Riboswitch [1] ( eng. riboswitch ) er et element i den 5'-utranslaterede region (5'-UTR) af mRNA . Det udfører cis -regulering af mRNA'et, som det er placeret på, ved at binde til ligander - en række små molekyler , for eksempel cobamamid , thiaminpyrophosphat , lysin , glycin , flavinmononukleotid , guanin , adenin og andre. En typisk riboswitch omfatter to hoveddomæner : et aptamert domæne, der genkender og binder til en ligand, og en ekspressionsplatform , der interagerer med transkriptions- eller translationsproteiner. Aptamer-domænet og ekspressionsplatformen overlapper hinanden i området af den såkaldte switching-sekvens, som er ansvarlig for foldning af RNA til to gensidigt eksklusive sekundære strukturer , på grund af hvilke reguleringen udføres.
Riboswitches er blevet identificeret i repræsentanter for alle tre livsdomæner , såvel som i nogle vira [2] [3] .
Mange bakterier kan enten transportere de nødvendige små molekyler fra miljøet eller selv syntetisere dem fra simple forstadier. Hver af disse processer kræver et andet sæt proteiner , og bakterier bruger ofte en feedbackmekanisme til at kontrollere produkterne fra tidligere enzymatiske trin: et overskud af det ønskede produkt hæmmer enten sin egen syntese eller aktiverer efterfølgende enzymatiske trin. Normalt overvåges niveauet af cellulære metabolitter af specielle proteiner, der interagerer med DNA eller RNA , og regulerer syntesen af de tilsvarende enzymer. Af denne grund, da undertrykkelsen af gener til biosyntese af vitamin B 1 , B 2 og B 12 af sådanne forbindelser som henholdsvis thiamin , riboflavin og cobalamin blev opdaget, blev hovedindsatsen rettet mod søgningen efter passende repressorproteiner, som spore niveauet af disse forbindelser. Imidlertid er der ikke fundet sådanne hypotetiske modulatorer. Disse resultater henledte opmærksomheden på den mulige regulerende rolle af konserverede mRNA-sekvenser ("kasser") og fremsatte det dristige forslag, at det er muligt, at niveauet af disse vitaminderivater overvåges direkte af RNA. Derudover viste Grundy og Henkin [4] i 1998, at Salmonella typhimurium cob mRNA-lederregionen har signifikant forskellige konformationer i nærvær og fravær af adenosylcobalamin (AdoCbl). Forsøg på direkte at teste bindingen af cobalamin til mRNA har imidlertid ikke været succesfulde. Lignende resultater blev opnået med Escherichia coli btuB mRNA : tilsætning af AdoCbl fik revers transkriptase til at stoppe nær 3'-enden af mRNA lederregionen under in vitro primer forlængelse , hvilket tilsyneladende indikerer stabilisering af denne region efter binding til metabolitten [5] .
Endelig har tre vitaminderivater, thiaminpyrophosphat (TPP), flavinmononukleotid (FMN) og AdoCbl, vist sig at interagere direkte med deres respektive mRNA'er for at kontrollere vitamin B 1 , B 2 og B 12 operonerne . Disse rapporter har vist, at metabolitbinding stabiliserer konformationen af en evolutionært konserveret RNA-sensor (naturlig aptamer) og inducerer foldning af ikke-konserverede nedstrøms RNA-regioner til en struktur, der påvirker transkriptionel terminering eller translationsinitiering . Direkte binding af metabolitten til RNA forårsager således mRNA "riboswitch" mellem alternative konformationer, hvilket påvirker genekspression [5] . Udtrykket "riboswitch" blev foreslået i 2002 af Breaker og kolleger [4] .
