Polymerase kædereaktion

Polymerasekædereaktion ( PCR ) er en metode til molekylærbiologi, der gør det muligt at opnå en signifikant stigning i små koncentrationer af visse nukleinsyrefragmenter ( DNA eller RNA ) i biologisk materiale (prøve).

Ud over DNA- amplifikation tillader PCR mange andre manipulationer med nukleinsyrer (introduktion af mutationer , splejsning af DNA-fragmenter) og bruges i vid udstrækning i biologisk og medicinsk praksis, for eksempel til at diagnosticere sygdomme (arvelige, smitsomme), for at fastslå faderskab , at klone gener , at isolere nye gener .

Historie

I begyndelsen af ​​1970'erne foreslog den norske videnskabsmand Kjell Kleppe fra nobelpristageren Hara Gobinda Koranas laboratorium en metode til DNA- amplifikation ved hjælp af et par korte enkeltstrengede DNA-molekyler - syntetiske primere [1] . Men på det tidspunkt forblev denne idé urealiseret. Polymerasekædereaktionen (PCR) blev opfundet i 1983 af den amerikanske biokemiker Kary Mullis [2] [3] . Hans mål var at skabe en metode, der ville tillade amplifikation af DNA under flere på hinanden følgende duplikationer af det originale DNA-molekyle ved hjælp af DNA-polymerase -enzymet . Den første publikation om PCR-metoden udkom i november 1985 i tidsskriftet Science [4] . Metoden har revolutioneret molekylærbiologi og medicin. I 1993 modtog Kary Mullis Nobelprisen i kemi for dette [5] .

Ved begyndelsen af ​​brugen af ​​metoden, efter hver opvarmning-afkølingscyklus, skulle DNA-polymerase tilsættes til reaktionsblandingen , da den blev inaktiveret ved den høje temperatur, der var nødvendig for at adskille strengene af DNA-helixen. Reaktionsproceduren var relativt ineffektiv og krævede meget tid og enzym. I 1986 blev polymerasekædereaktionsmetoden væsentligt forbedret. Det er blevet foreslået at anvende DNA-polymeraser fra termofile bakterier [6] . Disse enzymer viste sig at være termostabile og var i stand til at modstå mange reaktionscyklusser. Deres brug gjorde det muligt at forenkle og automatisere PCR. En af de første termostabile DNA-polymeraser blev isoleret fra Thermus aquaticus -bakterier og fik navnet Taq - polymerase . Ulempen ved denne polymerase er den ret høje sandsynlighed for at introducere et fejlagtigt nukleotid, da dette enzym mangler fejlkorrektionsmekanismer (3'→5' - exonukleaseaktivitet ). Polymeraser Pfu og Pwo , isoleret fra archaea , har en sådan mekanisme; deres brug reducerer markant antallet af mutationer i DNA, men hastigheden af ​​deres arbejde (processivitet) er lavere end Taq . Blandinger af Taq og Pfu bruges nu til at opnå både høj polymerisationshastighed og høj kopinøjagtighed.

På tidspunktet for opfindelsen af ​​metoden arbejdede Kary Mullis som syntetisk kemiker (han syntetiserede oligonukleotider, som derefter blev brugt til at påvise punktmutationer ved hybridisering med genomisk DNA) hos Cetus Corporation , som patenterede PCR-metoden. I 1992 solgte Cetus rettighederne til metoden og patentet på brugen af ​​Taq - polymerase til Hofmann-La Roche for 300 millioner dollars. Det viste sig dog, at Taq - polymerase blev karakteriseret af de sovjetiske biokemikere A. Kaledin , A. Slyusarenko og S. Gorodetsky i 1980 [7] , og også 4 år før denne sovjetiske publikation, altså i 1976, af de amerikanske biokemikere Alice Chien, David B. Edgar og John M. Trela ​​[8] . Som et resultat forsøgte Promega at tvinge Roche til at afgive sine eksklusive rettigheder til dette enzym [9] i retten . Det amerikanske patent på PCR-metoden udløb i marts 2005.

