Cirkulært RNA ( eng. Circular RNA, circRNA ) er en type RNA- molekyler , hvis ender er lukket til hinanden ved hjælp af en kovalent binding mellem terminale nukleotider . CircRNA'er kan dannes ud fra introner eller fra looping ud af forskellige områder af det modne transkript . Selvom cirkulære RNA'er normalt klassificeres som ikke-kodende RNA'er , ophobes der nu beviser for, at de kan kode for peptider [1] . De specifikke funktioner af cirkulære RNA'er er ikke fuldt ud forstået, men de er sandsynligvis involveret i reguleringen af genekspression . Cirkulære RNA'er er særligt rigelige i hjernen og cirkulerer frit i blodplasma . Måske i fremtiden vil cirkulære RNA'er blive brugt som biomarkører for forskellige typer kræft .
Teoretisk kan cRNA opnås på tre forskellige måder. For det første, under splejsning , fjernes introner fra det modnende transkript ikke som et lineært fragment, men som en lasso. Hvis du skærer "halen" af denne lasso, får du cirkulært RNA. Sådanne introniske cirkulære molekyler akkumuleres hovedsageligt i kernen og betegnes ciRNA (fra det engelske cirkulære introniske lange ikke-kodende RNA'er ). For det andet kan individuelle exoner i det modne transkript sløjfes ud, og sådanne løkker kan udskæres af spliceosomet og kovalent lukkes til en ring. Sådan dannes cirkulære RNA'er, der kun består af én exon. Cirkulære RNA'er, som udelukkende består af exoner - en eller flere, er grupperet i ecircRNA-gruppen (fra det engelske exonic circRNAs ) og findes normalt i cytoplasmaet . For det tredje kan en region, der indeholder flere introner og exoner, gå ud. Når en sådan løkke udskæres og lukkes af et spliceosom, dannes cirkulære RNA'er indeholdende både exoner og introner. De er hovedsageligt lokaliseret i kernen og betegnes EIciRNA (fra det engelske exon-intron circRNAs ). Disse molekyler kan fortsætte med at splejse, og efter fjernelse af introner vil de producere cirkulære RNA'er bestående af flere exoner [2] .
Processen med excision af spliceosomet af looping sektioner af transkriptet kaldes backsplejsing . Ofte indeholder introner, der omgiver en exon, omvendte gentagelser komplementære til hinanden , som danner hydrogenbindinger og danner "stilken" af løkken. Looping kan forekomme med deltagelse af specielle proteiner : to monomerer af et sådant protein binder til de to ender af den fremtidige loop, dimeriserer og bringer enderne sammen, så spliceosomet kan kovalent tværbinde dem. Indtil videre kendes tre proteiner, der regulerer dannelsen af visse cirkulære RNA'er: Quaking (QKI), Muscleblind (Mbl/MBNL1-3) og Fusedinsarcoma ( FUS ). Muscleblind regulerer således dannelsen af circRNA af sit eget gen ved at binde sig til specifikke steder i intronerne af det umodne transkript. Derudover er cirRNA-dannelse afhængig af proteiner, der binder til umodent mRNA ved cRNA-udskæringssteder, hvilket gør dem utilgængelige for spliceosomet. Sammenfattende kan vi sige, at cRNA-biogenese er en kompleks proces, der reguleres af en kombination af mange faktorer, herunder placeringen af omvendte gentagelser og interaktion med proteiner, der medierer looping eller omvendt umuliggør backsplejsing [2] .
Interessant nok fortsætter rRNA - dannelsen i nogle archaea gennem stadiet af et cirkulært precursormolekyle, som derefter skæres i individuelle rRNA'er [3] .
Niveauet af cRNA -syntese varierer afhængigt af celletypen . I gennemsnit påvises de tilsvarende cirkulære RNA'er for 5-20% af de aktive gener, og en individuel celle indeholder samtidigt 5000-25.000 circRNA'er. De tegner sig dog for en meget lille del af transkriptomet : med sjældne undtagelser udgør circRNA'er 5-10% af mængden af lineære messenger-RNA'er syntetiseret fra det samme gen. Som regel transskriberes flere cirkulære RNA-isoformer fra ét gen, og oftest indgår genets anden exon i circRNA'et, mens den første og sidste exon næsten aldrig forbliver i den cirkulære form. Dannelsen af en eller anden isoform kan reguleres. Niveauet af circRNA-syntese varierer generelt meget under celledifferentiering , men det tager normalt flere dage eller endda uger for det at ændre sig væsentligt [2] .
