin M. J., Aryee M. J., Joung J. K.  Dimeric CRISPR RNA-guidede FokI-nukleaser til meget specifik genomredigering  // Nature Biotechnology. - 2014. - Bd. 32, nr. 6. - P. 569-576. - doi : 10.1038/nbt.2908 . — PMID 24770325 .
  70. ↑ Fujita T., Fujii H.  Effektiv isolering af specifikke genomiske regioner og identifikation af associerede proteiner ved manipuleret DNA-bindende molekyle-medieret kromatin-immunpræcipitation (enChIP) ved hjælp af CRISPR  // Biokemisk og biofysisk forskningskommunikation. - 2013. - Bd. 439, nr. 1. - S. 132-136. - doi : 10.1016/j.bbrc.2013.08.013 . — PMID 23942116 .
  71. ↑ O'Connell M. R., Oakes B. L., Sternberg S. H., East-Seletsky A., Kaplan M., Doudna J. A.  Programmerbar RNA-genkendelse og spaltning af CRISPR/Cas9  // Nature . - 2014. - Bd. 516, nr. 7530. - S. 263-266. - doi : 10.1038/nature13769 . — PMID 25274302 .
  72. ↑ Hale C. R., Zhao Peng, Olson S., Duff M. O., Graveley B. R., Wells L., Terns R. M., Terns M. P.  RNA-guidet RNA-spaltning af et CRISPR RNA-Cas-proteinkompleks  // Cell. - 2009. - Bd. 139, nr. 5. - P. 945-956. - doi : 10.1016/j.cell.2009.07.040 . — PMID 19945378 .
  73. ↑ Price A. A., Sampson T. R., Ratner H. K., Grakoui A., Weiss D. S.  Cas9-medieret målretning af viralt RNA i eukaryote celler  // Proc. Nat. Acad. sci. USA . - 2015. - Bd. 112, nr. 19. - P. 6164-6169. - doi : 10.1073/pnas.1422340112 . — PMID 25918406 .
  74. ↑ Fagerlund R. D., Staals R. H. J., Fineran P. C.  The Cpf1 CRISPR-Cas protein expands genome-editing tools  // Genome Biology. - 2015. - Bd. 16. - S. 251. - doi : 10.1186/s13059-015-0824-9 . — PMID 26578176 .
  75. ↑ Arbab M., Srinivasan S., Hashimoto T., Geijsen N., Sherwood R. I.  Kloningsfri CRISPR  // Stamcellerapporter. - 2015. - Bd. 5, nr. 5. - P. 908-917. - doi : 10.1016/j.stemcr.2015.09.022 . — PMID 26527385 .
  76. ↑ Maji B. , Moore CL , Zetsche B. , Volz SE , Zhang F. , Shoulders MD , Choudhary A. Multidimensionel kemisk kontrol af CRISPR-Cas9.  (engelsk)  // Naturens kemiske biologi. - 2016. - doi : 10.1038/nchembio.2224 . — PMID 27820801 .
  77. ↑ Hilton IB , Gersbach CA Genteknologi: Kemisk kontrol til CRISPR-redigering.  (engelsk)  // Naturens kemiske biologi. - 2016. - doi : 10.1038/nchembio.2243 . — PMID 27820804 .
  78. ↑ Wilkinson R., Wiedenheft B.  A CRISPR method for genome engineering  // F1000 Prime Reports. - 2014. - Bd. 6. - P. 3. - doi : 10.12703/P6-3 . — PMID 24592315 .
  79. ↑ Jakočiūnas T., Jensen M. K., Keasling J. D.  CRISPR/Cas9 fremmer konstruktion af mikrobielle cellefabrikker  // Metabolic Engineering. - 2016. - Bd. 34. - S. 44-59. - doi : 10.1016/j.ymben.2015.12.003 . — PMID 26707540 .
  80. ↑ Williams A., Henao-Mejia J., Flavell R. A.  Redigering af musegenomet ved hjælp af CRISPR-Cas9-systemet  // Cold Spring Harbor-protokoller. - 2016. - Bd. 2016, nr. 2. - P. 087536. - doi : 10.1101/pdb.top087536 . — PMID 26832693 .