Udførelse af PCR

Metoden er baseret på multipel selektiv kopiering af et bestemt afsnit af DNA -nukleinsyre ved hjælp af enzymer under kunstige betingelser ( in vitro ). I dette tilfælde kopieres kun det område, der opfylder de specificerede betingelser, og kun hvis det er til stede i prøven under undersøgelse. I modsætning til DNA-amplifikation i levende organismer ( replikation ) amplificeres relativt korte DNA- strækninger ved PCR . I en konventionel PCR-proces er længden af ​​replikerede DNA-regioner ikke mere end 3000 basepar (3 kbp [10] ). Ved hjælp af en blanding af forskellige polymeraser, ved brug af additiver og under visse betingelser kan længden af ​​et PCR-fragment nå 20-40 tusinde basepar. Dette er stadig meget mindre end længden af ​​det kromosomale DNA i en eukaryot celle. For eksempel er længden af ​​det korteste nukleare kromosom hos mennesker (kromosom 21) 46,71 millioner basepar [11] .

Reaktionskomponenter

Til PCR kræves i det enkleste tilfælde følgende komponenter:

• DNA-skabelon, der indeholder den del af DNA, der skal amplificeres .
• To primere , der er komplementære til modsatte ender af forskellige strenge af det ønskede DNA-fragment.
• Termostabil DNA-polymerase  er et enzym , der katalyserer polymeriseringen af ​​DNA. Polymerase til brug i PCR skal forblive aktiv ved høj temperatur i lang tid, derfor anvendes enzymer isoleret fra termofile - Thermus aquaticus ( Taq polymerase ), Pyrococcus furiosus ( Pfu polymerase), Pyrococcus woesei ( Pwo polymerase ), Thermus thermophilus ( Tth -polymerase) og andre.
• Deoxyribo nukleosidtriphosphater (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Mg 2+ ioner nødvendige for at polymerase kan virke.
• Bufferopløsning, der giver de nødvendige reaktionsbetingelser - pH , opløsningens ionstyrke . Indeholder salte, bovint serumalbumin .

For at undgå fordampning af reaktionsblandingen tilsættes en højtkogende olie, såsom vaseline, til reagensglasset. Hvis der anvendes en opvarmet lågcykler, er dette ikke påkrævet.

Tilsætning af pyrophosphatase kan øge PCR-udbyttet. Dette enzym katalyserer hydrolysen af ​​pyrophosphat , et biprodukt af tilsætningen af ​​nukleosidtriphosphater til den voksende DNA-streng, til orthophosphat . Pyrophosphat kan hæmme PCR [12] .

Primere

Specificiteten af ​​PCR er baseret på dannelsen af ​​komplementære komplekser mellem template og primere , korte syntetiske oligonukleotider på 18-30 baser lange. Hver af primerne er komplementære til en af ​​kæderne i den dobbeltstrengede template og begrænser begyndelsen og slutningen af ​​den amplificerede region.

Efter hybridisering af templaten med primeren (annealing [13] ) tjener sidstnævnte som en primer for DNA-polymerase under syntesen af ​​den komplementære streng af templaten (se nedenfor ).

Den vigtigste egenskab ved primere er smeltetemperaturen ( Tm ) af primer-matrix-komplekset.

Tm er  den temperatur, ved hvilken halvdelen af ​​DNA-skabelonerne danner et kompleks med oligonukleotidprimeren. Den gennemsnitlige formel til beregning af Tm for et kort oligonukleotid (og for lange DNA-fragmenter), under hensyntagen til koncentrationen af ​​K + -ioner og DMSO :

hvor  er antallet af nukleotider i primeren,  er den molære koncentration af kaliumioner,  er summen af ​​alle guaniner og cytosiner .

Hvis længden og nukleotidsammensætningen af ​​primeren eller annealingstemperaturen er valgt forkert, er dannelsen af ​​delvist komplementære komplekser med andre områder af template-DNA'et mulig, hvilket kan føre til fremkomsten af ​​uspecifikke produkter. Den øvre grænse for smeltetemperaturen er begrænset af den optimale virkningstemperatur for polymerasen, hvis aktivitet falder ved temperaturer over 80 °C.