I mangel af frie ender kan cirkulære RNA'er ikke nedbrydes af exonuklease- enzymer , som nedbryder mange transkripter ved vedvarende spaltning af terminale nukleotider. I denne henseende er det gennemsnitlige cirkulære RNA mere stabilt end lineært mRNA: circRNA lever i 19-24 timer (nogle gange op til 48 timer), hvilket er 2-5 (op til 10) gange længere end lineære molekylers levetid. Der er flere hypoteser om, hvordan cirkulære RNA'er nedbrydes. Cirkulære RNA'er kan spalte endonukleaser , som ikke ødelægger nukleinsyrer fra enderne, men introducerer brud i de indre dele af molekylet. Sandsynligvis, i dette tilfælde, er et kompleks indeholdende miRNA'er , som "inducerer" endonukleaser fra Argonaute -gruppen til at målrette molekyler, ansvarlig for ødelæggelsen. I circRNA'er, der skal nedbrydes, kan nogle adenosinrester methyleres specifikt . Sådanne methylerede RNA'er genkendes af specielle proteiner, der overfører dem til steder for nedbrydning af ribonukleinsyrer - de såkaldte P-legemer . I ødelæggelsen af circRNA kan specielle organeller være involveret - autophagosomer , der blandt andet indeholder endonukleaser. Celler kan frigive overskydende circRNA i blodet som en del af ekstracellulære vesikler . Hvis der er nogle eksperimentelle bekræftelser for den første hypotetiske vej til ødelæggelse af cirkulære RNA'er, så afventer de resterende modeller stadig deres eksperimentelle verifikation [2] .
De biologiske virkninger af både de cirkulære RNA'er selv og processen med deres dannelse er beskrevet. Derudover kan cirkulære RNA'er kode for peptider, der også udfører visse cellulære funktioner. Selvom backsplejsning, der fører til dannelsen af circRNA, er 100 gange sjældnere end almindelig lineær splejsning, er det sandsynligt, at disse to processer konkurrerer med hinanden og er gensidigt undertrykt. Det er muligt, at undertrykkelsen af lineær splejsning under dannelsen af cirkulære RNA'er er den primære cellulære funktion af disse molekyler. Looping ud af det umodne transkriptområde på grund af komplementær binding af inverterede gentagelser i introner kan i sig selv effektivt undertrykke lineær splejsning. Derudover kræver både tilbagesplejsning og lineær splejsning de samme områder af transkriptet; normalt er de involveret i en lineær proces, som i de fleste tilfælde undertrykker tilbagesplejsning. Det er faktisk blevet vist, at cirkulære RNA'er og almindelige lineære mRNA'er fra det samme gen ikke syntetiseres samtidigt. Eksperimentelle beviser tyder dog på et mere komplekst forhold mellem lineær og tilbagesplejsning end konventionel konkurrenceundertrykkelse. Det er muligt, at transkriptionshastigheden kan spille en vigtig rolle, hvor RNA vil blive læst fra genet - mRNA eller cirkulært. Alternativ splejsning fører således ofte til dannelsen af lassoholdige introner (dvs. mulige forstadier til cirkulært RNA), og dette sker ofte, når transkriptionen accelereres. Valget mellem backsplejsning og lineær splejsning kan også baseres på mere komplekse mekanismer. Det antages for eksempel, at det cirkulære RNA, som aflæses fra mbl-genet, overtager hele proteinproduktet af dette gen, Muscleblind. Det er kendt, at dette protein er nødvendigt for dannelsen af lineære mbl-mRNA'er, derfor, ved at binde sig til det og forhindre det i at fungere, hæmmer cirkulære mbl-RNA'er (circMbl) syntesen af deres lineære "brødre". Muligheden for komplementær binding af cirkulære RNA'er til de områder af generne, der gav anledning til dem, det vil sige til DNA , er heller ikke udelukket [2] .
En række eksperimenter tyder på, at EIciRNA (exon-intron) og ciRNA (intron) påvirker transkriptionen af deres egne gener ved at stimulere RNA-polymerase II . Forskerne var i stand til at præcipitere EIciRNA-komplekset med RNA-polymerase II ved hjælp af antistoffer , og det viste sig, at der er brug for en anden komponent for at stimulere polymerase - lille nuklear RNA U1 . Måske, når det interagerer med EIciRNA, er U1 placeret på en sådan måde, at det stimulerer polymerasen. Samtidig ser ciRNA'er ud til at være i stand til at binde direkte til kromatin i regionen af "forælder"-generne og øge hastigheden af deres transkription. Det var muligt at udfælde f.eks. ciRNA kaldet ci-ankrd52 i kompleks med en aktivt arbejdende RNA-polymerase II (den aktive form af enzymet udmærker sig ved en speciel phosphorylering af det C-terminale domæne ). Da ciRNA'er også kan binde til "fremmede" DNA-sekvenser, kan deres rolle i kontrollen af genekspression være betydelig [2] .