Siden opdagelsen af de første vitaminspecifikke riboswitches er mange andre typer riboswitches blevet opdaget. Indtil videre er det blevet fastslået, at riboswitches kan reagere på puriner og deres derivater, proteincoenzymer og relaterede forbindelser, aminosyrer og fosforylerede sukkerarter . Nogle riboswitches reagerer specifikt på uorganiske ligander, herunder metaller ( Mg 2+ ioner ) , som tiltrækkes af den negativt ladede sukker-phosphat-rygrad i RNA og til negativt ladede fluoranioner [ 5] .
Funktionelt og strukturelt kan to domæner skelnes i riboswitches. Det første af disse, aptamer-domænet, er ansvarligt for ligandbinding og danner en ligandbindende lomme, der er egnet til en bestemt ligand. Det andet domæne, kendt som ekspressionsplatformen, indeholder et sekundært strukturskiftelement , der interagerer med transkriptionelle og translationelle regulatoriske proteiner. Aptamer-domænet og ekspressionsplatformen overlapper hinanden i området for omskiftningssekvensen, som udfører den regulatoriske funktion. Skiftsekvensen styrer ændringen af to gensidigt eksklusive strukturer af ekspressionsplatformen, som svarer til "on" og "off" tilstande af mRNA [2] .
På trods af den enorme variation af riboswitch-ligander er den regulatoriske aktivitet af langt de fleste bakterielle riboswitches rettet mod at ændre transkriptionen eller translationen af gener, der er ansvarlige for transporten og syntesen af denne metabolit. Denne regulatoriske aktivitet er baseret på det faktum, at RNA, afhængigt af tilstedeværelsen af en ligand, kan antage to gensidigt eksklusive konformationer. I tilfælde af transkription fungerer sådanne strukturer som Rho -uafhængig terminator eller anti-terminator hårnåle . I tilfælde af translation omfatter ligandafhængige omlejringer udadgående eller indadgående pakning af ribosombindingssteder ( riosombindingssted , RBS ) eller Shine -Dalgarno-sekvensen ( SD ) . Nylige undersøgelser har vist, at riboswitches kan mediere Rho-afhængig transkriptionel terminering. Denne reguleringsmekanisme ser ud til at være udbredt, da en række riboswitches mangler Rho-uafhængige terminatorer eller hårnåle, der fjerner RBS eller SD inde i molekylet [5] .
En usædvanlig reguleringsmåde bruger glmS ribozym ribozyme , som sikrer, at mRNA'et spaltes efter binding til metabolitten. Dette ikke-kodende RNA findes sædvanligvis i Gram-positive bakterier og interagerer med glucosamin -6-phosphat (GlcN6P), som efter binding til glmS mRNA skærer det ved riboswitchen. RNase J nedbryder derefter spaltningen startende ved 5'-OH-enden og forhindrer derved translation af glmS mRNA . Riboswitch-ribozym glmS bryder den traditionelle forestilling om, at en riboswitch kun genkender én forbindelse: denne riboswitch kan binde til en række relaterede forbindelser og kan derfor tjene til at vurdere en celles overordnede metaboliske status [5] [4] .
Nogle riboswitches kan være involveret i forskellige regulatoriske processer. Cyklisk diguanosyl-5'-monophosphat (c-di-GMP), en anden messenger , udløser en række fysiologiske ændringer, og dets tilsvarende riboswitches er placeret ved siden af gener involveret i cellemotilitet, virulens og andre processer. Nogle riboswitches, der fungerer med c-di-GMP, er placeret i nærheden af selvsplejsende gruppe I-introner . Disse RNA-regulatorer fungerer gennem en kompleks kaskade af begivenheder, der kræver deltagelse af begge regulatoriske regioner af RNA'et. c-di-GMP binder til sin aptamer og inducerer en foldændring, der tillader GTP at angribe 5'-enden af intronen . Som et resultat udskæres intronen, og RBS-regionerne, der er fjernt fra hinanden, nærmer sig hinanden og danner mRNA, der er i stand til translation. Denne kombinerede allosteriske interaktion af de to RNA-regioner resulterer i et to-punkts kontrolsystem, der genkender koncentrationerne af både c-di-GMP og GTP og udløser splejsning. Denne hypotese kræver eksperimentel bekræftelse [5] .
