Exonukleaser er proteiner fra gruppen af nukleaser , der spalter terminale mononukleotider fra en polynukleotidkæde ved hydrolyse af phosphodiesterbindinger mellem nukleotider.
Afhængigt af evnen til at hydrolysere bindinger ved 3'- og 5'-enderne af polynukleotidkæden, skelnes 3'- og 5'-exonukleaser. Exonukleaser findes i celler både separat og som en del af enzymkomplekser . For eksempel indeholder DNA-polymerase I en 5'-exonuklease, der spalter en RNA-primer , der er knyttet direkte til det sted, hvor DNA-syntese finder sted. Derefter begynder DNA-polymerase I at tilføje nukleotider til stedet for den frigjorte primer. I arkæbakterier og eukaryoter udføres en af hovedvejene for RNA- nedbrydning af et proteinkompleks, der hovedsageligt består af 3'- og 5'-exoribonukleaser.