Proteinelektroforese i en polyacrylamidgel er en metode til adskillelse af blandinger af proteiner i en polyacrylamidgel i henhold til deres elektroforetiske mobilitet (en funktion af længden af polypeptidkæden eller molekylvægten , samt foldningen af proteinmolekylet, post-translationel ændringer og andre faktorer). Denne metode til protein- og peptidfraktionering er meget brugt i moderne molekylærbiologi , biokemi og genetik .
Et stort antal modifikationer af proteinelektroforese i polyacrylamidgel er blevet udviklet til at løse forskellige problemer og til forskellige proteiner og peptider. Den mest almindelige variant er proteinelektroforese i polyacrylamidgel i nærvær af natriumdodecylsulfat ifølge Laemmli ( SDS PAGE ) .
Den elektroforetiske mobilitet af biopolymerer i en gel afhænger af en række parametre. Migrationshastigheden er proportional med molekylets ladning, og i en fri væske migrerer molekyler med den samme specifikke ladning med samme hastighed. Ved adskillelse i et medium med en stiv rumlig matrix sker der segregation på grund af friktion mod gelen. Friktionskraften afhænger af den rumlige konfiguration af molekylet, inklusive dets størrelse. I tilfælde af elektroforetisk adskillelse af native proteiner vil et komplekst mønster af deres fordeling således blive observeret afhængigt af ovenstående faktorer.
I 1970 foreslog Laemmli en metode til elektroforetisk adskillelse af proteiner i en polyacrylamidgel afhængig af molekylvægten for at studere processen med at samle kapsiden af bakteriofag T4 [1] . For at gøre dette, før påføring på gelen, blev prøverne kogt i nærværelse af natriumdodecylsulfat (SDS) og 2-mercaptoethanol. Under påvirkning af 2-mercaptoethanol genoprettes disulfidbindinger, hvilket forhindrer de denaturerede polypeptider i at sløjfe ud og øge deres mobilitet. SDS er et stærkt detergent , dets molekyle består af en tolvleddet alifatisk lige kæde og et sulfat, der er kovalent bundet til det, som har en negativ ladning i opløsning.
Ved brug af den beskrevne metode er følgende forudsætninger:
Under disse betingelser har alle polypeptider den samme specifikke ladning og adskilles omvendt med logaritmen af deres molekylvægt. Praksis bekræfter rigtigheden af disse antagelser i langt de fleste tilfælde.
For at udføre denaturerende elektroforese i PAAG anvendes forskellige buffersystemer. Det mest almindelige standardsystem er Laemmli-buffersystemet. Derudover bruger langt de fleste værker den såkaldte disc-electrophoresis (fra engelsk discontinuous - discontinuous), det vil sige, de bruger en gel bestående af to dele. Koncentrationsgelen har en pH på 6,8 og en koncentration af polyacrylamid fra 2 til 8%. Separeringsgelen har en pH i området 8,5-9 og en koncentration af polyacrylamid fra 5 til 20%. Valget af geldensitet afhænger af molekylvægtene af de undersøgte proteiner. Alle buffere indeholder ikke uorganiske salte; den vigtigste nuværende bærer i dem er glycin . Ved pH 6,8 er den samlede ladning af glycinmolekylet tæt på nul. Som følge heraf skal negativt ladede komplekser af polypeptider med SDS bevæge sig med høj hastighed for at overføre en bestemt ladning (som bestemmes af styrken af strømmen i den elektroforetiske celle). Ved pH 8,8 får glycin en negativ ladning, som et resultat af hvilket proteiner kraftigt hæmmes ved grænsen af de koncentrerende og adskillende geler (meget flere ladede molekyler er nu involveret i overførslen af den samme ladning gennem en enhedsareal, derfor, de bevæger sig med lavere hastighed). Resultatet af dette er koncentrationen af proteiner ved gelernes grænseflade, hvilket i høj grad øger opløsningen af metoden.
I en adskillelsesgel migrerer proteiner afhængigt af længden af polypeptidkæden, det vil sige omvendt proportional med molekylvægten.
For at visualisere resultaterne af elektroforese bruges oftest farvning af proteiner i geler med Coomassie farvestof eller sølv . Til Western blotting overføres proteiner fra gelen til en nitrocellulosemembran.