Efter opdagelsen af riboswitches blev det foreslået, at disse typiske cis - regulatoriske elementer også kan fungere som transregulatoriske elementer . Dette ser ud til at være sandt i det mindste for S-adenosylmethionin (SAM) riboswitcherne SreA og SreB Listeria monocytogenes . Efter SAM-afhængig afslutning af transkription binder disse riboswitches komplementært til den 5'-utranslaterede region (5'-UTR) af mRNA, der koder for PrfA virulensfaktoren og undertrykker dens ekspression på translationsniveau [5] .
I eukaryoter kræver afkoblingen af transkription og translation, såvel som tilstedeværelsen af introner, deltagelse af forskellige mekanismer til regulering af genekspression. Eukaryote thiaminpyrophosphat (TPP) riboswitches påvirker ikke transkription og/eller translation, men alternativ splejsning . "Normal" splejsning opstår, når et sted i en riboswitch placeret i et intergenisk sted eller 3'-UTR parrer komplementært med et sted, der spænder over et af splejsningsstederne. Dette sker i fravær af TRR. Produktet opnået efter splejsning omsættes til et komplet protein. Når TPP er til stede i en celle ved en tærskelkoncentration, binder det til riboswitchen, hvilket får et hidtil skjult splejsningssted til at komme til overfladen og bliver tilgængeligt for splejsningsapparatet. Afhængigt af arten indeholder det alternativt splejsede mRNA interne stopkodoner , der enten fører til translation af det forkerte peptid (filamentøse svampe ) eller til for tidlig afbrydelse af translation ( grønalger ). I højere planter resulterer alternativ splejsning i transkripter med for lange 3'-UTR'er, som destabiliserer dem [5] . Nogle gange kan riboswitches regulere både transkription og translation. SAM-I riboswitchen reagerer på ændringer i svovlkoncentrationen med dannelsen af antisense RNA , men detaljerne i reguleringsprocessen er stadig ukendte [4] .
Selvom velbeskrevne eukaryote riboswitches kun refererer til TPP-afhængige systemer, har en nylig undersøgelse vist tilstedeværelsen af adenosin-bindende RNA-aptamerer i hvirveldyrgenomer . Den biologiske rolle af disse RNA'er bliver stadig undersøgt. Nogle eukaryote mRNA'er kan reagere på miljøændringer ved at skifte fra en af de alternative konformationer til en anden, svarende til riboswitches. For eksempel, som reaktion på signaler fra interferon-y og hypoxi , forekommer en RNA-switch i 3'-UTR-mRNA'et af vaskulær endotelvækstfaktor -A (VEGF), hvilket påvirker translationen af VEGF i myeloidceller . Ændringen i konformation i dette tilfælde er imidlertid ikke forbundet med metabolitten, men med proteinbinding som reaktion på en ekstern stimulus [5] .
Riboswitches fungerer ikke altid som enkelte regulatoriske enheder. To sensoriske domæner eller hele riboswitches (i tilfælde af såkaldte tandem-riboswitches) er nogle gange ved siden af hinanden. For eksempel består mange glycinriboswitches af to glycinsensorer adskilt af en kort linkerindsats og kan antage en meget kompleks tertiær struktur. Selvom de to sensoriske domæner kan hjælpe hinanden med at folde og binde til en ligand, er det biologiske formål med en sådan duplikation endnu ikke entydigt fastlagt. Den biologiske rolle af tandem riboswitches med forskellige specificiteter er mere klar. De modulerer kun genekspression, når alle de nødvendige metabolitter er til stede i cellen. Regulatoriske veje medieret af riboswitches kan inkluderes i andre, endnu mere komplekse systemer til regulering af genekspression. For eksempel fungerer L. monocytogenes SAM-riboswitches kun ved temperaturer, der er tilladelige for infektion, når det tilstødende RNA-termometer ændrer sin konformation og smelter. Et andet eksempel er brugen af Enteroccus faecalis ethanolamine , hvor AdoCbl-riboswitchen virker i forbindelse med et regulatorisk protein, der påvirker stabiliteten af transkriptionsterminatorer [5] .