Når du vælger primere, er det ønskeligt at overholde følgende kriterier:

• GC sammensætning ~ 40-60%;
• tætte Tm - primere (forskelle ikke mere end 5 °C) ;
• fraværet af uspecifikke sekundære strukturer - hårnåle [15] og dimerer [16] ;
• guanin eller cytosin er ønskeligt i 3'-enden , da de danner tre hydrogenbindinger med template-molekylet, hvilket gør hybridisering mere stabil.

Forstærker

PCR udføres i en forstærker  - en enhed, der giver periodisk køling og opvarmning af reagensglas, normalt med en nøjagtighed på mindst 0,1 ° C. Moderne cyclers giver dig mulighed for at indstille komplekse programmer, herunder muligheden for "hot start", Touchdown PCR (se nedenfor) og efterfølgende opbevaring af amplificerede molekyler ved 4 °C. Til real-time PCR produceres enheder udstyret med en fluorescerende detektor. Instrumenter fås også med automatisk låg og mikropladerum, så de kan integreres i automatiserede systemer.

Reaktionens forløb

Ved udførelse af PCR udføres typisk 20-35 cyklusser, som hver består af tre trin. [≡]

Denaturering

Den dobbeltstrengede DNA-skabelon opvarmes til 94-96°C (eller 98°C, hvis der anvendes en særlig termostabil polymerase) i 0,5-2 minutter så DNA-kæderne spredes. Dette trin kaldes smeltning ( denaturering ), da hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge brydes. Normalt, før den første cyklus, udføres en lang opvarmning af reaktionsblandingen i 2-5 minutter for fuldstændig denaturering af skabelonen og primerne.

Udglødning

Når strengene adskilles, sænkes temperaturen for at tillade primerne at binde til den enkeltstrengede skabelon. Denne fase kaldes udglødning . Udglødningstemperaturen afhænger af sammensætningen af ​​primerne og vælges normalt 5 grader lavere end primernes smeltetemperatur. Forkert valg af annealingstemperatur fører enten til dårlig binding af primere til skabelonen (ved forhøjet temperatur) eller til binding på det forkerte sted og fremkomsten af ​​uspecifikke produkter (ved lav temperatur). Udglødningsfasetid - 30 sekunder Samtidig har polymerasen i løbet af denne tid allerede tid til at syntetisere flere hundrede nukleotider. Derfor anbefales det at vælge primere med et smeltepunkt over 60°C og udføre annealing og forlængelse samtidigt ved 60-72°C.

Forlængelse

DNA-polymerase replikerer skabelonstrengen ved at bruge primeren som en primer. Dette er forlængelsesstadiet . Polymerasen starter syntesen af ​​den anden streng fra 3'-enden af ​​primeren, som er bundet til skabelonen, og bevæger sig langs skabelonen og syntetiserer en ny streng i retningen fra 5'- til 3'-enden. Forlængelsestemperaturen afhænger af polymerasen. De almindeligt anvendte Taq- og Pfu- polymeraser er mest aktive ved 72°C. Forlængelsetiden afhænger både af typen af ​​DNA-polymerase og af længden af ​​det fragment, der amplificeres. Typisk tages forlængelsestiden til at være et minut for hvert tusinde basepar. Efter afslutningen af ​​alle cyklusser udføres ofte et yderligere trin af endelig forlængelse for at fuldende alle enkeltstrengede fragmenter. Denne fase varer 7-10 minutter.

Mængden af ​​et specifikt reaktionsprodukt (begrænset af primere) stiger teoretisk i forhold til 2n  - 2n, hvor n er antallet af reaktionscyklusser [17] . Faktisk kan effektiviteten af ​​hver cyklus være mindre end 100 %, så i virkeligheden er P ~ (1 + E) n , hvor P er mængden af ​​produkt, E er den gennemsnitlige effektivitet af cyklussen.