For to ecircRNA'er (eksoniske, lokaliseret i cytoplasmaet) er evnen til at påvirke proteinsyntese blevet eksperimentelt vist . circANRIL forstyrrer komplekset af proteiner, der behandler rRNA, og reducerer derved antallet af funktionelle ribosomer og proteinudbytte. Samtidig undertrykker circPABPN1 arbejdet i HuR -proteinet , hvilket er nødvendigt for translationen af en række mRNA'er [2] .
Cirkulære RNA'er kan tjene som et strukturelt grundlag for samlingen af proteinkomplekser og dermed give protein-til-protein- interaktioner . For eksempel gennem circ-Foxo3 interagerer cyclin-afhængig kinase 2 (Cdk2) med dets inhibitor , p21 , hvilket resulterer i cellecyklusstandsning . Derudover kan cirkulære RNA'er sekvestrere proteiner, hvilket begrænser deres bevægelse til job. Således kan førnævnte circ-Foxo3 "låse" transkriptionsfaktoren E2F1 og nogle andre proteiner i cytoplasmaet [3] .
Nogle exoniske cirkulære RNA'er indeholder bindingssteder for negative regulatorer af genekspression, mikroRNA'er. I den engelske litteratur omtales sådanne circRNA'er ofte som mikroRNA-svampe eller svampe, der absorberer mikroRNA'er. Ved at binde til dem kan mikroRNA'er ikke længere interagere med komplementære mål-mRNA'er og interferere med deres translation. For eksempel indeholder CDR1as cRNA 74 miR-7 mikroRNA-bindingssteder, og muse- cRNA aflæst fra Sry -genet (vigtigt for kønsbestemmelse ) indeholder 16 miR-138-bindingssteder. Det skal dog bemærkes, at kun få cirkulære RNA'er har vist sig at binde til mikroRNA'er, dvs. dette er undtagelsen snarere end reglen. Interessant nok er circRNA'er blevet fundet i nogle encellede eukaryoter , der slet ikke har mikroRNA'er, nemlig gæren Saccharomyces cerevisiae og malariaplasmodium Plasmodium falciparum . Binding til mikroRNA'er kan således ikke være hovedfunktionen af cirkulære RNA'er [2] .
En række cirkulære RNA'er spiller en vigtig rolle i antiviral immunitet . For eksempel producerer kyllinger , der er resistente over for aviær leukæmivirus 12 circRNA'er i større mængder end normale kyllinger. Mange af disse molekyler binder til mikroRNA'er, der regulerer ekspression af gener, der er forbundet med immunprocesser såsom B-lymfocytaktivering og antigenpræsentation . Mærkeligt nok påvirker immunsystemet også syntesen af cirkulære RNA'er. For eksempel stimulerer immunfaktorerne NF90 og NF110 (splejsningsvarianter af ILF3 -genet ) dannelsen af circRNA fra et modnende transkript i kernen. Under betingelserne for en virusinfektion går disse proteiner til cytoplasmaet, hvor de binder sig til viralt mRNA og hæmmer virussens livscyklus ; mængden af nuklear circRNA falder, hvilket kan modulere genekspression. CircRNA'er kan også deltage i undertrykkelsen af infektion ved at binde sig til virale eller cellulære miRNA'er, der interfererer med immunresponset [3] .
Det er kendt, at de fleste tilbagesplejsningshændelser involverer exoner og forekommer i RNA'et af proteinkodende gener. Translation af de fleste mRNA'er begynder med ribosomets genkendelse af et modificeret nukleotid i 5'-enden af mRNA'et, den såkaldte cap . CircRNA'er har ikke en fri 5'-ende, så de kan ikke have en hætte. Nogle cellulære og virale RNA'er kan dog oversættes i fravær af en cap med deltagelse af en speciel sekvens - IRES . Det samme kunne ske med cirkulære RNA'er [2] [3] .
Faktisk kunne kunstige circRNA'er indeholdende IRES og koder for noget peptid oversættes. Det har dog vist sig, at størstedelen af cirkulære RNA'er i levende celler ikke er forbundet med ribosomer, så deres translation er usandsynligt udbredt. Indtil videre er to cirkulære RNA'er kendt, som sandsynligvis vil syntetisere proteiner in vivo , disse er circMbl og circZNF609. Det er værd at bemærke, at disse molekyler er dannet noget ikke-standard: i det første tilfælde påvirker backsplejsing det første exon, som, som vi husker, normalt ikke er inkluderet i cirkulære RNA'er, og i det andet et fragment af 5' -utranslateret region af det originale transkript går ind i circRNA, som har egenskaberne IRES. Det er muligt, at proteinsyntese af circRNA kun er mulig under særlige forhold, for eksempel under stress — varmechok eller sult [2] .