Riboswitches exceptionelle selektivitet skyldes udelukkende deres sensordomæners konservatisme. Ligandgenkendelsessteder varierer meget i størrelse og kompleksitet af sekundære og tertiære strukturer . For alle hovedklasserne af riboswitches, såvel som nogle underklasser, blev strukturer af sensoriske domæner opnået i kombination med de tilsvarende ligander, strukturer med høj opløsning blev opnået. Selvom riboswitches har meget forskellige konformationer (kun nært beslægtede purin-riboswitches viser en vis lighed), indeholder strukturen af de fleste riboswitches multi-helix-forbindelser og ribozym - lignende pseudoknots . Af denne grund kan de fleste riboswitches opdeles i to typer afhængigt af strukturen: den første type omfatter riboswitches, hvis struktur er repræsenteret ved forbindelser af flere helixer ("forbindelses-riboswitches"), og den anden type omfatter riboswitches med pseudoknoter i strukturen [5] .
"Forbindende" riboswitches kan opdeles i to undertyper, afhængigt af placeringen af nøglekrydset, hvor P1 regulatorisk helix er involveret. Den dækker sensordomænet og indeholder som regel et område, der gør det muligt at forbinde til forskellige strukturelle elementer. I type Ia riboswitches indtager den multiheliske forbindelse en central position og forbinder de resterende helixer med P1 helixen, der som regel deltager i mange interaktioner, der stabiliserer molekylets tertiære struktur. Dette er, hvad der sker i purin- og TPP-riboswitches. En af spiralerne kan være meget længere end de andre og er i stand til at bøje sig til den multihelix-forbindelse, hvor den danner tertiære interaktioner; sådan er lysin-riboswitchen indrettet - en af de største beskrevne riboswitch [2] . Metabolitbindende lommer dannes i eller i nærheden af multicoil junction, således at RNA binding til liganden direkte påvirker stabiliteten af hele multicoil junction og P1 helixen [5] .
Riboswitches af den anden type (Ib) er karakteriseret ved den "omvendte" arkitektur af forbindelserne, hvor den centrale multiheliske forbindelse er henvist til periferien af molekylet og er placeret langt fra P1-helixen. Helixen, der udgår fra krydset, bøjer mod P1 og stabiliserer den gennem tertiære interaktioner på lang afstand. Metabolitter binder til RNA ved krydset og/eller nær P1, hvilket påvirker dets dannelse gennem stabilisering af den overordnede konformation og tertiære interaktioner. Typiske repræsentanter for klasse Ib er tetrahydrofolat (THF) og magnesium riboswitches [5] .
Undertype II inkluderer sådanne riboswitches som SAM-II- og fluorriboswitches, hvis strukturer er fuldstændig repræsenteret af små pseudoknoter. Det er værd at understrege, at pseudoknots er vigtige dele af nogle "forbindelse" riboswitches, de kan være involveret i dannelsen af metabolitbindende lommer, som i tilfældet med glmS riboswitch-ribozym , såvel som dannelsen af langtrækkende tertiære obligationer, som i SAM-I riboswitch [5] .
