Pyroptose

Pyroptose er en  type programmeret nekrotisk celledød , hvor plasmamembranens integritet krænkes som følge af aktiveringen af ​​caspase 1 , og cellens indhold frigives hurtigt udenfor. Et karakteristisk træk ved pyroptose er caspase 1-afhængig aktiv sekretion af interleukinerne IL-1β og IL-18 fra cellen , hvilket fører til inflammation . Pyroptose tjener som en beskyttende mekanisme for medfødt immunitet , hvilket begrænser multiplikationen af ​​intracellulære patogener , men denne type celledød er ikke begrænsetbakterielle infektioner [1] .

Historie

Fænomenet pyroptose blev først beskrevet af Arturo Zichlinski og kolleger i 1992, da de undersøgte den lytiske dødsform for makrofager inficeret med Shigella flexneri . Først blev denne type celledød forvekslet med apoptose , da den viste sig at være karakteriseret ved nogle af de egenskaber, der er iboende i apoptose: DNA-fragmentering, nuklear kondensation og afhængighed af caspaser . For nylig er en form for celledød hos makrofager inficeret med Salmonella enterica subsp. enterica ( Typhimurium serovar ); det viste sig at være caspase 1-afhængigt og helt anderledes end apoptose. Udtrykket "pyroptose" blev foreslået for det i 2001 [1] . Den græske rod "pyro" betyder "ild", hvilket indikerer den inflammatoriske karakter af denne form for død, og roden "ptosis" ("fald") bruges i navnene på andre former for celledød [2] .

Nøglefunktioner

Pyroptose bestemmes af en række kriterier. For det første programmeres pyroptose af inflammatoriske caspaser. Pyroptose kræver den proteolytiske aktivitet af caspaser, men ikke autoproteolytisk bearbejdning (dvs. skæring af hinanden med caspaser, hvilket fører til deres aktivering). I de fleste tilfælde af pyroptose aktiveres caspaser forskelligt, det vil sige ikke ved at skære hinanden, men med direkte deltagelse af et særligt kompleks, inflammasomet , der indeholder CARD-domænet . For det andet fører aktivering af inflammatoriske caspaser til dannelse af porer i plasmamembranen , og cellen bliver permeabel for farvestoffer med lav molekylvægt , for hvilke membranen er uigennemtrængelig, såsom: 7-aminoactinomycin D (7-AAD) , bromidethidium (EtBr) og propidiumiodid (PI). Tilsyneladende har disse porer en diameter på 1,1-2,4 nm. Ved apoptose forbliver cellemembranen derimod intakt, og cellen desintegrerer i apoptotiske legemer, der ikke farves med 7-AAD eller PI [2] .

Efter at membranens integritet er brudt, strømmer ioner og vand ind i cellen, som et resultat af hvilket cellen svulmer og gennemgår lysis og frigiver dets indhold udad. Efter at membranen er ødelagt, udsættes den indvendige side af plasmamembranen for den ekstracellulære væske og kan derfor farves med annexin V , som binder til phosphatidylserin (PS), et fosfolipid , der kun findes på indersiden af celle membran. Under apoptose flytter flippase PS ind i det ydre lag af membranen, hvilket gør det muligt at farve med annexin V. Farvning med annexin V gør det således ikke muligt at skelne apoptose fra pyroptose [2] .

For det tredje, under pyroptose, sker der DNA-fragmentering i celler , og TUNEL-analyse giver et positivt resultat, men ikke så intenst som under apoptose. Desuden er "stigeeffekten" af DNA ( DNA laddering )  i pyroptose svagt udtrykt. Som ved apoptose forekommer kromatinkondensation , men kernen forbliver intakt. Under apoptose medieres DNA -skade af caspase-aktiveret DNase (CAD), mens dette enzym under pyroptose forbliver bundet til dets ICAD -hæmmer (selvom caspase 1 kan spalte ICAD under in vitro -betingelser). DNA-destruktion er dog ikke nødvendig for pyroptose, og undertrykkelse af DNA-fragmentering med nukleaseinhibitorer forhindrer ikke cellelyse [2] .