Antallet af "lange" DNA-kopier vokser også, men lineært, så et specifikt fragment dominerer i reaktionsprodukterne.

Væksten af ​​det nødvendige produkt er eksponentielt begrænset af mængden af ​​reagenser, tilstedeværelsen af ​​inhibitorer og dannelsen af ​​biprodukter. I de sidste cyklusser af reaktionen aftager væksten, dette kaldes "plateaueffekten".

PCR-varianter

• RPA ( Recombinase Polymerase Amplification  - recombinase polymerase amplification ) - bruges, hvor DNA/RNA-amplifikation er nødvendig inden for 15 minutter uden en termisk cykler (isotermisk reaktion) [18] [19] .
• Nested PCR  ( Nested PCR ) - bruges til at reducere antallet af biprodukter af reaktionen. Brug to par primere og udfør to på hinanden følgende reaktioner. Det andet par primere amplificerer DNA-regionen i produktet af den første reaktion.
• Inverteret PCR  (omvendt PCR) - bruges, hvis kun et lille område er kendt inden for den ønskede sekvens. Denne metode er især nyttig, når det er nødvendigt at bestemme nabosekvenser efter DNA er blevet indsat i genomet. Til implementering af inverteret PCR udføres en række snit af DNAmed restriktionsenzymerefterfulgt af forbindelsen af ​​fragmenter (ligering). Som et resultat er kendte fragmenter i begge ender af den ukendte region, hvorefter PCR kan udføres som normalt.
• Revers Transcription PCR ( RT-PCR ) bruges til at amplificere, isolere eller identificere en kendt sekvens fra et RNA-bibliotek. Før konventionel PCR syntetiseres et enkeltstrenget DNA-molekyle på mRNA -skabelonen ved hjælp af reversetase , og der opnås et enkeltstrenget cDNA , som bruges som skabelon til PCR. Denne metode bestemmer ofte, hvor og hvornårdisse gener kommer til udtryk .
• Asymmetrisk PCR  (asymmetrisk PCR) - udføres, når det er nødvendigt at amplificere hovedsageligt en af ​​kæderne i det oprindelige DNA. Anvendes i noglesekventerings-oghybridiseringsanalyseteknikker. PCR udføres som normalt, bortset fra at en af ​​primerne tages i stort overskud. En modifikation af denne metode erLinearAfter - The - E xponential - PCR (LATE-PCR)matchesmed et højere (smeltepunkt) end højkoncentrationsprimeren. PCR udføres ved en høj annealingstemperatur, hvorved effektiviteten af ​​reaktionen opretholdes gennem alle cyklusser [20] .
• Kvantitativ PCR ( kvantitativ PCR, Q-PCR ) eller real-time PCR  ( real-time polymerase chain reaction ), bruges til direkte at overvåge målingen af ​​mængden af ​​et bestemt PCR-produkt i hver reaktionscyklus. Denne metode bruger fluorescensmærkede DNA-prober til at analysere akkumuleringen af ​​reaktionsproduktet eller det interkalerende farvestof SYBR Green (eller dets analoger). Sybr Green I giver en enkel og omkostningseffektiv mulighed for real-time PCR-detektion og kvantificering af PCR-produkter uden behov for specifikke fluorescerende prober eller primere. Under amplifikationeninkorporeres SYBR Green I -farvestoffet i den mindre rille af DNA'et i PCR-produkterne og udsender et stærkere fluorescerende signal end det ubundne farvestof, når det bestråles med en blå laser. SYBR Green I er kompatibel med alle i øjeblikket kendte real-time PCR-instrumenter. Absorptionsmaksimum for SYBR Green I er ved en bølgelængde på 494 nm. Ud over den vigtigste er der to små yderligere absorptionsmaksima i farvespektret, ved 290 nm og 380 nm. Den maksimale emission for SYBR Green I er ved 521 nm (grøn) [21] .