Det bliver klart, at strukturen af riboswitchen og liganden ikke er relateret til hinanden. Desuden er der i de tre klasser af riboswitches, der genkender SAM, forskellige forbindende strukturelle elementer og pseudo-knuder. Ud over spiraler og pseudoknoter omfatter strukturelle elementer, der ofte findes i riboswitches, K-drejninger ( knæk-drejning, K-drejning ), kysse-løkke-interaktioner, sarcin-ricin-løkker og T-løkker [2] . Dette viser RNA's fantastiske evne til at antage forskellige konfigurationer for at genkende den samme ligand. Det er værd at bemærke, at mange riboswitches indeholder gentagne strukturelle motiver , der er til stede i andre naturlige og kunstige RNA'er. Ligesom andre funktionelle RNA'er bruger riboswitches disse motiver som grundlæggende byggesten til at konstruere komplekse rumlige strukturer [5] .
Riboswitches er i stand til at genkende ligander af en bred vifte af kemisk natur og deler ikke nogen fælles egenskaber, der tillader dem at binde til metabolitter. Der er dog en række fælles træk ved binding af ligander med riboswitches. De fleste riboswitches danner stive bindingslommer, der er ideelt egnede til binding af dele af genkendelige ligandstrukturer, og små ligander passer helt i sådanne lommer. Ligandbinding forårsager strukturelle ændringer i riboswitches [2] . Lommer er normalt omgivet af konserverede nukleotider og ikke-kanoniske basepar arrangeret i en forlænget uregelmæssig helix eller konvergerende helixer. Med nogle få undtagelser bruger de fleste ligander heteroatomer til at danne specifikke hydrogenbindinger og elektrostatiske interaktioner med RNA. Ofte dannes specifikke hydrogenbindinger mellem enderne af ligander og konserverede mismatchede RNA-nukleotider (f.eks. G40 i en aminopurinsensor). Plane grupper af ligander deltager som regel i stablingsinteraktioner og er klemt mellem RNA-puriner. Metalioner såsom Mg2 + og K + kan kompensere for den negative ladning af liganden eller dens funktionelle grupper såsom fluorid- , carboxyl- og fosfatrester . Metalioner er også involveret i ligand-RNA-interaktioner gennem direkte eller vand-medieret koordination. Alle disse egenskaber er blevet demonstreret i komplekser af riboswitches og deres korrekte ligander ved hjælp af røntgendiffraktionsanalyse af riboswitches, der ikke er forbundet med ligander, såvel som riboswitches forbundet med de korrekte ligander eller ligander, der ligner de korrekte. Disse undersøgelser konkluderede, at riboswitches binder til deres korrekte ligander ved hjælp af en kombination af "konformationel selektion" og inducerede formmekanismer. Riboswitches skelner lignende forbindelser hovedsageligt på grund af rumlige uoverensstemmelser, såvel som dannelsen af specifikke interaktioner. De fleste riboswitches er meget specifikke. For eksempel når forskellen i bindingen af en purin-riboswitch til adenin og guanin 10.000 gange, og lysin-riboswitchen genkender lysin og ornithin , som er meget ens i strukturen, med en forskel på 5.000 gange [2] . Interessant nok kan riboswitches af samme klasse målrettes til at genkende forskellige koncentrationer af den samme metabolit. De kan også afvige i termodynamiske og kinetiske parametre, med andre ord, de kan adskille sig i nærvær af ligevægt mellem RNA og naturlig ligand [5] .
