Antisense RNA'er er enkeltstrengede RNA'er , der er komplementære til mRNA'et transskriberet i cellen eller til målgenet . Virkningsmekanismerne for antisense RNA'er er meget forskellige; de kan både undertrykke og aktivere ekspressionen af målgenet. Naturlige antisense RNA'er findes i både prokaryoter og eukaryoter [1] ; de henviser til lange ikke-kodende RNA'er som RNA'er længere end 200 nukleotider [2] . Syntetiske antisense RNA'er har fundet udbredt anvendelse blandt forskere som et værktøj til gen-knockdown . Antisense RNA'er finder også medicinske anvendelser [3] [1] [2] .
De første antisense RNA'er blev opdaget, mens man studerede funktionelle proteiner . For eksempel, når man studerede den ydre membran porin af Escherichia coli , blev det vist, at nogle promotorer af dette gen kan undertrykke ekspressionen af andre membran poriner, såsom ompF. Det viste sig, at en 300 nukleotider lang region placeret opstrøms for ompC-promotoren faktisk er involveret i suppression. Det er 70 % homologt med sekvensen af den 5'-terminale del af ompF mRNA'et , og transkriptet læst fra det (micF) kan binde til det på grund af komplementær interaktion. Det viste sig, at under stressforhold udtrykkes micF, som danner en dupleks med ompF-mRNA, hvilket forårsager dets nedbrydning [4] .
I modsætning til micF, som blev opdaget ved et tilfælde, blev de fleste antisense RNA'er opdaget under en målrettet genom-dækkende søgning efter små regulatoriske RNA'er og transkriptomanalyse . De fleste analysealgoritmer tager dog kun hensyn til intergene regioner, og antisense RNA'er, der læses fra DNA-strengen modsat skabelonen (kodende streng) i regionen af den kodende region, forbliver uovervejet. Oligonukleotid-arrays kan bruges til at påvise sådanne antisense - RNA'er . For at minimere antallet af falske positive resultater er der for nylig blevet aktivt udviklet metoder til at studere transkription, der er specifik for en af kæderne af ikke-kodende RNA, der interagerer med kromatin og RNA fra enkeltceller [1] .
Ideen om at bruge antisense RNA i medicin blev først foreslået i 1978, da Zamecnik og Stephenson opnåede antisense oligonukleotider komplementære til Rous sarcoma virus RNA . Det viste sig, at de undertrykte viral replikation og syntesen af virale proteiner. Siden da er en enorm indsats blevet afsat til udviklingen af medicinske anvendelser af antisense RNA. Det første lægemiddel af sin art, fomivirsen, blev godkendt af FDA i 1998. Det var beregnet til behandling af cytomegalovirus retinitis hos patienter med AIDS . Men i 2004 blev lægemidlet afbrudt på grund af tabet af markedet [5] .
De første antisense RNA'er blev fundet i bakterieceller . De blev kodet af plasmider , bakteriernes genomer og bakteriofager . For eksempel læses et antisense-RNA kendt som RNA I fra ColE1-plasmidet og spiller en vigtig rolle ved bestemmelse af kopiantallet af plasmiderne og kontrollerer deres replikation. Derudover kræves et andet antisense-RNA (RNA II) til replikation af ColE1-plasmidet. Det hybridiserer med DNA og fungerer som en primer for replikation og nedbrydes derefter af RNase H . Hvis RNA II ikke hybridiserer med ColE1 DNA, falder antallet af kopier af dette plasmid. I bakteriofag P22 regulerer antisense sar-RNA'et overgangen fra den lysogene til den lytiske cyklus ved at kontrollere ekspressionen af Ant-proteinet [6] . Antisense RNA'er er også blevet fundet i planter . Det mest undersøgte plante-antisense-RNA aflæses fra FLC -genet . I Arabidopsis thaliana svarer dette gen til en transkriptionsfaktor, der undertrykker ekspressionen af en række gener, der stimulerer blomstring . Under kolde forhold udtrykkes dette gens antisense RNA, kendt som COOLAIR. Det undertrykker FLC-ekspression ved at modificere kromatin, som inducerer blomstring [7] . I pattedyrsceller er et typisk eksempel på virkningen af antisense RNA'er inaktiveringen af X-kromosomet . Antisense RNA Xist tiltrækker det polycomb 2-repressive kompleks ( PRC2 ) til et af X-kromosomerne , hvilket forårsager dets heterochromatinisering [8] .
