Transfektion
Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 21. februar 2020; checks kræver 2 redigeringer .Transfektion er processen med at introducere en nukleinsyre i eukaryote celler ved en ikke-viral metode [1] . En lignende proces i forhold til prokaryoter kaldes transformation .
Transfektion involverer normalt dannelsen af åbninger i plasmamembranen , hvorigennem ekstracellulært materiale kan komme ind i cellen. Genetisk materiale såsom DNA eller RNA kan transficeres , såvel som proteiner , såsom antistoffer . Til transfektion bruges ofte et stærkt elektrisk felt ( elektroporation ) eller elektrostatisk ladede lipider , der er i stand til at danne liposomer , strukturer, der smelter sammen med plasmamembranen, og udstøder materialet, der er indesluttet i dem, ind i cellen. Andre metoder til transfektion er også kendte.
Den oprindelige betydning af ordet transfektion : infektion til transformation, det vil sige introduktionen af et viralt genom i celler , som et resultat af hvilken infektion begynder. Men da begrebet transformation har en anden betydning i anvendelse på mennesker og dyr (genetiske ændringer, der gør det muligt at holde celler i kultur i lang tid og overvinde Hayflick-grænsen , som er typisk for f.eks. kræftceller), term transfektion blev foreslået anvendt som en erstatning for udtrykket transformation i betydningen at ændre fænotypen ved at indføre en fremmed nukleinsyre.
Transfektionsmetoder
Materialer, der anvendes til transfektion, er af tre hovedtyper: mikropartikler, kationiske polymerer og liposomer.
En af de billigste og mindst pålidelige metoder er calciumphosphattransfektion, opfundet i 1970'erne [2] [3] ). En isotonisk opløsning indeholdende HEPES- buffer , fosfat og DNA blandes med calciumchlorid. Et bundfald dannes af calciumphosphatpartikler og DNA, hvis størrelse ligger i nanometerområdet. Suspensionen tilsættes til cellekulturen, som absorberer partikler (hvordan præcist, har forfatterne ikke specificeret). Denne transfektion fungerer bedst med humane embryonale nyreceller linje 293 (HEK 293), men mange andre linjer transficeres med noget mindre effektivitet.
En mere effektiv metode bruger liposomer, strukturer, der er meget mindre i størrelse end celler, bestående af en lipidmembran , der omgiver DNA i en vandig fase. Deres struktur ligner strukturen af celler, som også er omgivet af en fosfolipidmembran. Liposomer kan fusionere med cellemembranen, hvorefter deres indre rum smelter sammen med cellernes indhold. Til dannelsen af liposomer bruges normalt positivt ladede lipider, da DNA og cellulære fosfolipider er negativt ladede, og partikler med forskellige elektrostatiske ladninger tiltrækkes af hinanden.
En anden metode til transfektion er anvendelsen af positivt ladede vandopløselige polymerer, såsom DEAE-dextran eller polyethylenimin. Negativt ladet DNA binder polykationer, og det resulterende kompleks optages af celler ved endocytose .
DNA kan også indføres i celler ved mikroinjektion eller ved at bruge en " genpistol ". Sidstnævnte bruger mikropartikler af et inert fast stof (normalt guld), hvortil DNA er fusioneret.
Impalefektion er en genleveringsmetode , der bruger nanomaterialer såsom kulstofnanofibre , kulstofnanorør , nanotråde . Nålelignende nanostrukturer syntetiseres vinkelret på substratoverfladen. Plasmid-DNA, der indeholder genet og beregnet til intracellulær levering, er knyttet til overfladen af nanostrukturen. Chippen med arrays af sådanne nåle presses derefter mod cellerne eller vævene. Celler udsat for nanostrukturerne kan udtrykke de leverede gener.
Andre transfektionsmetoder omfatter elektroporation , nukleofektion, varmechok, brugen af magnetiske partikler og en række kommercielle reagenser distribueret af producenter af forskningsprodukter.
Derudover kan DNA leveres til celler af vira. I dette tilfælde kaldes processen transduktion , og cellerne transduceres.
Transfektion er stabil og forbigående
For at løse problemet er det ofte nok kun at indføre DNA i celler i nogen tid, tilstrækkeligt til dets ekspression . Da transficeret DNA normalt ikke er inkorporeret i kernegenomet og ikke replikeres, går fremmed DNA hurtigt tabt, efterhånden som celler formerer sig. En sådan transfektion kaldes transient .
Hvis det er nødvendigt at fiksere det indførte gen i afkommet af transficerede celler, bør det inkluderes i det nukleare genom. En sådan transfektion kaldes stabil . For at gøre dette introduceres et andet gen i cellerne, som letter selektionen af transficerede celler og derfor kaldes en selektionsmarkør . For eksempel kan en selektionsmarkør være et resistensgen over for et eller andet antibiotikum . Nogle celler inkluderer helt ved et uheld fremmed DNA i deres genom, og opgaven i dette tilfælde er kun at udvælge afkom af sådanne celler (klon), hvilket er let at gøre i nærværelse af et antibiotikum, der er skadeligt for alle celler undtagen de transficerede. .
Geneticin, også kendt som G418, puromycin, doxymycin osv., bruges ofte som antibiotika til selektion af transficerede celler.
Integrationen af fremmed DNA i det cellulære genom sker på grund af tilstedeværelsen af en reparationsmekanisme i cellen . Derfor øges insertionseffektiviteten, hvis det DNA, der indføres i cellerne, er lineært snarere end cirkulært, som bakterielle plasmider normalt er . Naturligvis sikrer tilstedeværelsen af restriktionsenzymer i celler til en vis grad tilfældig linearisering af cirkulære plasmider, men det kan også forekomme i henhold til selektionsgenet eller det gen, der skal integreres i genomet. Derfor er gensplejsede konstruktioner sædvanligvis præ-lineariseret, når man forbereder stabil transfektion.
Endnu mere forberedende arbejde kræver, at man indsætter et gen et bestemt sted i genomet, hvilket for eksempel er nødvendigt for genetisk knockout . I dette tilfælde, i en gensplejset konstruktion, bør kassetten af gener introduceret i kromosomet være placeret mellem to sektioner komplementære til kromosomalt DNA, 1000-3000 basepar lange (de såkaldte skuldre ).
Noter
- ↑ Transfektion (downlink) . Dato for adgang: 26. september 2008. Arkiveret fra originalen 17. december 2008.
- ↑ Graham FL, van der Eb AJ En ny teknik til assay af infektivitet af humant adenovirus 5 DNA // Virology : journal. - 1973. - Bd. 52 , nr. 2 . - S. 456-467 . - doi : 10.1016/0042-6822(73)90341-3 . — PMID 4705382 .
- ↑ Bacchetti S., Graham F. Overførsel af genet for thymidinkinase til thymidinkinase-deficiente humane celler ved udtømt herpes simplex viralt DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America : journal . - 1977. - Bd. 74 , nr. 4 . - S. 1590-1594 . - doi : 10.1073/pnas.74.4.1590 . — PMID 193108 .
Litteratur
- Singer M., Berg P. Gener og genomer. - Moskva, 1998.
- Sambrook J., Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. – 1989.
Links
 Ordbøger og encyklopædier |
|---|