Oprindelsen og udviklingen af riboswitches er et af de mest spændende problemer i studiet af RNA. In vitro eksperimenter har vist, at RNA relativt let kan tilpasse sig ligandbinding, så det tager relativt kort tid for naturlig selektion at omdanne RNA-sekvenser til metabolitbindende domæner. Mindre almindelige riboswitches kan være dukket op sent i evolutionens forløb. Flere af disse hændelser kunne give anledning til uafhængige klasser af riboswitches, der er specifikke for den samme forbindelse, såsom SAM. Samtidig vidner tilstedeværelsen af TPP-riboswitches i alle tre livsdomæner om den gamle oprindelse af denne type riboswitches og deres modstand mod evolutionært pres. Ifølge RNA-verdenshypotesen fungerede RNA på et tidspunkt både som en bærer af genetisk information og en katalysator for kemiske reaktioner. Den katalytiske evne af glmS riboswitch-ribozym , såvel som riboswitches evne til at interagere med "gamle" coenzymer såsom FMN, TPP og SAM, som sandsynligvis var udbredt i de tidligste biokemiske reaktioner, tyder på, at molekyler som riboswitches var værktøjer som sikrer eksistensen og udviklingen af den primære verden af RNA. Det er sandsynligt, at riboswitches var de regulerende elementer i RNA-verdenen. Riboswitches har overlevet den dag i dag, måske fordi de har udskåret en niche af metabolisk regulering, der er mere egnet til RNA end til proteiner. Samtidig er regulering ved hjælp af riboswitches mere energikrævende, da implementeringen kræver syntese af mRNA af det regulerede gen. Samtidig kræver regulering ved hjælp af riboswitches færre mellemtrin end regulering ved hjælp af specielle proteiner [5] [2] .
Baseret på principperne for drift af riboswitches udvikles nye, kunstige genetiske switches. For eksempel er det muligt at modificere aptameren og få et nyt kontrolelement, der genkender de stoffer, forskeren har brug for. Der er udviklet en kunstig riboswitch, der ikke kun genkender det nødvendige element, men også skærer sig selv, det vil sige, at den har ribozymaktivitet. Denne konstruktion blev kaldt "aptazim", den kan bruges i medicin til selvskæring af viralt mRNA i cellen og følgelig undertrykke ekspressionen af virusgener [6] . Riboswitches kan også finde anvendelse i genterapi [7] . Derudover kan riboswitches være meget nyttige i studiet af bakteriel biologi, for eksempel som et værktøj til at skabe kunstige mekanismer for genekspression [8] [9] . En anden retning i udviklingen af kunstige ribozymer er skabelsen af biosensorer, der som reaktion på binding til ligander udsender et eller andet påvisbart resultat, for eksempel et elektrokemisk signal eller fluorescens [4] [10] . Der er udviklet fluorescerende riboswitches, der gør det muligt at visualisere ændringer i metabolitkoncentrationer i bakterieceller [11] .
I 2016 blev oprettelsen af "termiske kontakter" rapporteret - integrationen af temperaturfølsomme RNA-termometre og riboswitch-aptamerer i en enkelt struktur. Termiske switche fungerer som riboswitches ved lave temperaturer og reagerer på binding med deres ligand ved at ændre strukturen, og ved høje temperaturer går de i en permanent "on" tilstand. Sådanne kunstige RNA-regulatorer kan bruges i vid udstrækning til at regulere genekspression [4] .
Riboswitches betragtes som et lovende mål for udviklingen af nye antibiotika . For eksempel binder stoffet roseoflavin direkte til FMN-riboswitch-aptameren, hvilket undertrykker ekspressionen af det tilsvarende gen i Bacillus subtilis . På samme måde hæmmer aminoethylcystein væksten af nogle gram-positive bakterier ved at binde sig til lysin-riboswitchen. Imidlertid reduceres den antimikrobielle aktivitet af ovennævnte forbindelser til ingenting ved mutationer i de tilsvarende riboswitches [4] . Der er riboswitches, der giver antibiotikaresistens . Aminoglycosid -riboswitchen er således placeret på mRNA'et af enzymerne aminoglycosid-acetyltransferase og aminoglycosid-nukleotidyltransferase, som giver resistens over for aminoglycosid-antibiotika. Når den er bundet til et aminoglykosid, aktiverer riboswitchen transskriptionen af disse enzymer, hvilket giver resistens over for aminoglykosid-antibiotika [12] .
| Typer af RNA | |
|---|---|
| Protein biosyntese | |
| RNA-behandling |
|
| Regulering af genekspression |
|
| cis-regulerende elementer | |
| Parasitiske elementer | |
| Andet |
|