Det kunstige genom er en retning i biologisk forskning forbundet med genetisk modifikation af eksisterende organismer for at skabe organismer med nye egenskaber. I modsætning til genteknologi består et kunstigt genom af kemisk syntetiserede gener.
Det antages, at der i fremtiden kan skabes kunstige genomer, der ikke er baseret på DNA eller ved hjælp af et andet sæt af nukleotider og andre kodningsprincipper end i naturlige genomer. Således er skabelsen af kunstige genomer et af områderne inden for syntetisk biologi .
Det skal forstås, at mens vi taler om syntesen af gener med naturlige genetiske koder eller deres små modifikationer . Det er muligt at syntetisere et kunstigt gen , der koder for et hvilket som helst forudbestemt polypeptid , men det er stadig umuligt at designe et fundamentalt nyt polypeptid, så det i det mindste folder sig til en proteinkugle , for ikke at nævne, at det resulterende protein begynder at fungere som et enzym .
I øjeblikket er den højeste præstation inden for at skabe et kunstigt genom syntesen af kromosomet af bakterien Mycoplasma mycoides , udført af Craig Venter i 2010.
I 2010 ansatte Craig Venter Instituteformået kunstigt at syntetisere det cykliske kromosom af bakterien Mycoplasma mycoides med en størrelse på 1.077.947 nukleotidpar [1] . Kromosomet blev implanteret i en celle af bakterien Mycoplasma capricolum , efter hvis deling der blev dannet en celle, fuldstændig styret af et kunstigt genom.
Dette kunstige genom er nu kendt under kodebetegnelsen JCVI-syn1.0. Den gentager næsten fuldstændigt genomet fra en af stammerne af bakterien Mycoplasma mycoides , med undtagelse af flere kunstigt indførte genetiske markører ( engelsk vandmærke, vandmærker ), flere ubetydelige gener fjernet under syntesen og 19 mutationer, der opstod under samlingen af DNA- fragmenter . Celler med et kunstigt genom fungerer normalt og er i stand til flere divisioner.
Arbejdet med det kunstige genom begyndte med arbejdet fra Frederick Sanger og hans samarbejdspartnere, som i 1977 formåede at etablere den komplette nukleotidsekvens af bakteriofag φX174 genomet med en længde på 5375 nukleotidpar [2] . Atten år senere, i 1995, sekventerede Craig Venters gruppe for første gang genomet af en selvreplikerende organisme, den 1.830.137-par store bakterie Haemophilus influenzae [3] .
I løbet af de sidste 25 år (1985-2010) er hastigheden af genomsekventering steget med mindst 8 størrelsesordener. Eksplosionen i antallet af organismer, hvis genom er blevet aflæst, har givet anledning til problemet med at forstå den biologiske rolle af hvert gen i en organisme. Indtil for nylig var det ikke klart, om genomet indeholder fuldstændig information om organismens struktur, og om en organisme med et kemisk syntetiseret genom ville være levedygtig. Et andet spørgsmål, som molekylærbiologien stod over for, var, om bakteriernes genom er det minimum, der er nødvendigt, og hvad er det minimumssæt af gener, der kan skabe en levende celle.
I 1996 foreslog Arkady Mushegyan og Evgeny Kunin ( National Center for Biotechnology Information , USA ), at de 256 orthologe gener, der deles af den gram -negative bakterie Haemophilus influenzae og den gram-positive bakterie Mycoplasma genitalium er en god tilnærmelse til minimumssættet af bakterier celle gener [4] . I 2004 foreslog en gruppe forskere fra University of Valencia ( Spanien ) et sæt af 206 proteinkodende gener opnået fra analysen af flere bakterielle genomer [5] .
Forskere fra Craig Venters gruppe har siden 1995 skabt en organisme med et minimalt kunstigt syntetiseret genom [1] . I 1995 sekventerede de genomet af Mycoplasma genitalium , det forårsagende middel til sygdomme i det menneskelige genitourinære system, den mindste organisme, der er kendt til dato, og som kan reproducere sig selv. Denne mikroorganisme indeholder 517 gener, hvoraf 482 koder for proteiner . Det samlede volumen af genomet er 580 tusind nukleotidpar. I 1999 , ved at analysere placeringen af transposoner i sekventerede genomer, var det muligt at fastslå, at fra 265 til 350 gener er vitale for en organisme, og mere end 100 gener har et ukendt formål [6] . Yderligere forskning i 2005 udvidede listen over vitale gener til 382 [7] .
Senere blev endnu mindre prokaryote genomer opdaget, men de tilhører alle obligatoriske symbionter - organismer, der ikke er i stand til at eksistere autonomt.
I 2003 blev Nanoarchaeum equitans -genomet på 490.885 par sekventeret [8] . Det er også blevet fastslået, at det usekventerede genom af Buchnera- arten har en længde på omkring 450 tusinde par [9] .