• Stepped PCR (touchdown PCR) - ved at bruge denne fremgangsmåde reduceres indflydelsen af ​​ikke-specifik binding af primere. De første cyklusser udføres ved en temperatur over den optimale udglødningstemperatur, derefter for hvert par cykler reduceres udglødningstemperaturen gradvist til den optimale. Dette er for at sikre, at primeren hybridiserer til den komplementære streng i hele dens længde; hvorimod ved den optimale annealingstemperatur hybridiserer primeren delvist til den komplementære streng. Delvis hybridisering af primeren på genomisk DNA fører til ikke-specifik amplifikation, hvis der er nok bindingssteder til primeren. I de fleste tilfælde kan de første ti cyklusser af PCR udføres ved en udglødningstemperatur på 72-75°C og derefter straks sænkes til det optimale, for eksempel til 60-65°C.
• Molekylær kolonimetode (PCR i gel,koloni PCR) -akrylamidgel polymeriseresmed alle PCR-komponenter på overfladen og PCR udføres. På punkter, der indeholder det analyserede DNA, sker amplifikation med dannelsen af ​​molekylære kolonier.
• PCR med hurtig amplifikation af cDNA-ender (hurtig amplifikation af cDNA-ender, RACE-PCR).
• PCR af lange fragmenter ( langrækkende PCR ) er en PCR-modifikation til amplifikation af udvidede DNA-segmenter (10 tusind eller flere baser). Der anvendes en blanding af to polymeraser, hvoraf den ene er en Taq -polymerase med høj processivitet (dvs. i stand til at syntetisere en lang DNA-kæde i én passage), og den anden er en DNA-polymerase med 3'-5'-exonukleaseaktivitet sædvanligvis Pfu polymerase . Den anden polymerase er nødvendig for at korrigere fejlene introduceret af den første, da Taq -polymerase stopper DNA-syntese, hvis et ikke-komplementært nukleotid er blevet tilføjet. Dette ikke-komplementære nukleotid fjernes af Pfu - polymerase. Blandingen af ​​polymeraser tages i et forhold på 50:1 eller endda mindre end 100:1, hvor Taq- polymeraser tages 25-100 gange mere end Pfu- polymeraser.
• RAPD ( Random Amplification of Polymorphic DNA ), PCR med tilfældig amplifikation af polymorft DNA - bruges, når det er nødvendigt at skelne mellem organismer, der ligger tæt i genetisk rækkefølge, for eksempel forskellige sorter af dyrkede planter, hunderacer eller tætte. relaterede mikroorganismer. Denne metode bruger normalt en enkelt lille primer (ca. 10 bp). Denne primer vil være delvist komplementær til tilfældige DNA-regioner af organismerne under undersøgelse. Ved at udvælge betingelserne (primerlængde, primersammensætning, temperatur osv.) er det muligt at opnå en tilfredsstillende forskel i PCR-mønsteret for to organismer.
• Gruppespecifik PCR ( gruppespecifik PCR ) - PCR for beslægtede sekvenser inden for samme eller mellem forskellige arter ved anvendelse af konservative primere for disse sekvenser. For eksempel udvælgelsen af ​​universelle primere for 18S og 26S ribosomale gener til amplifikation af en artsspecifik intergen spacer: sekvensen af ​​18S og 26S generne er bevaret mellem arter, så PCR mellem disse gener vil finde sted for alle arter under undersøgelse. Det modsatte af denne metode er unik PCR ( Unique PCR ), hvor opgaven er at udvælge primere til kun at amplificere én sekvens fra alle relaterede.
• PCR ved hjælp af varmstart (hotstart PCR) er en modifikation af PCR ved hjælp af DNA-polymerase, hvor polymeraseaktivitet blokeres ved stuetemperatur af antistoffer eller små molekyler, der simulerer antistoffer som Affibody , dvs. indstilling af reaktionen før den første denaturering i PCR. Typisk udføres den første denaturering ved 95°C i 10 minutter.
• Virtuel PCR ( in silico PCR , elektronisk PCR, e-PCR) er en matematisk metode til computeranalyse af en teoretisk polymerasekædereaktion ved hjælp af en liste over primersekvenser (eller DNA-prober ) til at forudsige potentiel DNA- amplifikation af genomet , kromosomet , cDNA eller en hvilken som helst anden region under undersøgelses-DNA.

