Indlejret polymerasekædereaktion

Nested polymerase chain reaction ( engelsk  nested PCR  - "nested" PCR) er en to-trins variation af PCR , der bruges til at reducere mængden af ​​ikke-specifikke reaktionsprodukter [1] . I det første trin amplificeres en region , som omfatter mål -DNA- fragmentet og dets flankerende sekvenser (det vil sige placeret ved kanterne af fragmentet), hvortil det første par primere er annealet . I det andet trin tilsættes primere, som er komplementære til enderne af målfragmentet. Da produktet fra det første trin indeholder målfragmentet (det vil sige slutproduktet inde i produktet fra det første trin), kaldes denne PCR-variation nestet [1] .

Polymerase kædereaktion

Polymerasekædereaktion (PCR) er en DNA-amplifikationsproces, der anvender enzymet DNA-afhængig DNA-polymerase . En sådan reaktion har fundet bred anvendelse i genetiske laboratorier til at påvise tilstedeværelsen af ​​en bestemt del af DNA eller RNA i prøver (i det andet tilfælde er det nødvendigt først at konvertere RNA til DNA ved en omvendt transkriptionsreaktion ). PCR bruges også i genteknologi for at opnå det nødvendige fragment og dets videre anvendelse til kloning , in vitro -transkription og andre formål. Et vigtigt trin i forberedelsen af ​​reaktionen er valget af primere, der skal anneales ved enderne af målfragmentet. I dette tilfælde annealer primerne ofte også til andre DNA-regioner, hvilket resulterer i en blanding af produkter. Sandsynligheden for, at dette sker, stiger med antallet af PCR-cyklusser [1] .

Primere

Nested PCR bruger to par primere tilføjet i to på hinanden følgende reaktionstrin. Det første par kaldes eksternt og tjener til den indledende amplifikation af stedet, som omfatter mål-DNA-fragmentet, mens der på dette stadium anvendes et lille antal temperaturcyklusser (fra 15 til 30). Det andet par, kaldet internt, udglødes til produktet af det første og bruges i anden fase af PCR med et stort antal temperaturcyklusser. Da mængden af ​​DNA, der indeholder målfragmentet, stiger eksponentielt efter det første trin , og primerne, der anvendes i hvert trin, er komplementære til forskellige sekvenser omkring mål-DNA-regionen, øges den resulterende specificitet af reaktionen. Denne tilgang bruges ofte til at opnå sjældne fragmenter eller områder med lav kompleksitet (for eksempel GC-rige sekvenser) [2] .

Reaktionstrin og protokol

Den indlejrede PCR-protokol blev først beskrevet i 1993 af Kamolvarin og kolleger til diagnosticering af rabies [3] . Siden da har rækkefølgen af ​​handlinger været stort set uændret [4] . Den originale protokol fra artiklen er beskrevet nedenfor.

Første fase

Efter RNA-isolering blev revers transkription udført under anvendelse af 50 pmol af hver af parret af eksterne primere for 1 μg materiale. Blandingen indeholdende RNA/ cDNA - fusionen og primerne blev derefter lavet op til 50 µl med en PCR-buffer indeholdende 1,25 U. Taq-DNA-polymerase og 62,5 µmol/l dDNP ( deoxyribonukleosidtrifosfat ). 50 µl mineralolie blev lagt oven på blandingen, og 30 PCR-cyklusser blev udført (94°C, 1 min (smeltning); 45°C, 2 min (udglødning); 72°C, 2,5 min (forlængelse)) [ 3] .

I det første trin anvendes et ydre par af primere, der er komplementære til regionerne omkring mål-DNA-fragmentet til at amplificere dette fragment. Ud over målstedet kan primere også anneale til andre steder. Den endelige blanding af produkter fra det første trin omfatter både mål-DNA og urenheder [3] .

Anden fase

Til det andet trin af indlejret PCR blev en 2 µl aliquot taget fra den første blanding og tilsat til 23 µl af en blanding indeholdende 20 pmol interne primere komplementære til regionerne af selve målfragmentet, 25 mmol/l dDNF, og 1 enhed Taq DNA-polymerase. Brugte 30 amplifikationscyklusser med samme program som i første fase [3] .

I dette tilfælde er sandsynligheden for primer-annealing til andre produkter fra det første trin ekstremt lav, og i de fleste tilfælde er kun mål-DNA-fragmentet amplificeret [2] [3] .

Eksempler på brug

Nested PCR anvendes i vid udstrækning til opgaver, der kræver høj specificitet, såsom: testsystemer [5] , arbejde med små mængder materiale [6] , oprensning af DNA-prøver til yderligere analyse og brug [7] .

Specifikke anvendelsestilfælde for indlejret PCR:

Noter

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplifikation af nukleinsyrer  (engelsk)  // Diagnostisk molekylærbiologi. - 2019. - S. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . - doi : 10.1016/B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff L A. Forbedret kvantitativ PCR ved brug af nestede primere.  (engelsk)  // Genome Research. - 1994. - 1. juni ( bind 3 , nr. 6 ). - s. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . - doi : 10.1101/gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Diagnosis of Rabies by Polymerase Chain Reaction with Nested Primers  //  Journal of Infectious Diseases. - 1993. - 1. januar ( bd. 167 , nr. 1 ). - S. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . - doi : 10.1093/infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principper og tekniske aspekter af PCR-amplifikation . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 onlineressource (325 sider) s. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Ny tilgang baseret på ét-rørs indlejret PCR og en lateral flow-strimmel til meget følsom diagnose af tuberkuløs meningitis  //  PLOS ONE. - 2017. - 30. oktober ( bind 12 , nr. 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Anvendeligheden af ​​en Nested-polymerase kædereaktion til molekylær diagnose af human T-celle lymfotropisk virus type I/II  //  Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - Juni ( bind 99 , nr. 4 ). - S. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . - doi : 10.1590/S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparing Unbiased T-Cell cDNA-biblioteker til den dybe næste generations sekvenseringsprofilering  //  Frontiers in Immunology. - 2013. - Bd. 4 . — ISSN 1664-3224 . - doi : 10.3389/fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Development of a Highly Sensitive Nested-PCR-procedure ved brug af et enkelt lukket rør til påvisning af Erwinia amylovorain asymptomatisk plantemateriale  //  Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - 1. maj ( bd. 66 , nr. 5 ). - S. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . - doi : 10.1128/AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Udvikling af et indlejret PCR-assay til hurtig påvisning af Pilidiella granati i granatæblefrugt  //  Videnskabelige rapporter. - 2017. - 20. januar ( bind 7 , nr. 1 ). — ISSN 2045-2322 . - doi : 10.1038/srep40954 .
  10. ↑ Guo Ping , Yu Yongxin , Pan Yingjie , Yan Shuling , Wang Yongjie. Design og evaluering af indlejrede PCR-primere til specifik påvisning af genogruppe I norovirus i østers  //  Molecular and Cellular Probes. - 2018. - August ( bind 40 ). - S. 40-43 . — ISSN 0890-8508 . - doi : 10.1016/j.mcp.2018.06.002 .
  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Anvendelse af nestet PCR til påvisning af trichomonader i bronchoalveolær skyllevæske  (engelsk)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10. juni ( bind 19 , nr. 1 ). — ISSN 1471-2334 . - doi : 10.1186/s12879-019-4118-9 .
  Gå til Wikidata-elementet  Ordbøger og encyklopædier