CRISPR Cas13

CRISPR-Cas13 er en RNA-nuklease , der kan bruges til at målrette RNA-nedbrydning [1] . Cas13-enzymer har to HEPN-endoRNase-domæner (Højere eukaryoter og prokaryoter nukleotidbinding) [2] . Til målretning bruger dette enzym guide-RNA (gRNA) . Ved aktivering ved parring mellem en CRISPR RNA (crRNA) sekvens og et komplementært enkeltstrenget RNA (ssRNA) mål, forårsager Cas13 effektoren spaltning af mål RNA'et Samtidig kræver aktivering af Cas13 ribonuklease næsten perfekt komplementaritet mellem målet. RNA og det Cas13-associerede guide-RNA [3] . Fordi den programmerede Cas13 guide-RNA-sekvens er omkring tre gange større end den originale shRNA-sekvens , giver CRISPR-Cas13-medieret transkriptionel silencing forskere større målselektivitet. En anden fordel er, at Cas13 ikke kræver en PAM-sekvens (Protospacer adjacent motif) sekvens , som teoretisk tillader den at målrette næsten enhver region af RNA [4] .

Men i modsætning til Argonaute -proteiner , som kun skærer komplementære RNA'er i cis -positionen, kan Cas13, ud over komplementære RNA'er i cis -positionen, også ødelægge nærliggende ikke-komplementære RNA'er i trans - positionen, hvilket begrænser brugen af ​​nogle undertyper af Cas13 in vivo [5] . Dette skyldes det faktum, at Cas13-nukleasedomæner er placeret på den eksponerede overflade af proteinet væk fra crRNA-bindingslommen til mål-RNA'et [3] [6] .

Det er dog ikke alle CRISPR Cas13-systemer, der er ens, nogle af dem gør det muligt at minimere bivirkninger. Således viser en high-fidelity-variant med Cas13d-N2V8-mutationen, kaldet hfCas13d (high-fidelity Cas13d), RNA-knockdown -aktivitet svarende til vildtype-Cas13, men viser ikke signifikant collateral skade i transgene mus [7] . Den nye genredigeringstilgang ved hjælp af det RNA-målrettede hfCas13d-enzym er sikrere, fordi RNA'er er forbigående molekyler, der kun eksisterer i cellen i en kort periode og ikke integreres i genomet [8] . Derfor har præcise RNA-redigeringssystemer, der anvender CRISPR-Cas13, potentialet til at blive brugt til terapeutiske formål, når der ønskes en midlertidig ændring i cellefunktion. For eksempel er der udviklet kompakte Cas13bt-REPAIR-enzymer, der kan placeres i den AAV-adenovirale vektor , og med dens hjælp kan funktionelt vigtige mål, såsom proteinphosphoryleringssteder, redigeres [9] . Især ved at redigere et kodon på et sted, der fremmer nedbrydningen af ​​beta-catenin under phosphorylering , var det muligt at øge signaleringen af ​​Wnt/beta-catenin-vejen , som er nødvendig for at stimulere leverregenerering, med en faktor på 52 [9] .

Ved at fusionere det katalytisk deaktiverede Cas13d-enzym med translationsinitieringsfaktoren IF-3 , var det muligt at opnå en programmerbar aktivator af proteintranslation dCasRx-IF3 og, med dens hjælp, selektivt forstærke syntesen af ​​visse proteiner på det post-transkriptionelle niveau [ 10] .

Noter

  1. ↑ Ashraf, S., Ghouri, MZ, Javed, M.A., Zafar, H., Ali, H., Qari, SH, & Ahmad, A. (2022). RNA-redigering med CRISPR/Cas13. I CRISPR/Cas Tool Kit for Genome Editing (s. 219-254). Springer, Singapore. doi : 10.1007/978-981-16-6305-5_7
  2. ↑ Cox, DB, Gootenberg, JS, Abudayyeh, OO, Franklin, B., Kellner, MJ, Joung, J., & Zhang, F. (2017). RNA-redigering med CRISPR-Cas13. Science, 358(6366), 1019-1027. PMID 29070703 PMC 5793859 doi : 10.1126/science.aaq0180
  3. ↑ 1 2 Ai, Y., Liang, D., & Wilusz, JE (2022). CRISPR/Cas13-effektorer har forskelligt omfang af off-target-effekter, der begrænser deres anvendelighed i eukaryote celler. Nukleinsyreforskning, 50(11), e65-e65. PMID 35244715 PMC 9226543 doi : 10.1093/nar/gkac159
  4. ↑ Goel, K., & Ploski, JE (2022). RISC-y Business: Begrænsninger af kort hårnåle-RNA-medieret gendæmpning i hjernen og en diskussion af CRISPR/Cas-baserede alternativer. Frontiers in Molecular Neuroscience, 15, 914430 PMID 35959108 PMC 9362770 doi : 10.3389/fnmol.2022.914430
  5. ↑ Li, Y., Xu, J., Guo, X., Li, Z., Cao, L., Liu, S., ... & You, F. (2022). Kollateral spaltning af 28s rRNA af RfxCas13d forårsager musedød. bioRxiv. doi : 10.1101/2022.01.17.476700
  6. ↑ Li, Z., Li, Z., Cheng, X., Wang, X., Ma, S., Wang, S., ... & Fei, T. (2022). Intrinsic RNA-målretning begrænser anvendeligheden af ​​CRISPR-Cas13-systemer. bioRxiv. doi : 10.1101/2022.05.14.491940
  7. ↑ Tong, H., Huang, J., Xiao, Q., He, B., Dong, X., Liu, Y., ... & Yang, H. (2022). High-fidelity Cas13-varianter til målrettet RNA-nedbrydning med minimale sideeffekter. Nature Biotechnology, 1-12. doi : 10.1038/s41587-022-01419-7 ; (2021). bioRxiv pdf doi : 10.1101/2021.12.18.473271
  8. ↑ Forskere har angiveligt skabt en ny 'kontrollerbar, reversibel' genredigeringsmetode i Kina Arkiveret 20. august 2022 på Wayback Machine . Cas13-varianter med minimal collateral effekt forventes at være mere konkurrencedygtige til in vivo RNA-redigering og fremtidige terapeutiske applikationer, hævder forskere.
  9. ↑ 1 2 Kannan, S., Altae-Tran, H., Jin, X., Madigan, VJ, Oshiro, R., Makarova, KS, ... & Zhang, F. (2022). Kompakte RNA-editorer med små Cas13-proteiner. Nature biotechnology, 40(2), 194-197. PMID 34462587 PMC 8929162 doi : 10.1038/s41587-021-01030-2
  10. ↑ Otoupal, PB, Cress, BF, Doudna, JA, & Schoeniger, JS (2022). CRISPR-RNAa: målrettet aktivering af translation ved hjælp af dCas13-fusioner til translationsinitieringsfaktorer. Nucleic Acids Research, 50(15), 8986-8998. PMID 35950485 PMC 9410913 doi : 10.1093/nar/gkac680

Litteratur

 Bioteknik
Områder inden for bioteknik
Relaterede artikler
Videnskabsmænd
Popularisatorer