Elektroporation

Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 27. januar 2022; checks kræver 2 redigeringer .

Elektroporation er skabelsen af porer i en tolags lipidmembran under påvirkning af et elektrisk felt. Dette fænomen bruges i bioteknologi til at introducere makromolekyler (normalt DNA eller RNA ) i pattedyrs- , bakterie- eller planteceller og bruges også i medicin og industri.

Styrkelse af det elektriske felt under elektroporation

Fænomenet elektroporation er baseret på, at membraner har evnen til at koncentrere et elektrisk felt. Lad en potentialforskel U påføres mellem to flade parallelle elektroder placeret i en afstand L, og mellemrummet mellem dem fyldes med en svagt ledende elektrolyt. Så er feltstyrken jævnt fordelt over hele mellemrummet mellem dem. Lad os nu placere en tolags lipidmembran i midten af cellen, som har så høj en modstand, at den kan betragtes som et ikke-ledende dielektrisk. Så vil hele potentialeforskellen U blive koncentreret på membranen.

Den elektriske feltforstærkning vil naturligvis være lig med L/h ~ 10^6, hvis vi vælger L ~ 1 cm, h ~ 5 nm. I overensstemmelse med de eksperimentelle resultater er det således tilstrækkeligt at påføre en potentialforskel af størrelsesordenen hundreder af millivolt på elektroderne for at inducere elektroporation af dobbeltlaget. Hvis celler med en diameter på omkring 10 mikron nu er mellem elektroderne, og vi ønsker at få dem til at blive elektroporeret, skal der tilføres meget højere spændinger. På grund af membranens høje modstand vil opløsningen i cellen faktisk være ækvipotential, det vil sige, at det ydre felt vil blive skærmet af mobile ioner, som danner diffuse plader af dobbelte elektriske lag. Spændingsspringet på cellen vil således være 2UR/L, som vil være koncentreret på membranen i området af cellens to poler. Hvis vi accepterer, at det er nødvendigt at have f.eks. 0,5 V, så vil det være nødvendigt at påføre elektroderne U ~ L / R * 0,5 V. Med L ~ 1 cm, R ~ 5∙10^-4 cm, får vi U ~ (1∙0,5)/(5∙10^(-4)) ~ 1 kV. Derfor er det i forsøg med cellesuspensioner og liposomer nødvendigt at bruge specielle elektroporatorer, der er i stand til at generere korte impulser med en amplitude på op til 1-10 kV.

Når elektriske feltpulser med en styrke fra flere hundrede til flere tusinde volt pr. cm og en varighed fra titusvis af mikrosekunder til titusvis af millisekunder påføres en cellesuspension, er det muligt at forårsage en kraftig stigning i cellemembranernes ledningsevne. Efter moderat elektrisk behandling falder celleledningsevnen til normale værdier inden for få sekunder til flere minutter. Mere intens elektrisk behandling fører til irreversibel ødelæggelse af nogle celler.

I eksperimenter med celler er det vanskeligt at styre spændingen direkte på cellemembranen. Derudover er cellemembranen et ekstremt komplekst system. Membranens vigtigste barrierefunktioner udføres af et fosfolipid-dobbeltlag, som er gennemsyret af proteiner, der fungerer som selektive kanaler eller aktive pumper for ioner og metabolitter. Mulige årsager til stigningen i elektrisk ledningsevne kunne være ændringer i både lipid-dobbeltlaget og proteiner. Eksperimenter med en kunstig tolags lipidmembran (BLM) viste muligheden for dens elektriske nedbrydning ved spændinger tæt på dem, hvor der observeres nedbrydning i cellemembranen. Det har vist sig, at den elektriske nedbrydning af BLM af en bestemt sammensætning kan være reversibel. Dette indikerer, at det er nedbrydningen af lipidkomponenten, der er ansvarlig for stigningen i cellepermeabilitet. Eksperimenter med BLM viste, at elektrisk nedbrud sker stokastisk, og den gennemsnitlige membranlevetid afhænger ikke-lineært af spændingen. Disse observationer førte til udviklingen af en teori om dannelse og udvikling af porer i flydende lipid-dobbeltlag i et elektrisk felt. I slutningen af 1990'erne var det ved hjælp af højpræcisionsmålinger af membranledningsevne muligt at registrere forekomsten af enkelte elektroporer i BLM. Deres gennemsnitlige diameter er omkring 0,5 nm. I cellemembraner blev de påvist ved hjælp af elektronmikroskopi.