Hvis nukleotidsekvensen af ​​skabelonen er delvist kendt eller slet ikke kendt, kan degenererede primere anvendes , hvis sekvens indeholder degenererede positioner, hvori hvilke som helst baser kan være lokaliseret. For eksempel kan primersekvensen være: ...ATH... hvor H er A, T eller C.

Anvendelse af PCR

PCR bruges på mange områder til analyse og i videnskabelige forsøg.

Criminalistics

PCR bruges til at sammenligne såkaldte "genetiske fingeraftryk". En prøve af genetisk materiale fra gerningsstedet er nødvendig - blod, spyt, sæd, hår osv. Det sammenlignes med den mistænktes genetiske materiale. En meget lille mængde DNA er teoretisk nok - en kopi. DNA'et skæres i fragmenter og amplificeres derefter ved PCR. Fragmenter adskilles ved hjælp af DNA-elektroforese . Det resulterende billede af placeringen af ​​DNA-båndene kaldes det genetiske fingeraftryk .

Etablering af faderskab

Selvom "genetiske fingeraftryk" er unikke, kan familiebånd stadig etableres ved at lave flere sådanne fingeraftryk. [≡] Den samme metode kan anvendes, med mindre modifikation, til at etablere evolutionære forhold mellem organismer.

Medicinsk diagnostik

PCR gør det muligt væsentligt at fremskynde og lette diagnosticering af arvelige og virussygdomme . Det ønskede gen amplificeres ved PCR under anvendelse af passende primere og sekventeres derefter for at bestemme mutationer . Virale infektioner kan påvises umiddelbart efter infektion, uger eller måneder (afhængig af længden af ​​inkubationsperioden ), før symptomer på sygdommen viser sig.

Personlig medicin

Nogle gange er lægemidler giftige eller allergifremkaldende for nogle patienter. Årsagerne til dette er til dels individuelle forskelle i følsomhed og metabolisme af lægemidler og deres derivater. Disse forskelle bestemmes på det genetiske niveau. For eksempel, hos en patient kan et bestemt cytokrom (et leverprotein, der er ansvarlig for metabolismen af ​​fremmede stoffer) være mere aktivt, i en anden - mindre aktivt. For at bestemme, hvilken slags cytokrom en given patient har, foreslås det at udføre en PCR-analyse, før lægemidlet tages i brug. Denne analyse kaldes foreløbig genotypebestemmelse ( prospektiv genotypebestemmelse ).

Genkloning

Genkloning (ikke at forveksle med kloning af organismer) er processen med at isolere gener og, som et resultat af gensplejsede manipulationer , opnå en stor mængde af produktet af et givet gen. PCR bruges til at amplificere et gen, som derefter indsættes i en vektor  , et stykke DNA, der overfører et fremmed gen til den samme eller en anden organisme, der er let at dyrke. Som vektorer anvendes f.eks. plasmider eller viralt DNA. Indsættelsen af ​​gener i en fremmed organisme bruges normalt til at opnå et produkt af dette gen - RNA eller oftest et protein. På den måde opnås mange proteiner i industrielle mængder til brug i landbrug, medicin mv.

DNA-sekventering

I sekventeringsmetoden ved anvendelse af dideoxynukleotider mærket med et fluorescerende mærke eller en radioaktiv isotop er PCR en integreret del, da det er under polymerisation, at derivater af nukleotider mærket med et fluorescerende eller radioaktivt mærke indsættes i DNA-kæden. Tilføjelsen af ​​et dideoxynukleotid til den syntetiserede streng afslutter syntesen, hvilket gør det muligt at bestemme positionen af ​​specifikke nukleotider efter adskillelse i gelen.

Mutagenese

I øjeblikket er PCR blevet den vigtigste metode til at udføre mutagenese (indførelse af ændringer i nukleotidsekvensen af ​​DNA). Brugen af ​​PCR gjorde det muligt at forenkle og fremskynde mutageneseproceduren, samt at gøre den mere pålidelig og reproducerbar.