Endelig, ved ikke-programmeret nekrotisk lytisk celledød, aktiverer DNA-skade ADP-ribosepolymerase (PARP), som forbruger NAD + og derved sænker niveauet af ATP i cellen. Effektorcaspaser af apoptose spalter og inaktiverer PARP og opretholder niveauet af ATP i cellen, der er tilstrækkeligt til det videre apoptoseforløb. Salmonella typhimurium -induceret pyroptose inaktiverer dog ikke PARP, selvom in vitro caspase 1 kan skære PARP. Det vides ikke, om caspase 11 kan spalte ICAD eller PARP in vitro ligesom caspase 1. Makrofager , der mangler PARP, har med succes gennemgået pyroptose, så PARP er ikke påkrævet for pyroptose. Det er blevet vist, at in vitro PARP-1 kan fungere som en nuklear faktor-KB ( NF-KB ) cofaktor i reguleringen af ​​lipopolysaccharid (LPS) -induceret caspase 11 transkription . Imidlertid havde shRNA - knockdown af PARP-1 ingen effekt på interferon-y (IFN-y) -induceret caspase 11-transkription, så PARP-1 ser ikke ud til at være involveret i caspase 11-medieret pyroptose. Pyroptose er også forskellig fra programmeret nekrotisk celledød ( nekroptose ); de vigtigste forskelle mellem pyroptose, apoptose og nekroptose er opsummeret i tabellen nedenfor [2] [3] .

Molekylære mekanismer

Pyroptose udløses af faresignaler, der genkendes i det ekstra- og intracellulære miljø af to grupper af mønstergenkendelsesreceptorer : Nod-lignende receptorer (NLR) placeret i cytoplasmaet og Toll-lignende receptorer (TLR) placeret i plasmamembranen [5 ] . Disse faresignaler kan frigives af patogene organismer, når væv er beskadiget [6] . Når intracellulære bakterielle, virale eller faresignaler, der tilhører selve cellen, binder sig til NLR , begynder samlingen af ​​et multiproteinkompleks  , inflammasomet (fra det engelske  inflammation  - inflammation). Samling af inflammasomet fører til aktivering af caspase 1, som er nødvendig for dannelse og frigivelse af pro-inflammatoriske cytokiner [7] . Det mest velundersøgte inflammasom, NLRP3 , har tre hovedtyper af domæner : leucinrige gentagelsesdomæner (LRR), et centralt nukleotidbindende oligomeriseringsdomæne NBD) og et N-terminalt pyrindomæne ] PYD) [8] . Caspase 1 og NLRP3 interagerer via adapterproteinet ASC . ASC indeholder et caspase-aktiverings- og rekrutteringsdomæne ( CARD-domæne ), der binder til pro-caspase 1 og letter dets aktivering gennem interaktion med dets CARD-domæne [9] . Som et resultat nærmer procaspaser 1 sig hinanden, dimeriserer og skærer hinanden i p10- og p20-fragmenter, som er i stand til at behandle pro-IL-1β og pro-IL-18. I andre tilfælde aktiverer inflammasomet caspase 1 gennem andre proteiner, der indeholder CARD- eller PYD-domænet [10] .

Caspase 1's nøglerolle i pyroptose blev demonstreret i 1995 [11] i eksperimenter med caspase 1 knockout- mus : deres celler var ude af stand til pyroptose. Men i 2011 blev det vist, at alle disse mus også bar en samtidig mutation i caspase 11 -genet . Derfor spiller caspase 11 ( de menneskelige ortologer  er caspase 4 og 5 ) også en vigtig rolle i pyroptose og medfødt forsvar mod intracellulære patogener. Desuden kan caspase 11 øge caspase 1-aktiveringen i gramnegative bakterielle infektioner , så begge disse caspaser kan initiere pyroptose [1] .

Den proteolytiske aktivitet af caspaser er nødvendig for passage af pyroptose , og under pyroptose sker ødelæggelsen eller afbrydelsen af ​​en række proteiner, der er nødvendige for cellens funktion og overlevelse. Til dato kendes mange mål for caspase 1. Blandt dem er proteiner i cytoskelettet , intracellulær transport, translation og vigtige metaboliske veje (for eksempel de glykolytiske enzymer aldolase , triosephosphatisomerase , glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase , enolase og pyruvatkinase ). Derudover behandler caspase 1 også andre caspaser: 4, 5 og 7. Selvom caspase 7 er en effektorcaspase af apoptose , er dens aktivering for pyroptose valgfri, hvilket indikerer forskelle i signalvejene for disse to celletyper død [12] .