I de fleste tilfælde er det tilstrækkeligt at opnå resultaterne af elektroforetisk adskillelse ved visuel evaluering af gelen. Men for at opnå pålidelige data og korrekt dokumentere resultaterne, scannes gelen gennem transmission ved hjælp af et meget følsomt densitometer. Faktisk er et densitometer en scanner, der hører til kontrol- og måleinstrumenter og er underlagt verifikation for at fastslå og bekræfte, at måleinstrumentets egenskaber opfylder de fastsatte krav. Sådanne krav til et densitometer giver mulighed for pålideligt at bestemme ikke kun positionen af proteiner i gelen, men også den optiske tæthed af proteinpletten. Det digitaliserede billede af gelen behandles ved hjælp af specialiseret software, der giver dig mulighed for pålideligt at bestemme sådanne parametre som proteinets elektroforetiske mobilitet, dets renhed, mængden af protein i stedet osv.
Bestemmelse af molekylvægten af proteinerBestemmelse af molekylvægten af det undersøgte protein kræver behovet for at kalibrere gelen efter molekylvægte. Gelen kalibreres mod molekylvægtene af markørproteiner, som adskilles parallelt med testprøven. Blandinger af markørproteiner er tilgængelige i forskellige vægtintervaller. Kalibrering involverer at plotte afhængigheden af den relative elektroforetiske mobilitet (Rf) af hvert af markørproteinerne på decimallogaritmen af deres molekylvægt. Typisk har afhængigheden form af en sigmoid kurve. Beregningen af molekylvægten af det undersøgte protein udføres i forhold til dets Rf ved hjælp af metoden til regressionsanalyse . Resultaterne anses for at være pålidelige, hvis intervallet af markørproteiner er mindst 80 % af længden af den separerende gel, og afhængigheden af deres Rf af logaritmen af molekylvægten er lineær (R2 > 0,95) . Det vil sige, at kun den del af kalibreringskurven bruges til beregninger, som dækker den elektroforetiske mobilitet af det undersøgte protein.
Følsomheden af SDS-PAGE-metoden ifølge Laemmli er omvendt proportional med proteinets molekylvægt. For eksempel er det i området 10-20 kDa muligt at adskille proteiner, der kun adskiller sig med 0,1 kDa (forskellen er kun en aminosyrerest ). Men for at opnå tilfredsstillende resultater bør nogle få enkle metodiske anbefalinger følges. På grund af det faktum, at den høje elektriske ledningsevne af prøverne, der undersøges, kan forvrænge proteinets elektroforetiske mobilitet betydeligt, bør deres ionstyrke være så lav som muligt og omtrent ens. En anden vigtig betingelse for pålideligheden af molekylvægtsbestemmelse er den optimale belastning af proteinet på gelen. Ved farvning med Coomassie Blue R250 bør det optimale proteinindhold i en plet være i området 0,1-1 µg og mindst en størrelsesorden mindre, når det farves med sølv. Ellers vil proteinerne i gelen danne brede pletter, hvilket gør det vanskeligt at bestemme deres elektroforetiske mobilitet. På trods af den høje følsomhed og enkelhed af metoden afviger molekylvægten af proteiner bestemt ved hjælp af SDS-PAGE ofte fra den sande værdi. Forskellen kan variere fra nogle få kDa for lavmolekylære proteiner til titusinder af kDa for højmolekylære proteiner.
Kvantificering af proteinerSDS-PAGE-metoden er uundværlig, hvis det er nødvendigt at kvantificere et individuelt protein i en prøve, som ikke kun er kompleks i proteinsammensætning. Et eksempel på en sådan prøve ville være råekstrakter eller cellelysater. I dette tilfælde er metoden velegnet til at studere både native proteiner og proteiner, der har ændret deres struktur. Sådanne proteiner kan være polymerer, aggregater eller fuldstændigt denaturerede molekyler. Metodens relative krævende natur med hensyn til sammensætningen af prøven og den strukturelle tilstand af proteiner i den adskiller SDS-PAGE positivt fra andre metoder til kvantitativ bestemmelse, for eksempel højtydende væskekromatografi eller enzymimmunoassay.