Hvis vi antager, at noget cirkulært RNA indeholder en åben læseramme med et antal nukleotider, der er et multiplum af tre, så kan translationen af et sådant RNA teoretisk forløbe i henhold til den rullende ringmekanisme . Resultatet af en sådan translation ville teoretisk set være en endeløs kæde af gentagne blokke af aminosyrer , og dens vækst ville være begrænset af ribosomernes processivitet . Lignende tilfælde er endnu ikke kendt for cellulære cRNA'er, men noget lignende forekommer med viroid cRNA forbundet med risgul pletvirus [2] .
Nylige fremskridt inden for cRNA-detektion skyldes forbedringer i RNA-sekventeringsteknologi , såsom at øge længden af enkeltlæsninger forbedre algoritmer til at matche RNA til kendte gener og udvide RNA- biblioteker Cirkulære RNA'er kan skelnes fra lineære RNA'er ved hjælp af en bioinformatisk tilgang (baseret på sekventeringsresultater) eller en "våd" metode ved hjælp af exonukleaser. Som nævnt ovenfor spalter disse enzymer hurtigt lineære RNA'er, men efterlader cirkulære RNA'er upåvirket. Tusindvis af cirkulære RNA'er er blevet identificeret ved hjælp af exonukleaser, men de fleste circRNA'er er blevet beskrevet takket være high-throughput sekventering ved hjælp af specielle algoritmer [4] .
I øjeblikket er der flere databaser dedikeret til cirkulære RNA'er og onlineværktøjer til at arbejde med dem. Blandt dem [5] :
Cirkulære RNA'er findes i forskellige mængder i blodplasma, og i perifert blod er de endnu flere end i organceller . Årsagerne til dette er ikke klare, især i betragtning af det faktum, at circRNA'er i 25% serum nedbrydes efter kun 30 sekunder (gennemsnitligt cirkulært RNA eksisterer i cellen i 1-2 dage). Hvorom alting er, kan tilstedeværelsen og mængden af visse cirkulære RNA'er i blodplasma tjene som en vigtig indikator for kroppens sundhed. Med andre ord kan cRNA'er bruges som biomarkører til at diagnosticere og iscenesætte patologier såsom koronar hjertesygdom , forskellige former for cancer (herunder leukæmi ), diabetes og multipel sklerose [2] .
Nogle cirkulære RNA'er er forbundet med cellulær senescens . Således virker circPVT1 som en hæmmer af aldring af prolifererende fibroblaster [4] . En række cirkulære RNA'er er forbundet med aldersrelaterede ændringer i kroppen: for eksempel er molekyler forbundet med muskelaldring hos aber blevet identificeret [6] .
Til dato er 10 cirkulære RNA'er kendt for at være involveret i udviklingen af kardiovaskulære og metaboliske sygdomme (for eksempel diabetes mellitus). Det allerede nævnte circANRIL kan beskytte mod åreforkalkning ved at hæmme modningen af rRNA og derved hæmme celledeling , hvis overdrevne spredning fører til dannelsen af aterosklerotiske plaques . Et cirkulært RNA kaldet MICRA kan signalere venstre ventrikulær dysfunktion på grund af myokardieinfarkt . Ved hypertrofi af hjertet og hjertesvigt observeres et fald i syntesen af en række cirkulære RNA'er [2] .
Nogle cellulære RNA'er har vist sig at være forbundet med diabetes mellitus. Det er kendt, at overproduktion af miR-7 mikroRNA i pancreas β-celler bidrager til udviklingen af diabetes, mens overproduktion af ciRS -7, et cirkulært RNA, der binder miR-7, i disse celler tværtimod forbedrer insulinsekretionen [ 4] .
I nervevævet i forskellige organismer (fra frugtfluer til mennesker) findes især mange cirkulære RNA'er. Måske skyldes dette den større udbredelse af alternativ splejsning i neuroner . Derudover kan cirkulære RNA'er i dem udføre særlige funktioner relateret til ledning af nerveimpulser . Qki -proteinet , involveret i cirRNA-dannelse, er involveret i oligodendrocytudvikling og regulerer myelinisering , samt hæmmer dannelsen af dendritter i centralnervesystemet . Mutationer i genet for dette protein er forbundet med ataksi og skizofreni [2] . Der er også tegn på en sammenhæng mellem cirkulære RNA'er med Alzheimers sygdom [4] [6] .
Mere end 20 cRNA'er er blevet forbundet med udviklingen af forskellige kræftformer såsom tyktarms- , ovarie- , blære- , bryst- , lever- , mave- , nyre- og prostatacancer . Onkologiske processer er ofte ledsaget af translokationer , som fører til fremkomsten af tumorspecifikke circRNA-arter. Oftest fungerer cancer-associerede cRNA'er som svampe for miRNA'er [2] .