Det mindste af de bakterielle genomer, der er afkodet til dato, er genomet af den intracellulære endosymbiont af bakterien Carsonella , bestående af 159.662 nukleotidpar og kun indeholder 182 proteinkodende gener. Dette genom blev sekventeret af japanske forskere i 2006 [10] .
Craig Venters gruppe udviklede en teknologi til syntese af store DNA- molekyler baseret på kemisk syntetiserede fragmenter på 5-7 tusinde par store, kaldet kassetter . Fragmenter blev samlet dels in vitro af passende enzymer , dels ved in vivo rekombination i gærcellen Saccharomyces cerevisiae . Det komplette syntetiske genom er med succes blevet klonet som et centromert plasmid (YCp) i gærceller [11] .
Det første forsøg på at skabe et kunstigt genom, udført i 2008, bestod i syntesen af et Mycoplasma genitalium kromosom på 582.970 par langt. Overlappende kassetter på 5-7 tusinde par i størrelse, samlet af kemisk syntetiserede polynukleotider, blev sekventielt kombineret ved hjælp af enzymer til fragmenter på 24, 72 og 144 tusinde par store (1/24, 1/8 og 1/ 4 i genomet). Den fuldstændige samling af genomet fra fire komponenter blev udført ved rekombination i Saccharomyces cerevisiae -cellen . Sekvensering af det resulterende kromosom bekræftede nøjagtigheden af syntesen. Bakterien M. genitalium underart G37 (prøve MG408) blev brugt som en prototype, hvis patogene aktivitet blev blokeret af en speciel markør. For at identificere det kunstige genom blev nukleotidsekvenser kaldet "vandmærker" indført i DNA [ 11 ] .
Visse vanskeligheder opstod under overførslen af et syntetisk kromosom fra en donorcelle (gær) til en modtagercelle. Et separat problem var fjernelsen af det oprindelige genom fra bakteriecellen for at erstatte det med et syntetisk.
I yderligere forsøg måtte M. genitalium- bakterier opgives som en genetisk prototype på grund af deres ekstremt lave væksthastighed. I undersøgelser udført i 2010 blev genomet af Mycoplasma mycoides subsp. capri ( GM12 ) brugt som prototype, og Mycoplasma capricolum subsp . capricolum (CK) blev brugt som recipient .
For at udvikle teknologien til at overføre kromosomer fra en gærcelle til en modtagercelle er der udviklet metoder til kloning af hele kromosomer i form af gærcentromere plasmider. Det naturlige kromosom af M. mycoides blev brugt som genstand for eksperimenter . De første forsøg på at overføre M. mycoides -kromosomet til M. capricolum -cellen endte dog i fiasko. Som det viste sig, var problemet i bakteriecelle- restriktionssystemet . Restriktionssystemerne for M. mycoides og M. capricolum er de samme, deres DNA er methyleret, og der er ingen problemer med den direkte overførsel af et kromosom fra en celle til en anden [12] . DNA klonet i gær er ikke methyleret og, når det overføres til M. capricolum , ødelægges det af restriktionssystemet. For at undgå dette blev donor-DNA methyleret med oprenset methylase eller et ekstrakt fra M. mycoides eller M. capricolum , eller modtagercellens restriktionssystem blev simpelthen ødelagt [13] .
Det andet forsøg på at syntetisere bakteriegenomet blev lavet i 2010. Kromosomet af bakterien Mycoplasma mycoides (underarten capri GM12) med et volumen på 1,08 millioner nukleotidpar blev valgt som prototype . Dette kunstige genom fik kodenavnet JCVI-syn1.0. To genomer blev brugt til arbejdet: CP001621 [14] ( GenBank database ), sekventeret af gruppen af J. Glass fra Craig Venter Institute i 2007 [12] , og det transgene genom CP001668 [15] , sekventeret af gruppen af Carol Lartik i 2009 [13] . Baseret på prøve CP001621 blev kassetter syntetiseret og brugt til yderligere syntese. Ved afslutningen af sekventeringen af prøve CP001668 blev der udført en afstemning, som fandt forskelle i 95 fragmenter. Forskelle, der fandtes at være biologisk signifikante, blev korrigeret for allerede syntetiserede kassetter. 19 forskelle, der ikke påvirker bakteriens vitale aktivitet, blev efterladt uændrede. I fire områder af genomet, som ikke er vitale, dannes 4 WM1-WM4-tags med en længde på henholdsvis 1246, 1081, 1109 og 1222 par. Den resulterende M. mycoides JCVI syn1.0-gensekvens blev indtastet i GenBank-databasen under koden CP002027 [16] .
| Bioteknik | |
|---|---|
| Områder inden for bioteknik | |
| Relaterede artikler |
|
| Videnskabsmænd | |
| Popularisatorer | |