Et tidligt trin i pyroptose er dannelsen af ​​små kationpermeable porer i cellemembranen . Dette forstyrrer cellens ionbalance og fører til dens hævelse og lysis . Gennem disse porer kommer Ca 2+ ioner ind i cellen , som er involveret i mange cellulære hændelser forbundet med caspase 1. Cellelyse forudgås af nuklear kondensation , DNA-fragmentering , samt sekretion af IL-1β og IL- 18. Calcium fremmer også exocytose af lysosomer , som "lukker" huller i membranen og tillader frigivelse af antimikrobielle forbindelser. Disse forbindelser dræber bakterier i det intracellulære miljø. Desuden frigives fagocyterede partikler og intracellulære patogener ved exocytose før cellelyse [12] .

Under pyroptose frigives de såkaldte skadesassocierede molekylære mønstre (DAMP) fra cellen , som virker stærke  pro-inflammatoriske faktorer i det ekstracellulære miljø. Disse omfatter ATP , DNA , RNA , varmechokproteiner . DAMP udløser inflammatoriske processer i celler, aktiverer frigivelsen af ​​cytokiner og forbedrer målretning af T-celler til specifikke mål. En af DAMP'erne, HMGB1 , spiller en særlig rolle ved pyroptose. HMGB1 er en nuklear transkriptionsfaktor, der frigives til ydersiden under pyroptose og aktiverer de cellulære receptorer TLR4 og RAGE , som igen aktiverer cytokinfrigivelse og cellemigration. Det er blevet vist, at HMGB1 alene, uden IL-1β, IL-18 og andre DAMP'er, kan forårsage inflammation [12] .

Signallipider fra eicosainoidgruppen , såsom leukotriener og prostaglandiner , øger blodkarpermeabiliteten og fremmer inflammation. I 2012 blev det vist, at calciumtilstrømning efter aktivering af caspase 1 kan inducere syntesen af ​​eicosainoider. Samtidig blokerede glycin , som hæmmer cellelyse, men ikke sekretoriske veje forbundet med caspase 1, ikke frigivelsen af ​​eicosanoider, hvilket bekræfter, at de faktisk udskilles og ikke passivt siver ud i det ydre miljø med en stigning i membranen. permeabilitet. Eicosainoid signalveje er ikke altid forbundet med aktiveringen af ​​caspase 1, men de repræsenterer et meget hurtigt og stærkt pro-inflammatorisk signal udløst af caspase 1 [12] .

Adskillige undersøgelser har vist, at caspase 1-aktivering og autofagi er antagonistiske over for hinanden: aktiv caspase 1 undertrykker autofagi, mens autofagi interfererer med caspase 1-aktivering og reducerer mængden af ​​IL-1β og inflammasomer i cytosolen [12] .

Pyroptose og patogener

Betydningen af ​​pyroptose som en mekanisme, der fjerner patogener fra det ekstracellulære miljø, som de er tilpasset til, understøttes af det faktum, at mange patogener har mekanismer til at undgå dette medfødte immunrespons. Disse patogener omfatter både bakterier og vira . Generelt er der tre hovedretninger, som disse mekanismer til undgåelse af pyroptose er baseret på.

• Patogener kan begrænse ekspressionen af ​​en inflammasom-aktiverende ligand til rum, der er utilgængelige for inflammasomer, eller gøre det umuligt for liganden at binde til NLR.
• Patogener modificerer ligandens struktur, så inflammasomer ikke kan genkende den;
• Patogener blokerer direkte funktionen af ​​inflammasomer.

Det er værd at understrege, at det afhængigt af patogenet kan være vigtigt for det at blokere ikke kun pyroptose, men også sekretionen af ​​interleukinerne IL-1b og/eller IL-18 (eller kun det, uden at blokere pyroptose) [2] .

Tabellen nedenfor opsummerer de strategier, som forskellige patogener bruger for at undgå pyroptose [2] .

Ud over ovennævnte bakterier har sådanne bakterier som Anaplasma phagocytophilum , Burkholderia thailandensis , Burkholderia pseudomallei [10] mekanismer til at undgå pyroptose . Derudover er inflammasomer forbundet med udviklingen af ​​nogle protozoinfektioner , såsom dem forårsaget af Trypanosoma cruzi , Toxoplasma gondii , Plasmodium spp. og Leishmania [13] .