Teorien om membranelektroporation

Teorien om BLM-elektroporation antyder, at en lokal omlejring af strukturen forekommer i dobbeltlagslipidmembranen, hvilket fører til fremkomsten af en gennemvandskanal. To grundlæggende porekonfigurationer er mulige, hydrofile og hydrofobe. I en hydrofob pore er porevæggene foret med lipidhaler, mens de i en hydrofil pore er foret med fosfolipidhoveder. Ved små radier er en hydrofob pore energetisk gunstig, og ved store radier en hydrofil pore. Vand har en højere dielektrisk konstant end lipider. Derfor har en membran, der indeholder porer, mindre energi i et eksternt elektrisk felt. Denne energiforstærkning er proportional med arealet af poren og kvadratisk i dens radius. Ved en poreradius r* bliver energierne af de hydrofobe og hydrofile porer lige store. Der er et lokalt minimum på energikurven svarende til dobbeltlagets metastabile ledende tilstand, hvorfra det med en vis frekvens går over i den initiale uforstyrrede tilstand med en lav ledningsevne af systemet eller gennemgår et brud. Hastigheden for dannelse af hydrofile porer i et lipid-dobbeltlag med enhedsareal (Kc) kan beskrives ved ligningen $Kc=Aexp(\alpha U^{2})$

hvor

$A=\nu /aexp(-\Delta W^{0}/kT)$ , $\alpha =\pi r_{*}^{2}(\epsilon _{w}-\epsilon _{m})\epsilon _{0}/(2dkT)$

Her er a arealet pr. et lipidmolekyle, d er dobbeltlagstykkelsen, er vakuumdielektricitetskonstanten, er dobbeltlagets dielektriske permittivitet, er permittiviteten af vand, k er Boltzmann-konstanten, er frekvensen af laterale udsving på lipidmolekyler, er poreradiusen svarende til overgangstilstanden, T er temperaturen, U er den elektriske spænding over dobbeltlaget, er aktiveringsenergien af poren i fravær af et elektrisk felt. $\epsilon _{0}$ ${\displaystyle \epsilon _{m))$ $\epsilon_{w}$ $\nu$ $r_{*}$ $\Delta W^{0}$

Det antages, at poreovervæksthastigheden ikke afhænger af det påførte elektriske felt og poretætheden på dobbeltlaget.

Levering af makromolekyler til celler ved elektroporation

De ovenfor beskrevne eksperimenter blev faktisk reduceret til at måle den elektriske strøm, der blev båret af små ioner gennem porerne. Sammen med dette blev det fundet, at elektrisk behandling fremmer overførslen gennem membraner af makromolekyler, hvis størrelse overstiger diameteren af elektroporer. Desuden er der blevet bemærket en sammenhæng mellem elektroporation og transport af store molekyler. I videnskabelige arbejder, på eksemplet med transport af DNA-molekyler, blev det bevist, at de er i stand til at udvide porerne, som derefter langsomt (~ 100 sek.) slapper af til deres oprindelige tilstand. Derudover viste direkte eksperimenter der også, at DNA-elektroforese spiller en vigtig rolle, ikke kun på tidspunktet for overførsel af disse molekyler til cellen, men også når de passerer gennem membranen. Det elektriske felt presser bogstaveligt talt plasmid-DNA'et ind i en lille pore, mens det udvider det. Vi kan sige, at plasmid-DNA-molekylerne selv spiller rollen som gyldne mikroskopiske kugler, der bruges i "genpistol"-metoden. Kun drivkræfterne er af forskellig karakter - elektriske i det første tilfælde, mekaniske i det andet. En anden vigtig innovation implementeret i videnskabelige værker er brugen af en 2-puls elektrisk behandlingsteknik, som gjorde det muligt at adskille to feltfunktioner i tid - elektroporation og elektroforetisk. Den første impuls var kraftig, men kort; derefter fulgte et interval af variabel varighed, og til sidst blev et svagt konstant felt tændt. Introduktionen af DNA før den første puls resulterede i høj transfektion og overførsel af store dextranmolekyler, mens introduktionen af DNA under interpulsintervallet næsten ikke havde nogen effekt.