  81. ↑ Ghosh S., Tibbit C., Liu Ji-Long.  Effektiv knockdown af Drosophila lange ikke-kodende RNA'er ved CRISPR-interferens  // Nucleic Acids Research. - 2016. - doi : 10.1093/nar/gkw063 . — PMID 26850642 .
  82. ↑ Schwartz M. L., Jorgensen E. M.  SapTrap, a Toolkit for High-Throughput CRISPR/Cas9 Gene Modification in Caenorhabditis elegans  // Genetics. - 2016. - Bd. 202, nr. 4. - P. 1277-1288. - doi : 10.1534/genetics.115.184275 . — PMID 26837755 .
  83. ↑ Li M. , Zhao L. , Page-McCaw PS , Chen W. Zebrafish Genome Engineering Using the CRISPR-Cas9 System.  (eng.)  // Tendenser i genetik : TIG. - 2016. - doi : 10.1016/j.tig.2016.10.005 . — PMID 27836208 .
  84. ↑ Krappmann S. CRISPR-Cas9, det nye barn på blokken af ​​svampemolekylærbiologi.  (engelsk)  // Medicinsk mykologi. - 2016. - doi : 10.1093/mmy/myw097 . — PMID 27811178 .
  85. ↑ Katayama T., Tanaka Y., Okabe T., Nakamura H., Fujii W., Kitamoto K., Maruyama J. I.  Udvikling af en genomredigeringsteknik ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet i den industrielle trådsvamp Aspergillus oryzae  // Biotechnology Letters . - 2015. - Bd. 38, nr. 4. - S. 637-642. - doi : 10.1007/s10529-015-2015-x . — PMID 26687199 .
  86. ↑ Steven Hall redigerer svampen // In the World of Science . - 2016. - Nr. 12. - S. 85-93.
  87. ↑ Gaj T. , Schaffer DV Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR-Cas Systems for Genome Engineering in Mammalian Cells.  (eng.)  // Cold Spring Harbor-protokoller. - 2016. - Bd. 2016, nr. 11 . - P. 086868. - doi : 10.1101/pdb.prot086868 . — PMID 27803249 .
  88. ↑ Kirill Stasevich. Fra genteknologi til kærlighed: hvad biologer gjorde i 2017  // Videnskab og liv . - 2018. - Nr. 1 . - S. 2-7 .
  89. ↑ Wang Zhongde.  Genomteknik i kvæg: nyere teknologiske fremskridt  // Kromosomforskning: et internationalt tidsskrift om de molekylære, supramolekylære og evolutionære aspekter af kromosombiologi. - 2015. - Bd. 23, nr. 1. - S. 17-29. - doi : 10.1007/s10577-014-9452-6 . — PMID 25596824 .
  90. ↑ Niemann H., Petersen B.  Produktionen af ​​multitransgene grise: opdatering og perspektiver for xenotransplantation  // Transgenisk forskning. - 2016. - S. 1-14. - doi : 10.1007/s11248-016-9934-8 . — PMID 26820415 .
  91. ↑ Kohno H. , Suenami S. , Takeuchi H. , Sasaki T. , Kubo T. Produktion af knockout-mutanter af CRISPR/Cas9 i den europæiske honningbi, Apis mellifera L.  //  Zoologisk videnskab. - 2016. - Bd. 33, nr. 5 . - S. 505-512. - doi : 10.2108/zs160043 . — PMID 27715425 .
  92. ↑ Yang Luhan, Güell M., Niu Dong, George H., Lesha E., Grishin D., Aach J., Shrock E., Xu Weihong, Poci J., Cortazio R., Wilkinson R. A., Fishman J. A., Church G. .Genomomfattende  inaktivering af endogene svineretrovira (PERV'er)  // Videnskab . - 2015. - Bd. 350, nr. 6264. - S. 1101-1104. - doi : 10.1126/science.aad1191 . — PMID 26456528 .
  93. ↑ Li Fang, Scott M. J.  CRISPR/Cas9-medieret mutagenese af de hvide og kønsdødelige loci i den invasive skadedyr, Drosophila suzukii  // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2016. - Bd. 469, nr. 4. - P. 911-916. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.12.081 . — PMID 26721433 .