Antisense RNA'er kan klassificeres på forskellige måder. Nogle forfattere underinddeler dem i antisense RNA'er, der interagerer med RNA, med DNA og med proteiner [8] . De kan også klassificeres efter typen af promotor, hvorfra deres ekspression begynder: uafhængige promotorer, tovejs promotorer eller kryptiske promotorer. Længde kan også være en klassifikationsfaktor for antisense RNA'er. Mens de fleste antisense-RNA'er er over 200 nukleotider lange og derfor er lange ikke-kodende RNA'er, er nogle væsentligt kortere. Fordi de fleste af virkningsmekanismerne for antisense RNA'er er artsspecifikke , kan de også klassificeres efter art. Den mest almindelige klassificering af antisense-RNA'er er imidlertid baseret på, hvordan transkriptionen af disse RNA'er korrelerer med deres målgener [1] .
De cis - regulatoriske antisense RNA'er transskriberes på samme locus som mål-mRNA'et, men fra den modsatte DNA-streng. Af denne grund er de ofte næsten fuldstændig komplementære til målgenet. Hvis virkningen af cis - regulatoriske antisense-RNA'er er forbundet med mRNA, kan kun ét mRNA målrettes af ét antisense-RNA. Virkningen af sådanne antisense-RNA'er på mRNA udtrykkes ved at blokere ribosomets adgang til mRNA eller ved at tiltrække RNase , som ødelægger mRNA [4] . Blandt cis - regulatoriske antisense RNA'er er der også epigenetiske lyddæmpere og aktivatorer. De kan forårsage epigenetiske ændringer på det sted, hvorfra de blev transskriberet. De kan tiltrække kromatin-modificerende proteiner til mållocuset, hvilket kan påvirke ekspressionen af ikke kun målgenet, men også nabogener [8] .
Trans - regulatoriske antisense RNA'er transskriberes fra loci fjernt fra målgener. I modsætning til cis - regulatoriske RNA'er er de svagt komplementære til målgenet, men kan være længere end cis - regulatoriske RNA'er. De kan også målrette mod flere loci. På grund af ufuldstændig komplementaritet er komplekser af trans -regulatoriske antisense-RNA'er med måltranskripter ikke særlig stabile, og RNA- chaperoner er ofte påkrævet for funktionen af sådanne RNA'er . På grund af kompleksiteten af deres virkning betragtes transregulatoriske RNA'er næsten aldrig som potentielle lægemiddelmål [4] .
Mange antisense RNA'er undertrykker transkriptionen af målgener gennem epigenetiske mekanismer. For eksempel kan de forårsage DNA-methylering , som ofte er forbundet med sygdom. Ved alfa-thalassæmi undertrykkes ekspressionen af hæmoglobin -al-genet ( HBA1 ) således af det unormale transkriptom af LUC71-genet. Det fungerer som et antisense-RNA og inducerer methylering af HBA1-promotoren. Ved akut lymfatisk leukæmi og akut myeloid leukæmi dæmpes tumorsuppressorgenet p15INK4b . Det er forårsaget af antisense RNA ANRIL , der læses fra samme locus som p15INK4b [8] . Antisense RNA'er kan også forårsage histonmethylering , hvilket kan føre til både undertrykkelse og aktivering af gener [9] . For eksempel udløser ANRIL ikke kun DNA-methylering, men undertrykker også de tilstødende CDKN2B og CDKN2A gener og rekrutterer PRC2 til dem, hvilket introducerer et undertrykkende epigenetisk mærke (H3K27me). Et andet eksempel er inaktiveringen af X-kromosomet hos pattedyr med antisense RNA Xist [1] . Ændringer i kromatin forårsaget af antisense RNA'er kan også være trans - regulerende. Hos pattedyr læses for eksempel HOTAIR antisense RNA fra homeobox C (HOXC) genet, men rekrutterer PRC2 til HOXD. HOTAIR udtrykkes aktivt i primære brystkræftceller [1] .
