Kosmider

Cosmider (Cosmides) - plasmider indeholdende et DNA- fragment af lambda-fagen inklusive cos - sektionen [1] . Sammen med pakningssystemer til fagpartikler in vitro bruges de som vektormolekyler til genkloning og til konstruktion af genomiske biblioteker. Kosmider blev først konstrueret af Collins og Brüning i 1978 [2] . Deres navn kommer fra forkortelsen af ​​to udtryk: cos -section (selve udtrykket kommer igen fra den engelske co hesive end s  - sticky ends) og plasmid .

Cosmider kan anvendes til at klone 32-47 kb DNA-segmenter. Plasmider, hvis du kloner i dem DNA-sektioner større end 4-5 kb. blive ustabil på grund af en stigende tendens til at rekombinere . Derudover pakkes cosmider i fagpartikler, hvilket gør det muligt at levere dem til bakterier ved hjælp af transduktion .

Plot Cos

Cos -regionen består af ~200 basepar og er nødvendig for at pakke cosmidet til en fagpartikel. Den indeholder et cosN- sted , hvor enzymterminasen laver et enkeltstrengsbrud af hver af DNA-strengene i en afstand på 12 bp. fra hinanden. Det cykliske kosmid lineariseres for at danne 12 bp klæbrige ender. (DNA skal være lineært for at komme ind i fagens hoved). CosB - stedet holder terminasen, mens det skærer DNA'et. CosQ -stedet på det næste cosmid (fordi rullende ringreplikation ofte fører til dannelsen af ​​concatemerer ) bibeholdes af terminasen, efter at det forrige cosmid er blevet pakket. Dette gør det muligt at beskytte lineære cosmider mod spaltning af DNaser.

Kosmidernes struktur

I det væsentlige er cosmidet DNA'et fra lambda-fagen , hvorfra alle gener er blevet fjernet, undtagen cos -stedet. Kosmidet er omkring 5 kb stort.og inkluderer nødvendigvis følgende elementer: et cos -sted, der kræves til pakning i lambda-fag- virioner , et oprindelsessted for replikation i en bakteriel eller eukaryotisk celle, restriktionsendonuklease -genkendelsessteder og et markørgen (f.eks. et gen for resistens over for ethvert antibiotikum ) [3] .

Cosmider kan anvendes til at klone 32-47 kb DNA-segmenter. For at gøre dette behandles cosmidet og det fremmede DNA med den samme restriktionsendonuklease, hvorefter de resulterende lineære fragmenter blandes og en ligeringsreaktion udføres. Derefter pakkes DNA'et i faghoveder in vitro , det skæres i cos -sites. De nødvendige virale proteiner opnås fra lysatet af E. coli cI857 ( rød - gam - Sam og Dam (hoved) og Eam (hale)). Denne proces ledsages af udvælgelsen af ​​fragmenter efter størrelse, da kun DNA med en længde på 78-105% af lambda-faggenomet kan pakkes. Således vil overvejende rekombinante cosmider indeholdende en klonet DNA-region komme ind i virionerne. Ligeringsprodukterne mellem to kosmider vil være for små til pakning, og mellem to fragmenter af fremmed DNA vil de være store.

De resulterende fagpartikler med rekombinante cosmider anvendes til at inficere E. coli-celler. I cytoplasmaet ringsluttes cosmider ved sticky-end-binding og virkningen af ​​enzymet ligase , og replikeres derefter som almindelige plasmider uden at udvise nogen af ​​egenskaberne af en lambda-fag. Udvælgelsen af ​​transformerede celler udføres i overensstemmelse med markørgenet, der er til stede i vektormolekylet.

Ændringer

Da cosmider gør det muligt at klone relativt store dele af DNA, er de praktiske vektorer til at skabe biblioteker af eukaryote genomfragmenter opnået ved delvis fordøjelse med restriktionsendonukleaser . Produkterne fra en sådan spaltning kan dog være af forskellig størrelse, og der er tilfælde, hvor to relativt små fragmenter, der ikke var tilstødende i genomet, ligeres, og den tilsvarende klon dannes, hvilket vil give et forkert indtryk af deres position i kromosomerne . Dette problem kan overvindes ved at fraktionere de delvise fordøjelsesprodukter efter størrelse. Selv denne metode undgår imidlertid ikke fuldstændigt fremkomsten af ​​cosmidkloner indeholdende flere ligerede DNA-fragmenter, så andre metoder er blevet foreslået, især dephosphorylering af fremmede DNA-fragmenter, så de ikke kan kombineres med hinanden. Særlige kosmidvektorer pJB8 (Burke og Ish-Horowicz, 1981) og c2XB (Bates og Swift, 1983) er også blevet skabt, ved hjælp af hvilke sandsynligheden for dannelse af falske kloner minimeres.

Moderne cosmider af pWE- og sCos-serien er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​adskillige kloningssteder omgivet af fagpromotorer og unikke genkendelsessteder af restriktionsendonukleaserne Not I, Sac II og Sfi I, som tillader ét enzym at skære insertet ud.

Noter

1. ↑ Hohn Barbara, Murray Kenneth. Pakning af rekombinante DNA-molekyler til bakteriofagpartikler in vitro   // Proc . Nati. Acad. sci. USA: tidsskrift. - 1977. - August ( bind 74 , nr. 8 ). - P. 3259-3263 . - doi : 10.1073/pnas.74.8.3259 .
2. ↑ Collins John, Hohn Barbara.  Cosmider: en type plasmid-genkloningsvektor, der kan pakkes in vitro i bakteriofag lambda-hoveder  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America  : journal. - 1978. - 1. september ( bind 75 , nr. 9 ). - P. 4242-4246 . - doi : 10.1073/pnas.75.9.4242 .
3. ↑ Kosmider . Philip McClean. Hentet 4. april 2014. Arkiveret fra originalen 26. marts 2014. (ubestemt)

Kilder

• Primrose SB, Twyman RM, Old RW Principles of Gene Manipulation  (neopr.) . — 6. — Wiley-Blackwell , 2002. — ISBN 0632059540 .
• Griffiths AJF, Wessler SR, et al. En introduktion til genetisk analyse  (neopr.) . — 8. — W. H. Freeman, 2004. - ISBN 978-0716749394 . Arkiveret 26. februar 2015 på Wayback Machine
• Bruce A. Voyles (2002) The biology of viruses 2. udg. ISBN 0-07-237031-9
• Stryer, Lubert (1995) Biochemistry 4. udg. ISBN 0-7167-2009-4
• Eurekah Biosciences Collection: Viruses, @NCBI

Ordbøger og encyklopædier	Britannica (online)