DNA- agarosegelelektroforese er en analytisk metode, der bruges til at adskille DNA- fragmenter efter længde. Den er baseret på den forskellige bevægelseshastighed af fragmenter af forskellig længde, når de bevæger sig i gelen under påvirkning af et eksternt elektrisk felt .
En af anvendelserne af metoden er studiet af plasmid -DNA. Det er sædvanligvis ringformet og danner sekundære strukturer, såsom vikling til en superspole . For at bestemme størrelsen af plasmidet er det således nødvendigt at ødelægge elementerne i den sekundære struktur. For at gøre dette, før påføring på gelen, er plasmidet "lineariseret" (gjort lineært), det vil sige, det behandles med et af restriktionsenzymerne (endonukleaser). Restriktionsenzymet er valgt således, at det kun skærer plasmidet ét sted.
For at adskille DNA-fragmenter af forskellig længde, bruges en gel med forskellige koncentrationer af agarose. Jo kortere længden af de DNA-fragmenter, der skal adskilles, jo større bør koncentrationen af agarose være:
| Længde af DNA-fragmenter, der skal adskilles, bp |
Agarose koncentration , % |
|---|---|
| 50-1500 | 2 |
| 300-3000 | 1.5 |
| 400-6000 | 1.2 |
| 500-10000 | en |
| 800-10000 | 0,7 |
| 1000-20000 | 0,5 |
Under elektroforese migrerer DNA-fragmenter i gelen under påvirkning af elektriske feltkræfter . Faktum er, at sukker-phosphat-rygraden i DNA-molekyler er negativt ladet, og derfor bevæger DNA-kæder sig fra den negativt ladede katode til den positive anode . Længere molekyler migrerer langsommere, når de forbliver i gelen, kortere molekyler bevæger sig hurtigere.
Før elektroforese påbegyndes, er det sædvanligt at tilføje to forskellige farvestoffer med en sur pH til prøverne (xylenblåt og bromphenolblåt bruges ofte til dette formål ) for at visualisere elektroforesens fremskridt og vægte prøverne med glycerol (op til 20% glycerol) i prøven). Farvestoffet er også nødvendigt for at bestemme, hvornår processen skal stoppes.
Elektroforese udføres i et kammer fyldt med en bufferopløsning . De mest almindeligt anvendte buffere indeholder EDTA , Tris og enten borsyre eller eddikesyre. Følgelig kaldes bufferen indeholdende borsyre TBE (tris-borat-EDTA), og bufferen indeholdende eddikesyre kaldes TAE (tris-acetat-EDTA). Koncentrationerne af moderludene af TBE og TAE er henholdsvis 6x og 50x sammenlignet med deres arbejdskoncentrationer. Bufferen er nødvendig for at øge ionstyrken af opløsningen, hvori adskillelsen af DNA-molekyler vil ske under påvirkning af et påført elektrisk felt.
Efter adskillelse (nogle gange tilsættes farvestoffet til smeltet agarose), visualiseres DNA-fragmenter af forskellig længde ved hjælp af fluorescerende farvestoffer, der specifikt interagerer med DNA, for eksempel farves agarosegeler sædvanligvis med ethidiumbromid , som interkalerer mellem de nitrogenholdige baser i duplexen. og fluorescerer i UV -stråler.
Størrelsesbestemmelse udføres ved at sammenligne sæt af kommercielle DNA-fragmenter af kendt længde ("DNA-stige", "lineal", "DNA-markører") og DNA i de testede prøver. Normalt er indholdet af individuelle fragmenter også angivet i kommercielle markører, så det ved at sammenligne intensiteten af båndene er muligt hurtigt at vurdere DNA-koncentrationen i de testede prøver. Om nødvendigt kan DNA-markører for gelen laves uafhængigt ved at behandle plasmidet med et restriktionsenzym, som skærer det flere steder. Til dette vælges en endonuklease, under hvilken virkning der dannes 5-6 fragmenter af forskellige længder.
Normalt bruges agarosegeler til elektroforetisk analyse af DNA, men hvis de DNA-fragmenter, der skal adskilles, kun er nogle få tiere af basepar lange, så kan en polyacrylamidgel bruges. Polyakrylamidgel bruges også til korte DNA-molekyler med høj opløsning i DNA- sekventering .