Molekylær kønsbestemmelse

Et andet område med praktisk anvendelse af PCR er molekylær kønsbestemmelse  — kønsbestemmelse baseret på kønsforskelle på DNA-niveau mellem mænd og kvinder [22] .

Se også

• Nicking enzymmedieret amplifikation
• Helicase-afhængig amplifikation
• DNA
• Immuno-PCR
• Brug af DNA i teknologi
• Næste generations sekventeringsmetoder
• Sekvensering
• RNA-sekventering
• SlipChip teknologi
• elektroforese
• DNA elektroforese
• FastPCR
• Realtids PCR

Noter

1. ↑ Kleppe, K. et al. (1971): Studier af polynukleotider. XCVI. Reparer replikationer af korte syntetiske DNA'er som katalyseret af DNA-polymeraser. I: J. Mol. Biol. bd. 56, S. 341-361. PMID 4927950
2. ↑ Bartlett, JMS; Stirling, D. En kort historie om polymerasekædereaktionen // PCR-protokoller  (ubestemt) . — 2. - 2003. - T. 226. - S. 3-6. — (Metoder i molekylærbiologi). — ISBN 1-59259-384-4 . - doi : 10.1385/1-59259-384-4:3 .
3. ↑ Mullis, Kary B. et al. "Proces til amplifikation, påvisning og/eller kloning af nukleinsyresekvenser" US patent 4 683 195
4. ↑ Saiki RK, Scharf S., Faloona F., Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Science 1985 20. december; 230 (4732): 1350-4; Enzymatisk amplifikation af beta-globin genomiske sekvenser og restriktionsstedanalyse til diagnose af seglcelleanæmi.
5. ↑ [ Nobelpristagere i kemi 1993  ] . Hentet 29. august 2007. Arkiveret fra originalen 26. oktober 2012.  (ubestemt) Nobelpristagere i kemi, 1993  (engelsk) ]
6. ↑ RK Saiki, DH Gelfand, S. Stoffel, SJ Scharf, R. Higuchi, GT Horn, KB Mullis, HA Erlich. Primer-styret enzymatisk amplifikation af DNA med en termostabil DNA-polymerase Arkiveret 19. december 2008 på Wayback Machine . i: Videnskab . 239.1988, 487-491. ISSN 0036-8075 PMID 2448875
7. ↑ Kaledin A. S., Slyusarenko A. G., Gorodetsky S. I. // Biochemistry. - 1980. - T. 45. - C. 644-651.
8. ↑ Alice Chien, David B. Edgar og John M. Trela. Deoxyribonukleinsyrepolymerase fra Extreme Thermophilic Thermus aquaticus. Tidsskrift for bakteriologi, sept. 1976, s. 1550-1557.
9. ↑ Roche annoncerer forligsaftale med Promega (downlink) . Hentet 29. august 2007. Arkiveret fra originalen 6. oktober 2008. (ubestemt) 
10. ↑ 1 kbp ( engelsk  kilo basepar ) - 1 tusind basepar, en måleenhed for DNA- længde
11. ↑ Venter J, et al. (2001). Rækkefølgen af ​​det menneskelige genom. Science 291 (5507): 1304-51. PMID 11181995
12. ↑ {title} (downlink) . Hentet 1. september 2007. Arkiveret fra originalen 29. september 2007. (ubestemt) 
13. ↑ Annealing ( annealing ) - hybridisering af DNA-fragmenter
14. ↑ Nicolas von Ahsen, Carl T. Wittwer, Ekkehard Schütz. Oligonukleotid-smeltetemperaturer under pcr-betingelser: nærmeste nabokorrektioner for Mg 2+ , deoxynukleotidtriphosphat- og dimethylsulfoxidkoncentrationer med sammenligning med alternative empiriske formler  //  Clinical Chemistry : journal. - 2001. - Bd. 47 , nr. 11 . - S. 1956-1961 . Arkiveret fra originalen den 1. september 2012.
15. ↑ Hårnål  - intramolekylær selvkomplementær struktur
16. ↑ Dimer  - intermolekylære strukturer dannet af primere med hinanden eller med sig selv
17. ↑ Kalender R. N., Sivolap Yu. M. Polymerasekædereaktion med vilkårlige primere  // Biopolymerer og celle: journal. - 1995. - T. 11 , nr. 3-4 . - S. 55-65 . — ISSN 0233-7657 . (Russisk)
18. ↑ Recombinase Polymerase Amplification (RPA) - den isotermiske DNA/RNA-amplifikation, der virkelig virker. . Hentet 9. september 2017. Arkiveret fra originalen 9. september 2017. (ubestemt)
19. ↑ Video på engelsk: Hvad er Recombinase Polymerase Amplification? — TwistDx Arkiveret 24. november 2016 på Wayback Machine
20. ↑ Pierce KE og Wangh LJ Lineær-efter-den-eksponentielle polymerasekædereaktion og beslægtede teknologier Realtidsdetektionsstrategier til hurtig, pålidelig diagnose fra enkeltceller  //  Metoder Mol Med. : journal. - 2007. - Bd. Metoder i molekylær medicin™ . - S. 65-85 . — ISBN 978-1-58829-578-1 . - doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . — PMID 17876077 .
21. ↑ Fluorescence SpectraViewer Fluorescence SpectraViewer | Livsteknologier . Dato for adgang: 30. oktober 2012. Arkiveret fra originalen den 15. november 2012. (ubestemt)
22. ↑ Romanov MN, Ellegren H., Dodgson JB (2001-01-13). Polymerase kædereaktion amplificerede markører til fuglekønsbestemmelse . International Plant and Animal Genome IX Conference (San Diego, 13.-17. januar 2001) . San Diego, CA, USA: Scherago International. s. 118.OCLC 899128222.  _ _ Abstrakt P229. Arkiveret fra originalen 2020-09-20 . Hentet 2020-10-26 . Forældet parameter brugt |deadlink=( hjælp ) (Engelsk)