Fysiologisk og klinisk betydning

Som nævnt ovenfor er pyroptose en vigtig forsvarsmekanisme for medfødt immunitet, da det udløser en inflammatorisk proces. Derudover tjener pyroptose sammen med nekroptose som en vigtig mekanisme til eliminering af inficerede celler. Men i systemiske infektioner strækker dette sig også til hæmatopoietiske stam- og progenitorceller , hvilket resulterer i svækket hæmatopoiese, cytopeni og immunsuppression [14] . Imidlertid er vedvarende inflammation forbundet med mange sygdomme, herunder stofskifteforstyrrelser , autoinflammatoriske lidelser og leverskader [15] .

Ekspressionsniveauet af NLRP3-inflammasom og caspase 1 er direkte relateret til sværhedsgraden af ​​symptomer på sådanne metaboliske lidelser som fedme og type 2-diabetes mellitus . Dette skyldes effekten af ​​caspase 1 på IL-1β og IL-18 niveauer, som hæmmer insulinsekretion . Når caspase 1 er overudtrykt, falder cellulær optagelse af glukose , og en tilstand kendt som insulinresistens indtræder [16] . Yderligere forværres det yderligere, da IL-1β inducerer ødelæggelsen af ​​pancreas -β-celler [17] .

Mutationer i gener, der koder for inflammasomkomponenter, fører til udvikling af autoinflammatoriske sygdomme kendt som kryopyrinopati. Disse sygdomme inkluderer Muckle-Wales syndrom , forkølelsesallergi og neonatal multisystem inflammatorisk sygdom [18] . Alle af dem er karakteriseret ved pludselige anfald af varme og feber og lokaliserede betændelser; disse virkninger skyldes overdreven dannelse af IL-1β [19] .

Der er bevis for, at caspase 1 er involveret i patogenesen af ​​andre sygdomme forbundet med celledød og inflammation, såsom: myokardieinfarkt , cerebral iskæmi , neurodegenerative sygdomme , inflammatorisk tarmsygdom og endotoksin shock [10] . Det er muligt, at pyroptose er forbundet med udviklingen af ​​systemisk lupus erythematosus [20] . Leverskade ved hedeslag skyldes pyroptose [21] .

En undersøgelse fra 2014 viste, at ved HIV-infektion ligger pyroptose til grund for reduktionen i CD4+ T-celler og inflammation [22] [23]  , to karakteristiske hændelser, der opstår under overgangen af ​​HIV -infektion til AIDS -stadiet . På grund af pyroptose ved HIV-infektion skabes en "ond cirkel": T-celler, der dør af pyroptose, frigiver pro-inflammatoriske signaler, som tiltrækker andre T-celler til det inficerede lymfoide væv , hvor de også dør; således udvikles kronisk inflammation og vævsdestruktion. Det er muligt, at sikre og effektive caspase 1 -hæmmere kan bryde denne cyklus. Disse midler kan blive nye anti-HIV-lægemidler, der ikke virker på selve virussen, men på værtsorganismen. Interessant nok viser caspase 1-deficiente mus ikke synlige abnormiteter og udvikler sig normalt, så hæmning af dette protein vil ikke have signifikante bivirkninger hos HIV-inficerede mennesker [24] [11] [22] .