  94. ↑ Schiml S., Puchta H.  Revolutionerende plantebiologi: flere måder til genomteknologi ved CRISPR/Cas  // Plantemetoder. - 2016. - Bd. 12. - S. 8. - doi : 10.1186/s13007-016-0103-0 . — PMID 26823677 .
  95. ↑ Zhang Bin, Yang Xia, Yang Chunping, Li Mingyang, Guo Yulong.  Udnyttelse af CRISPR/Cas9-systemet til målrettet genommutagenese i Petunia  // Scientific Reports. - 2016. - Bd. 6. - S. 20315. - doi : 10.1038/srep20315 . — PMID 26837606 .
  96. ↑ Ikeda T., Tanaka W., Mikami M., Endo M., Hirano H.-Y.  Generering af kunstige hængende bladmutanter ved CRISPR-Cas9-teknologi i ris  // Genes & Genetic Systems. - 2016. - Bd. 90, nr. 4. - S. 231-235. - doi : 10.1266/ggs.15-00030 . — PMID 26617267 .
  97. ↑ Du Hongyang, Zeng Xuanrui, Zhao Meng, Cui Xiaopei, Wang Qing, Yang Hui, Cheng Hao, Yu Deyue.  Effektiv målrettet mutagenese i sojabønner af TALENs og CRISPR/Cas9  // Journal of Biotechnology. - 2016. - Bd. 217. - S. 90-97. - doi : 10.1016/j.jbiotec.2015.11.005 . — PMID 26603121 .
  98. ↑ Ito Y., Nishizawa-Yokoi A., Endo M., Mikami M., Toki S.  CRISPR/Cas9-medieret mutagenese af RIN - locuset, der begrænser modning af tomatfrugter  // Biokemisk og biofysisk forskningskommunikation. - 2015. - Bd. 467, nr. 1. - S. 76-82. - doi : 10.1016/j.bbrc.2015.09.117 . — PMID 26408904 .
  99. ↑ Belhaj K., Chaparro-Garcia A., Kamoun S., Patron N. J., Nekrasov V.  Redigering af plantegenomer med CRISPR/Cas9  // Current Opinion in Biotechnology. - 2015. - Bd. 32. - S. 76-84. - doi : 10.1016/j.copbio.2014.11.007 . — PMID 25437637 .
  100. ↑ Ali Z., Abulfaraj A., Idris A., Ali S., Tashkandi M., Mahfouz M. M.  CRISPR/Cas9-medieret viral interferens i planter  // Genome Biology. - 2015. - Bd. 16. - S. 238. - doi : 10.1186/s13059-015-0799-6 . — PMID 26556628 .
  101. ↑ Zaidi SS , Tashkandi M. , Mansoor S. , Mahfouz MM Engineering Plant Immunity: Using CRISPR/Cas9 to Generation Virus Resistance.  (engelsk)  // Frontiers in plant science. - 2016. - Bd. 7. - S. 1673. - doi : 10.3389/fpls.2016.01673 . — PMID 27877187 .
  102. ↑ Xu R. , Qin R. , Li H. , Li D. , Li L. , Wei P. , Yang J. Generering af målrettet mutant ris ved hjælp af et CRISPR-Cpf1-system.  (engelsk)  // Plantebioteknologisk tidsskrift. - 2016. - doi : 10.1111/pbi.12669 . — PMID 27875019 .
  103. ↑ Watters KE , Kirkpatrick J. , Palmer MJ , Koblentz GD CRISPR-revolutionen og dens potentielle indvirkning på global sundhedssikkerhed.  (engelsk)  // Patogener og global sundhed. - 2021. - 16. februar. - S. 1-13 . - doi : 10.1080/20477724.2021.1880202 . — PMID 33590814 .
  104. ↑ Han Yinglun, Li Qingwei.  Anvendelsesfremskridt for CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologi til behandling af HIV-1-infektion  // Yi Chuan. - 2016. - Bd. 38, nr. 1. - S. 9-16. - doi : 10.16288/j.yczz.15-284 . — PMID 26787519 .
  105. ↑ Harper KN Ny forskning om brug af CRISPR/Cas9 til behandling af HIV.  (engelsk)  // AIDS (London, England). - 2016. - doi : 10.1097/QAD.0000000000001294 . — PMID 27755113 .