I det sidste årti er elektroporation blevet brugt til transdermal overførsel af lægemidler til den menneskelige krop. Elektroporation er grundlaget for adskillige transdermale overførselsteknikker kaldet aquaphoresis , non-invasiv mesoterapi , nålefri mesoterapi eller injektionsfri mesoterapi.

Medicinske applikationer

Metoden til elektroporation bruges til behandling af onkologiske sygdomme: irreversibel elektroporation af en tumor fører til lokal ødelæggelse af dens celler, mikrosekund elektriske impulser på 2000-3000 volt i membranerne af tumorceller danner mikroporer, hvilket fører til forstyrrelse af cellulær homeostase og celledød [1] .

Industrielle applikationer

Industrielle anlæg til elektroporering af produkter (teknologien kaldes PEF - pulselektrisk felt) bruges som et af stadierne i produktionsprocessen: til fremstilling af juice og smoothies som en mere skånsom desinfektionsmetode end pasteurisering eller ultrapasteurisering , og i produktion af frosne og tørrede produkter - for bedre bevarelse af produkters organoleptiske egenskaber, reduktion af vandforbrug og produktionstab. Verdens førende virksomhed inden for implementering af teknologi i fødevareproduktion er Elea GmbH fra Tyskland [2] .

Noter

↑ Frelse for en patient med inoperabelt adenokarcinom i bugspytkirtlen var metoden til irreversibel elektroporation . www.ronc.ru _ Nationalt Forskningscenter for Onkologi opkaldt efter N.N. N. N. Blokhin (21. januar 2022). Hentet: 27. januar 2022. (Russisk)
↑ Elea GmbH . www.potatopro.com . Hentet: 18. januar 2022.

Links

Kinosita, K., Jr. og T.Y. Tsong. 1977. Dannelse og genforsegling af porer af kontrolleret størrelse i human erytrocytmembran. Nature 268:438-441.
Weaver, JC, og Y. Chizmadzhev. 1996. Theory of electroporation: A review. Bioelectroch Bioener 41:135-160.
Zimmermann, U., G. Pilwat og F. Riemann. 1974. Dielektrisk nedbrydning af cellemembraner. Biophys J 14:881-899.
Abidor, IG, VB Arakelian, VF Pastushenko, MR Tarasevich og LV Chernomordik. 1978. Elektrisk nedbrydning af lipid-dobbeltlagsmembraner. Dokl Akad Nauk SSSR 240:733-736. (Abidor I. G., Arakelyan V. B., Pastushenko V. F., Tarasevich M. R. og Chernomordik L. V. 1978. Elektrisk nedbrydning af en lipid-dobbeltlagsmembran. Reports of the Academy of Sciences of the USSR 240: 733-736)
Glaser, RW, SL Leikin, LV Chernomordik, VF Pastushenko og AI Sokirko. 1988. Reversibel elektrisk nedbrydning af lipid-dobbeltlag - dannelse og udvikling af porer. Biochimica et Biophysica Acta 940:275-287.
Melikov, KC, VA Frolov, A. Shcherbakov, AV Samsonov, YA Chizmadzhev og LV Chernoordik. 2001. Spændingsinducerede ikke-ledende præporer og metastabile enkeltporer i umodificeret plan lipid-dobbeltlag. Biophys J 80:1829-1836.
Chang, DC og T.S. Reese. 1990. Ændringer i membranstruktur induceret af elektroporation som afsløret ved hurtigfrysende elektronmikroskopi. Biophys J 58:1-12.
Weaver, JC 1993. Elektroporation er et generelt fænomen til at manipulere celler og væv. J Cell Biochem . 51:426-435.
Klenchin, VA, SI Sukharev, SM Serov, LV Chernoordik og YA Chizmadzhev. 1991. Elektrisk induceret DNA-optagelse af celler er en hurtig proces, der involverer DNA-elektroforese. Biophys J 60:804-811.
Sukharev, SI, VA Klenchin, SM Serov, LV Chernoordik og YA Chizmadzhev. 1992. Elektroporation og elektroforetisk DNA-overførsel til celler - effekten af DNA-interaktion med elektroporer. Biophys J 63:1320-1327.
Bezugly A.P., 2008. Aquaphoresis - mulighederne for non-invasiv mesoterapi. "Nouvelle Estertic" nr. 6:170-179.