Noter

1. ↑ 1 2 3 Vanden Berghe T. , Linkermann A. , Jouan-Lanhouet S. , Walczak H. , Vandenabeele P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.  (engelsk)  // Naturanmeldelser. Molekylær cellebiologi. - 2014. - Bd. 15, nr. 2 . - S. 135-147. doi : 10.1038 / nrm3737 . — PMID 24452471 .
2. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Jorgensen I. , Miao EA Pyroptotisk celledød forsvarer mod intracellulære patogener.  (engelsk)  // Immunologiske anmeldelser. - 2015. - Bd. 265, nr. 1 . - S. 130-142. - doi : 10.1111/imr.12287 . — PMID 25879289 .
3. ↑ Kaczmarek A. , Vandenabeele P. , Krysko DV Necroptosis: frigivelsen af ​​skadesassocierede molekylære mønstre og dens fysiologiske relevans.  (engelsk)  // Immunitet. - 2013. - Bd. 38, nr. 2 . - S. 209-223. - doi : 10.1016/j.immuni.2013.02.003 . — PMID 23438821 .
4. ↑ Sosna J. , Voigt S. , Mathieu S. , Lange A. , Thon L. , Davarnia P. , Herdegen T. , Linkermann A. , Rittger A. , ​​Chan FK , Kabelitz D. , Schütze S. , Adam D. TNF-induceret nekroptose og PARP-1-medieret nekrose repræsenterer forskellige veje til programmeret nekrotisk celledød  . (engelsk)  // Cellulær og molekylær biovidenskab: CMLS. - 2014. - Bd. 71, nr. 2 . - S. 331-348. - doi : 10.1007/s00018-013-1381-6 . — PMID 23760205 .
5. ↑ Bortoluci KR , Medzhitov R. Kontrol af infektion ved pyroptose og autofagi: rolle af TLR og NLR.  (engelsk)  // Cellulær og molekylær biovidenskab: CMLS. - 2010. - Bd. 67, nr. 10 . - P. 1643-1651. - doi : 10.1007/s00018-010-0335-5 . — PMID 20229126 .
6. ↑ Matzinger P. Faremodellen : en fornyet følelse af selv.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 2002. - Bd. 296, nr. 5566 . - S. 301-305. - doi : 10.1126/science.1071059 . — PMID 11951032 .
7. ↑ Ogura Y. , Sutterwala FS , Flavell RA . Inflammasomet: første linje af immunresponset på cellestress.  (engelsk)  // Cell. - 2006. - Bd. 126, nr. 4 . - s. 659-662. - doi : 10.1016/j.cell.2006.08.002 . — PMID 16923387 .
8. ↑ Kufer TA , Sansonetti PJ Sansning af bakterier: NOD et ensomt job.  (engelsk)  // Aktuel mening i mikrobiologi. - 2007. - Bd. 10, nr. 1 . - S. 62-69. - doi : 10.1016/j.mib.2006.11.003 . — PMID 17161646 .
9. ↑ Franchi L. , Warner N. , Viani K. , Nuñez G. Funktion af Nod-lignende receptorer i mikrobiel genkendelse og værtsforsvar.  (engelsk)  // Immunologiske anmeldelser. - 2009. - Bd. 227, nr. 1 . - S. 106-128. - doi : 10.1111/j.1600-065X.2008.00734.x . — PMID 19120480 .
10. ↑ 1 2 3 Yang Y. , Jiang G. , Zhang P. , Fan J. Programmeret celledød og dens rolle i inflammation.  (engelsk)  // Militærmedicinsk forskning. - 2015. - Bd. 2. - S. 12. - doi : 10.1186/s40779-015-0039-0 . — PMID 26045969 .
11. ↑ 1 2 Li P. , Allen H. , Banerjee S. , Franklin S. , Herzog L. , Johnston C. , McDowell J. , Paskind M. , Rodman L. , Salfeld J. Mus, der mangler IL-1 beta- konverterende enzymer er defekte i produktionen af ​​moden IL-1 beta og resistente over for endotoksisk shock.  (engelsk)  // Cell. - 1995. - Bd. 80, nej. 3 . - S. 401-411. — PMID 7859282 .
12. ↑ 1 2 3 4 5 LaRock CN , Cookson BT At brænde huset ned: cellulære handlinger under pyroptose.  (engelsk)  // PLoS patogener. - 2013. - Bd. 9, nr. 12 . — P. e1003793. - doi : 10.1371/journal.ppat.1003793 . — PMID 24367258 .
13. ↑ Zamboni DS , Lima-Junior DS Inflammasomer i værtsrespons på protozoiske parasitter.  (engelsk)  // Immunologiske anmeldelser. - 2015. - Bd. 265, nr. 1 . - S. 156-171. - doi : 10.1111/imr.12291 . — PMID 25879291 .