  106. ↑ van Diemen FR , Lebbink RJ CRISPR/Cas9, et kraftfuldt værktøj til at målrette humane herpesvirus.  (engelsk)  // Cellulær mikrobiologi. - 2016. - doi : 10.1111/cmi.12694 . — PMID 27860066 .
  107. ↑ Borges TJ , Murakami N. , Riella LV Nuværende status for alloimmunitet.  (engelsk)  // Aktuel mening i nefrologi og hypertension. - 2016. - Bd. 25, nr. 6 . - S. 556-562. - doi : 10.1097/MNH.00000000000000267 . — PMID 27584931 .
  108. ↑ Goodman MA , Moradi Manesh D. , Malik P. , Rothenberg ME CRISPR/Cas9 i allergiske og immunologiske sygdomme.  (engelsk)  // Ekspertgennemgang af klinisk immunologi. - 2016. - S. 1-5. - doi : 10.1080/1744666X.2017.1241711 . — PMID 27687572 .
  109. ↑ Chen Sidi, Sanjana N. E., Zheng Kaijie, Shalem O., Lee Kyungheon, Shi Xi, Scott D. A., Song Jun, Pan J. Q., Weissleder R., Lee Hakho, Zhang Feng, Sharp P. A.  Genome-wide CRISPR-skærm i en musemodel af tumorvækst og metastaser  // Celle. - 2015. - Bd. 160, nr. 6. - P. 1246-1260. - doi : 10.1016/j.cell.2015.02.038 . — PMID 25748654 .
  110. ↑ Liu Tang, Shen J.K., Li Zhihong, Choy E., Hornicek F.J., Duan Zhenfeng.  Udvikling og potentielle anvendelser af CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi i sarkom  // Cancer Letters. - 2016. - Bd. 373, nr. 1. - S. 109-118. - doi : 10.1016/j.canlet.2016.01.030 . — PMID 26806808 .
  111. ↑ Wang Dayong, Ma Ning, Hui Yang, Gao Xu.  Anvendelsen af ​​CRISPR/Cas9 genomredigeringsteknologi i kræftforskning  // Yi Chuan. - 2016. - Bd. 38, nr. 1. - S. 1-8. - doi : 10.16288/j.yczz.15-252 . — PMID 26787518 .
  112. ↑ Li Y. , Song YH , Liu B. , Yu XY Den potentielle anvendelse og udfordring af et kraftfuldt CRISPR/Cas9-system i kardiovaskulær forskning.  (engelsk)  // International journal of cardiology. - 2016. - doi : 10.1016/j.ijcard.2016.11.177 . — PMID 27847153 .
  113. ↑ Duroux-Richard I. , Giovannangeli C. , Apparailly F. CRISPR-Cas9: A revolution in genome editing in rheumatic diseases.  (engelsk)  // Led, knogle, rygsøjle: revue du rhumatisme. - 2016. - doi : 10.1016/j.jbspin.2016.09.012 . — PMID 27825565 .
  114. ↑ Wojtal D., Kemaladewi D. U., Malam Z., Abdullah S., Wong T. W. Y., Hyatt E., Baghestani Z., Pereira S., Stavropoulos J., Mouly V., Mamchaoui K., Muntoni F., Voit T. , Gonorazky H. D., Dowling J. J., Wilson M. D., Mendoza-Londono R., Ivakine E. A., Cohn R. D. Spell Checking Nature: Versatility of CRISPR/Cas9 for Developing Treatments for Inherited Disorders  // American Journal of Human Genetics. - 2016. - Bd. 98, nr. 1. - S. 90-101. - doi : 10.1016/j.ajhg.2015.11.012 . — PMID 26686765 .
  115. ↑ Yin Hao, Xue Wen, Chen Sidi, Bogorad R. L., Benedetti E., Grompe M., Koteliansky V., Sharp P. A., Jacks T., Anderson D. G.  Genomredigering med Cas9 i voksne mus korrigerer en sygdomsmutation og fænotype  // Nature bioteknologi. - 2014. - Bd. 32, nr. 6. - S. 551-553. - doi : 10.1038/nbt.2884 . — PMID 24681508 .