Kvantificering af protein ved hjælp af SDS-PAGE antyder behovet for at kalibrere gelen i forhold til afhængigheden af farveintensiteten af proteinpletten i gelen af mængden af protein i denne plet. For at gøre dette adskilles adskillige referenceprøver parallelt med de undersøgte prøver i gelen med præcist kendte forskellige mængder af referenceproteinet. Efter visualisering af proteinerne i gelen ved hjælp af et densitometer, måles tætheden af hver proteinplet i referenceprøverne. Bestem afhængigheden af denne tæthed af mængden af protein. Den kalibrerede gel bruges til at beregne mængden af protein under undersøgelse i forhold til tætheden af dens plet ved hjælp af regressionsanalysemetoden . Pålidelige resultater tages i betragtning, hvis afhængigheden af tætheden af proteinpletter for referenceproteinet af mængden af protein i pletten er lineær (R 2 > 0,95). Det vil sige, til beregninger bruges kun den del af kalibreringskurven, der dækker tætheden af stedet for det undersøgte protein. Det skal bemærkes, at valget af den optimale proteinkoncentration i testprøven udføres empirisk.
Når man kvantificerer proteiner ved hjælp af SDS-PAGE, bør der tages hensyn til et væsentligt træk ved denne metode. Så på grund af det faktum, at effektiviteten af at farve et protein i en gel afhænger af dets natur, for eksempel aminosyresammensætning, molekylvægt, tilstedeværelse af protesegrupper , skal referenceproteinet, der bruges til at kalibrere gelen og proteinet, der undersøges være identisk. I tilfælde af afvigelse fra denne regel kan forskellen mellem det sande og det modtagne beløb afvige flere gange.
Bestemmelse af proteinurenhederSDS-PAGE-metoden ifølge Laemmli tillader, at man kun kan kvantificere indholdet af de urenheder, der i deres molekylvægt adskiller sig fra molekylvægten af det undersøgte protein. For at gøre dette adskilles testprøven i én gel parallelt med en eller flere referenceprøver, hvor mængden af referenceproteinet er sammenlignelig med den forventede mængde urenheder i testproteinopløsningen. For eksempel, hvis proteinkoncentrationen i testprøven er 1 mg/ml, og den forventede mængde urenheder i den er inden for 1 %, så bruges mindst én referenceproteinopløsning med en koncentration på 10 µg/ml som reference prøve. Efter visualisering af proteinerne i gelen ved hjælp af et densitometer, måles tætheden af hver proteinplet for testprøven og referenceprøven.
SDS-PAGE-metoden er velegnet til bestemmelse af proteindimerer og polymerer, der akkumuleres på grund af spontan lukning af intermolekylære disulfidbindinger , for eksempel under ukorrekt opbevaring af lægemidlet. For at gøre dette adskilles proteinet under undersøgelse og referenceproteinet i en gel under reducerende og ikke-reducerende betingelser. Urenheder er dimerer og polymerer, hvis de påvises under reducerende betingelser og ikke påvises under ikke-reducerende betingelser. I dette tilfælde bør deres molekylvægt være et multiplum af molekylvægten af det testede protein. Således gør vurderingen af renheden af et proteinpræparat ved SDS-PAGE under reducerende betingelser det muligt kun at bestemme ikke-homologe proteinurenheder.
Resultaterne af bestemmelse af renheden af en prøve kan enten være semikvantitative eller kvantitative. I tilfælde af at en sammenligning af tætheden af pletter af kontaminerende proteiner udføres i forhold til en plet af et referenceprotein, er det opnåede resultat semikvantitativt. Dens ordlyd kan f.eks. lyde som følger: "Indholdet af proteinurenheder i testopløsningen overstiger ikke 1 %." Den kvantitative bestemmelse af proteinurenheder udføres i henhold til anbefalingerne for kvantitativ bestemmelse af proteiner ved SDS-PAGE-metoden.
Ud over de beskrevne fremgangsmåder praktiserer nogle laboratorier en metode til at bestemme homogeniteten af et præparat uden at bruge referenceprøver. I dette tilfælde bestemmes renheden af det undersøgte protein af tætheden af pletten i gelen, som estimeres som en procentdel af summen af tæthederne af alle identificerede proteinpletter. Denne tilgang afspejler ikke den sande mængde af urenheder, men kan tjene som en kvalitativ vurdering af lægemidlets renhed. Metoden kan ikke klassificeres som kvantitativ på grund af det faktum, at antallet og tætheden af påviste proteinpletter er direkte proportional med mængden af totalt protein i testprøven og følsomheden af metoden til at bestemme proteiner i gelen. Derudover er afhængigheden af tætheden af en proteinplet på mængden af protein i den i et område, der overstiger en størrelsesorden, ofte ikke lineær.
Til proteinelektroforese i en polyacrylamidgel anvendes følgende bufferopløsninger : Tris - HCl , Tristricin , TBE , TBE med urinstof, Bis-Tris.