14. ↑ Croker B.A. , Silke J. , Gerlic M. Fight or flight: Regulation of emergency hæmatopoiesis by pyroptosis and necroptosis.  (engelsk)  // Aktuel mening i hæmatologi. - 2015. - Bd. 22, nr. 4 . - S. 293-301. - doi : 10.1097/MOH.00000000000000148 . — PMID 26049749 .
15. ↑ Davis BK , Wen H. , Ting JP De inflammasome NLR'er i immunitet, inflammation og associerede sygdomme.  (engelsk)  // Årlig gennemgang af immunologi. - 2011. - Bd. 29. - P. 707-735. - doi : 10.1146/annurev-immunol-031210-101405 . — PMID 21219188 .
16. ↑ Vandanmagsar B. , Youm YH , Ravussin A. , Galgani JE , Stadler K. , Mynatt RL , Ravussin E. , Stephens JM , Dixit VD . NLRP3-inflammasomet fremkalder fedme-induceret inflammation og insulinresistens.  (engelsk)  // Naturmedicin. - 2011. - Bd. 17, nr. 2 . - S. 179-188. - doi : 10.1038/nm.2279 . — PMID 21217695 .
17. ↑ Strovig T. , Henao-Mejia J. , Elinav E. , Flavell R. Inflammasomes in health and disease.  (engelsk)  // Nature. - 2012. - Bd. 481, nr. 7381 . - S. 278-286. - doi : 10.1038/nature10759 . — PMID 22258606 .
18. ↑ Neven B. , Prieur AM , Quartier dit Maire P. Cryopyrinopathies: opdatering om patogenese og behandling.  (engelsk)  // Natur klinisk praksis. Reumatologi. - 2008. - Bd. 4, nr. 9 . - S. 481-489. - doi : 10.1038/ncprheum0874 . — PMID 18665151 .
19. ↑ Church LD , Cook GP , McDermott MF Primer: inflammasomer og interleukin 1beta i inflammatoriske lidelser.  (engelsk)  // Natur klinisk praksis. Reumatologi. - 2008. - Bd. 4, nr. 1 . - S. 34-42. - doi : 10.1038/ncprheum0681 . — PMID 18172447 .
20. ↑ Magna M. , Pisetsky DS Celledødens rolle i patogenesen af ​​SLE: Er pyroptose det manglende led?  (engelsk)  // Scandinavian journal of immunology. - 2015. - Bd. 82, nr. 3 . - S. 218-224. - doi : 10.1111/sji.12335 . — PMID 26118732 .
21. ↑ Geng Y. , Ma Q. , Liu YN , Peng N. , Yuan FF , Li XG , Li M. , Wu YS , Li BL , Song WB , Zhu W. , Xu WW , Fan J. , Su L. Heatstroke inducerer leverskade via IL-1β og HMGB1-induceret pyroptose.  (engelsk)  // Journal of hepatology. - 2015. - Bd. 63, nr. 3 . - s. 622-633. - doi : 10.1016/j.jhep.2015.04.010 . — PMID 25931416 .
22. ↑ 1 2 Doitsh G. , Galloway NL , Geng X. , Yang Z. , Monroe KM , Zepeda O. , Hunt PW , Hatano H. , Sowinski S. , Muñoz-Arias I. , Greene WC Celledød ved pyroptose driver CD4 T-celleudtømning ved HIV-1-infektion.  (engelsk)  // Nature. - 2014. - Bd. 505, nr. 7484 . - S. 509-514. - doi : 10.1038/nature12940 . — PMID 24356306 .
23. ↑ Monroe KM , Yang Z. , Johnson JR , Geng X. , Doitsh G. , Krogan NJ , Greene WC IFI16 DNA-sensor er påkrævet for død af lymfoide CD4 T-celler mislykket inficeret med HIV.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 2014. - Bd. 343, nr. 6169 . - S. 428-432. - doi : 10.1126/science.1243640 . — PMID 24356113 .
24. ↑ Kuida K. , Lippke JA , Ku G. , Harding MW , Livingston DJ , Su MS , Flavell RA Ændret cytokineksport og apoptose hos mus med mangel på interleukin-1 beta-konverterende enzym.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 1995. - Bd. 267, nr. 5206 . - S. 2000-2003. — PMID 7535475 .

Litteratur

• Winkler S. , Rösen-Wolff A. Caspase-1: en integreret regulator af medfødt immunitet.  (engelsk)  // Seminarer i immunopatologi. - 2015. - Bd. 37, nr. 4 . - S. 419-427. - doi : 10.1007/s00281-015-0494-4 . — PMID 26059719 .