  116. ↑ Bassuk A. G., Zheng A., Li Yao, Tsang S. H., Mahajan V. B.  Precision Medicine: Genetic Repair of Retinitis Pigmentosa in Patient-derived Stem Cells  // Scientific Reports. - 2016. - Bd. 6. - P. 19969. - doi : 10.1038/srep19969 . — PMID 26814166 .
  117. ↑ Yang Y. , Zhang X. , Yi L. , Hou Z. , Chen J. , Kou X. , Zhao Y. , Wang H. , Sun XF , Jiang C. , Wang Y. , Gao S. Naiv Induced Pluripotent Stamceller genereret fra β-thalassæmi fibroblaster tillader effektiv genkorrektion med CRISPR/Cas9.  (engelsk)  // Stamceller translationel medicin. - 2016. - Bd. 5, nr. 1 . - S. 8-19. - doi : 10.5966/sctm.2015-0157 . — PMID 26676643 .
  118. ↑ Schwank G., Koo Bon-Kyoung, Sasselli V., Dekkers J. F., Heo I., Demircan T., Sasaki N., Boymans S., Cuppen E., van der Ent C. K., Nieuwenhuis E. E. S., Beekman J. M., Clevers, H.  Funktionel reparation af CFTR ved CRISPR/Cas9 i intestinale stamcelleorganoider fra patienter med cystisk fibrose  // Celle stamcelle. - 2013. - Bd. 13, nr. 6. - S. 653-658. - doi : 10.1016/j.stem.2013.11.002 . — PMID 24315439 .
  119. ↑ Maggio I. , Liu J. , Janssen JM , Chen X. , Gonçalves MA . Adenovirale vektorer, der koder for CRISPR/Cas9-multiplekser, redder dystrofinsyntese i ikke-selekterede populationer af DMD-muskelceller.  (engelsk)  // Videnskabelige rapporter. - 2016. - Bd. 6. - P. 37051. - doi : 10.1038/srep37051 . — PMID 27845387 .
  120. ↑ Cyranoski David. CRISPR-genredigering testet i en person for første gang  // Nature. - 2016. - 15. november ( bd. 539 , nr. 7630 ). - S. 479-479 . — ISSN 0028-0836 . - doi : 10.1038/nature.2016.20988 .
  121. ↑ McLean K. J., Jacobs-Lorena M.  Genetic Control of Malaria Mosquitoes  // Trends in Parasitology. - 2016. - Bd. 32, nr. 3. - S. 174-176. - doi : 10.1016/j.pt.2016.01.002 . — PMID 26809567 .
  122. ↑ Carrasquilla M. , Owusu CK A CRISPR outlook for apicomplexans.  (engelsk)  // Naturanmeldelser. mikrobiologi. - 2016. - Bd. 14, nr. 11 . - S. 668. - doi : 10.1038/nrmicro.2016.153 . — PMID 27795546 .
  123. ↑ Shen B. , Brown K. , Long S. , Sibley LD Development of CRISPR/Cas9 for Efficient Genome Editing in Toxoplasma gondii.  (Engelsk)  // Metoder i molekylærbiologi (Clifton, NJ). - 2017. - Bd. 1498. - S. 79-103. - doi : 10.1007/978-1-4939-6472-7_6 . — PMID 27709570 .
  124. ↑ Brunger JM , Zutshi A. , Willard VP , Gersbach CA , Guilak F. CRISPR/Cas9-redigering af inducerede pluripotente stamceller til konstruktion af inflammationsresistente væv.  (engelsk)  // Arthritis & rheumatology (Hoboken, NJ). - 2016. - doi : 10.1002/art.39982 . — PMID 27813286 .
  125. ↑ Kaczmarczyk L. , Mende Y. , Zevnik B. , Jackson W.S. Manipulering af prionproteingensekvensen og -ekspressionsniveauer med CRISPR/Cas9.  (engelsk)  // Public Library of Science ONE. - 2016. - Bd. 11, nr. 4 . — P.e0154604. - doi : 10.1371/journal.pone.0154604 . — PMID 27128441 .