Litteratur

• Glick B., Pasternak J. Molekylær bioteknologi. Principper og anvendelse. Om. fra engelsk. - M .: Mir, 2002. - 589 s., ill. — ISBN 5-03-003328-9
• Patrushev L. I. Kunstige genetiske systemer. - M .: Nauka, 2005. - I 2 bind - ISBN 5-02-033278-X
• Shchelkunov S. N. Genteknologi. - Novosibirsk: Sib. univ. forlag, 2004. - 496 s.; syg. — ISBN 5-94087-098-8
• Ahsen N, Wittwer CT, Schutz E 2001. Oligonucleotide Melting Temperatures under PCR Conditions: Nearest-Neighbor Corrections for Mg 2+ , Deoxynucleotid Triphosphate, and Dimethyl Sulfoxide Concentrations with Comparison to Alternative Empirical Formulas Wayback 12 September Machine . Clin Chem . 47:1956-1961.
• Kalendar R, Lee D, Schulman AH 2011. Java-webværktøjer til PCR, i silico PCR og oligonukleotidsamling og -analyse . Genomics, 98(2): 137-144. http://primerdigital.com/tools/ Arkiveret fra originalen den 16. september 2012.

Links

• PCR-laboratoriets aktiviteter. Organisering af arbejdet under PCR-undersøgelser af materiale inficeret med mikroorganismer af patogenicitetsgruppe I-II Arkivkopi dateret 29. september 2010 på Wayback Machine .
• Webstedet "Classical and Molecular Biology": Teknikker relateret til PCR Arkiveret 8. juni 2007 på Wayback Machine

Ordbøger og encyklopædier	Flot dansk stor kinesisk stor kinesisk stor kinesisk Stor russer jorden rundt Britannica (online) Brockhaus Universalis Universalis
I bibliografiske kataloger	BNF : 121493620 GND : 4256726-9 J9U : 987007546303405171 LCCN : sh89002539 NKC : ph907888