Antisense RNA'er kan være involveret i reguleringen af genekspression, ikke kun på stadiet af transkriptionsinitiering, men også ved dets forlængelse og terminering. For eksempel forekommer tovejs transkription nogle gange i prokaryoter og eukaryoter, når to RNA-polymeraser læser det samme gen fra modsatte strenge. Til sidst støder de sammen, hvilket fører til for tidlig afbrydelse af transskription. Selv hvis polymeraser bevæger sig langsomt og sandsynligvis ikke vil kollidere, kan de stoppe og afslutte transkriptionsforlængelsen for tidligt, hvilket også fører til gendæmpning. Ved denne mekanisme undertrykkes IME4-genet af antisense RME2-RNA'et. Antisense RNA'er kan også forstyrre splejsning . For eksempel kræver translation af ZEB2 mRNA'et en IRES placeret i en af intronerne . Når antisense RNA fra dette gen udtrykkes, maskerer det splejsningsstedet, hvilket forhindrer IRES i at blive fjernet fra transkriptet, hvilket muliggør effektiv translation. Endelig kan niveauet af antisense RNA-ekspression påvirke, hvilke isoformer af sense-transkriptet der syntetiseres [1] .
Antisense-RNA'er kan virke post-transkriptionelt, nemlig direkte påvirke translationen af mål-mRNA'et. De kan blokere ribosomadgang til mRNA eller tiltrække RNase H til mRNA. Nogle gange har antisense-RNA'er dog en positiv effekt på translation [1] .
Som regulatoriske elementer, der virker meget specifikt, kan antisense RNA'er være lovende lægemiddelmål. Derudover er meget få antisense RNA- molekyler nødvendige for at opnå den ønskede effekt , hvilket gør dem endnu mere bekvemme mål. Ideen om en specifik stigning i ekspressionen af et målgen på grund af undertrykkelsen af det tilsvarende antisense RNA er ved at blive aktivt udviklet. På grund af design af lægemidler , er det meget lettere at skabe en inhibitor end en aktivator. I nogle tilfælde er det imidlertid nødvendigt at øge ekspressionen af et målgen, for eksempel et tumorsuppressorgen. Dette kan opnås ved at undertrykke det tilsvarende antisense RNA. I tilfælde, hvor undertrykkelse af målgenet er påkrævet, kan antisense-RNA'et selv fungere som et terapeutisk middel. Imidlertid vil RNA'er introduceret i cellen hurtigt blive ødelagt af RNaser, så det er nødvendigt at beskytte dem mod nedbrydning. Oftest opnås dette gennem kemiske modifikationer, såsom tilsætning af phosphorthioat . Imidlertid kan phosphorthioat-modifikation fremkalde betændelse . Derudover kan antisense RNA'er have meget alvorlige bivirkninger. På trods af specificiteten af endogene antisense RNA'er virker kun 10-50% af de syntetiske oligonukleotider på målgenet. Dette skyldes sandsynligvis det faktum, at den native rumlige struktur af antisense RNA'er spiller en vigtig rolle i målgenkendelse og beskyttelse mod RNaser. Substitution af kun ét nukleotid kan i høj grad ændre molekylets struktur og påvirke dets interaktion med målet. Endelig trænger kunstige antisense RNA'er meget dårligt ind i cellerne. Neuroner og gliaceller absorberer med succes nøgne oligonukleotider, men levering af antisense RNA'er til andre typer celler kræver udvikling af specielle bærere, såsom lipidvesikler eller specielle vira [2] .
Det aktuelt anvendte antisense RNA-lægemiddel er mipomersen , godkendt af FDA i 2013. Det blev udviklet til at regulere niveauet af kolesterolholdige lavdensitetslipoproteiner i blodet hos patienter, der lider af homozygot familiær hyperkolesterolæmi , en sjælden autosomal dominant genetisk sygdom [10] .
For flere detaljer, se litteraturen til artiklen RNA-terapi ).
| Typer af RNA | |
|---|---|
| Protein biosyntese | |
| RNA-behandling |
|
| Regulering af genekspression |
|
| cis-regulerende elementer | |
| Parasitiske elementer | |
| Andet |
|
| Nukleinsyretyper _ | ||||
|---|---|---|---|---|
| Nitrogenholdige baser | ||||
| Nukleosider | ||||
| Nukleotider | ||||
| RNA | ||||
| DNA | ||||
| Analoger | ||||
| Vektortyper _ |
| |||
| ||||