  126. ↑ Freedman B. S., Brooks C. R., Lam A. Q., Fu Hongxia, Morizane R., Agrawal V., Saad A. F., Li M. K., Hughes M. R., Werff R. V., Peters D. T., Lu Junjie, Baccei A., M. Siedlecki A., Muserun T. K., McNagny K. M., Steinman T. I., Zhou Jing, Lerou P. H., Bonventre J. V.  Modellering af nyresygdom med CRISPR-mutante nyreorganoider afledt af humane pluripotente epiblastsfæroider  // Nature Communications. - 2015. - Bd. 6. - S. 8715. - doi : 10.1038/ncomms9715 . — PMID 26493500 .
  127. ↑ Bellin M., Casini S., Davis R. P., D'Aniello C., Haas J., Ward-van Oostwaard D., Tertoolen L. G. J., Jung C. B., Elliott D. A., Welling A., Laugwitz K.-L., Moretti A., Mummery C. L.  Isogene humane pluripotente stamcellepar afslører rollen af ​​en KCNH2-mutation i long-QT-syndrom  // The EMBO Journal. - 2013. - Bd. 32, nr. 24. - P. 3161-3175. - doi : 10.1038/emboj.2013.240 . — PMID 24213244 .
  128. ↑ Antonio Regalado. EKSKLUSIVT: Kinesiske videnskabsmænd skaber CRISPR-  babyer . MIT Technology Review. Hentet: 1. februar 2019.
  129. ↑ Kinesiske myndigheder bekræfter fødsel af genetisk redigerede babyer og endnu en graviditet . Interfax (21. januar 2019). Hentet: 31. januar 2019.
  130. ↑ Kolata, Gina . Hvorfor er videnskabsmænd så kede af de første sprøde babyer?  (engelsk) , The New York Times  (5. december 2018). Hentet 1. februar 2019.
  131. ↑ Antonio Regalado. Engineering the Perfect Baby . MIT Technology Review (5. marts 2015). Hentet: 23. februar 2016.
  132. ↑ Baltimore D., Berg P., Botchan M., Carroll D., Charo R. A., Church G., Corn J. E., Daley G. Q., Doudna J. A., Fenner M., Greely H. T., Jinek M., Martin G. S., Penhoet E. , Puck J., Sternberg S.H., Weissman J.S., Yamamoto K.R.  Biotechnology. En forsigtig vej frem for genomisk manipulation og genmodifikation af kimlinier  // Videnskab . - 2015. - Bd. 348, nr. 6230. - S. 36-38. - doi : 10.1126/science.aab1028 . — PMID 25791083 .
  133. ↑ Lanphier E. , Urnov F. , Haecker SE , Werner M. , Smolenski J. Rediger ikke den menneskelige kimlinje.  (engelsk)  // Nature. - 2015. - Bd. 519, nr. 7544 . - S. 410-411. - doi : 10.1038/519410a . — PMID 25810189 .
  134. ↑ Nicholas Wade . Forskere søger forbud mod metode til redigering af det menneskelige genom , The New York Times  (19. marts 2015). Hentet 20. marts 2015.  "Biologerne, der skriver i Science, støtter fortsat laboratorieforskning med teknikken, og få, om nogen, forskere mener, at den er klar til klinisk brug."
  135. ↑ Kinesiske videnskabsmænd genmodificerer menneskelige embryoner . Natur (22. april 2015).
  136. ↑ Internationalt topmøde om genredigering . Nationale Akademier for Videnskaber, Ingeniørvidenskab og Medicin (3. december 2015). Hentet: 3. december 2015.
  137. ↑ James Gallagher . Forskere får grønt lys for 'genredigering' , BBC News , BBC (1. februar 2016). Hentet 1. februar 2016.
  138. ↑ Maria Cheng . Storbritannien godkender kontroversiel genredigeringsteknik , AP News  (1. februar 2016). Hentet 1. februar 2016.
  139. ↑ Science News Staff. Og Videnskabens gennembrud af året er … . news.sciencemag.org (17. december 2015). Hentet: 21. december 2015.

Litteratur

Links

  Gå til Wikidata-elementet  Ordbøger og encyklopædier
I bibliografiske kataloger
 Bioteknik
Områder inden for bioteknik
Relaterede artikler
Videnskabsmænd
Popularisatorer