Cellekultur

Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 24. maj 2021; checks kræver 5 redigeringer .

Cellekultur er en proces, hvorved enkelte celler (eller en enkelt celle) af prokaryoter og eukaryoter dyrkes in vitro under kontrollerede forhold . I praksis refererer udtrykket " cellekultur " hovedsageligt til dyrkning af enkeltvævsceller afledt af multicellulære eukaryoter, mest almindeligt dyr. Den historiske udvikling af teknologi og teknikker til dyrkning af cellekulturer er uløseligt forbundet med dyrkning af vævskulturer og hele organer.

Historie

I det 19. århundrede udviklede den engelske fysiolog S. Ringer en saltvandsopløsning [1] indeholdende natrium-, kalium-, calcium- og magnesiumchlorider for at opretholde dyrenes hjerterytme uden for kroppen. I 1885 etablerede Wilhelm Roux princippet om vævskultur, fjernede en del af knoglemarven fra et kyllingefoster og holdt det i varmt saltvand i flere dage [2] . Ross Granville Harrison , som arbejdede på Johns Hopkins School of Medicine og senere ved Yale University , offentliggjorde resultaterne af sine eksperimenter i 1907-1910, hvilket skabte en vævskulturmetodologi. I 1910 inducerede Peyton Rous , der arbejdede med kyllingesarkomcellekultur, dannelsen af ​​tumorer hos raske dyr. Dette førte senere til opdagelsen af ​​onkogene vira ( Nobelprisen i fysiologi eller medicin 1966).

Cellekulturteknikker udviklede sig markant i 1940'erne og 1950'erne i forbindelse med forskning inden for virologi. Dyrkning af vira i cellekulturer gjorde det muligt at opnå rent viralt materiale til fremstilling af vacciner. Poliovaccinen var et af de første lægemidler, der blev masseproduceret ved hjælp af cellekulturteknologi. I 1954 modtog Enders , Weller og Robbins Nobelprisen " for deres opdagelse af poliovirussens evne til at vokse i kulturer af forskellige væv." I 1952 blev den velkendte humane kræftcellelinje HeLa udviklet .

Grundlæggende principper for dyrkning

Celleisolering

Til dyrkning uden for kroppen kan levende celler fås på flere måder. Celler kan isoleres fra blod, men kun leukocytter kan vokse i kultur. Mononukleære celler kan isoleres fra blødt væv ved hjælp af enzymer såsom collagenase , trypsin , pronase , der ødelægger den ekstracellulære matrix [3] . Derudover kan stykker af væv og materialer placeres i næringsmediet.

Cellekulturer taget direkte fra objektet ( ex vivo ) kaldes primære [4] . De fleste primære celler, med undtagelse af tumorceller, har en begrænset levetid. Efter et vist antal delinger bliver sådanne celler gamle og holder op med at dele sig, selvom de stadig kan forblive levedygtige.

Der er udødelige ("udødelige") cellelinjer, der kan formere sig i det uendelige. I de fleste tumorceller er denne evne resultatet af en tilfældig mutation , men i nogle laboratoriecellelinjer erhverves den kunstigt ved at aktivere telomerasegenet [5] [6] .

Cellekultur

Celler dyrkes i specielle næringsmedier ved en konstant temperatur. Til plantecellekulturer anvendes kontrolleret belysning, og for pattedyrsceller kræves der normalt også et særligt gasformigt miljø, vedligeholdt i en cellekulturinkubator [7] [8] . Som regel reguleres koncentrationen af ​​kuldioxid og vanddamp i luften, men nogle gange også ilt. Næringsmedier til forskellige cellekulturer er forskellige i sammensætning, pH , glukosekoncentration , sammensætning af vækstfaktorer osv. [9] . Vækstfaktorer, der anvendes i pattedyrcellekulturmedier, tilsættes oftest sammen med blodserum . En af risikofaktorerne i dette tilfælde er muligheden for infektion af cellekulturen med prioner eller vira. I dyrkningen er en af ​​de vigtige opgaver at undgå eller minimere brugen af ​​forurenede ingredienser. Men i praksis opnås dette ikke altid. Den bedste, men også den dyreste måde er at tilføje rensede vækstfaktorer i stedet for serum [10] .

Celler kan dyrkes i suspension eller i en klæbende tilstand. Nogle celler (såsom blodceller ) eksisterer naturligt i suspension. Der er også cellelinjer, der er kunstigt modificeret, så de ikke kan klæbe til overflader; dette gøres for at øge tætheden af ​​celler i kultur. Vækst af adhærerende celler kræver en overflade, såsom vævskultur, eller plastik belagt med ekstracellulære matrixelementer for at forbedre klæbende egenskaber, samt for at stimulere vækst og differentiering. De fleste bløde og hårde vævsceller er klæbende. Fra den klæbende kulturtype skelnes organotypiske cellekulturer, som er et tredimensionelt miljø i modsætning til konventionelt laboratorieglas. Dette dyrkningssystem minder fysisk og biokemisk mest om levende væv, men har nogle tekniske problemer med at vedligeholde (det har for eksempel brug for diffusion). For at give de nødvendige fysiske betingelser for at dyrke klæbende kulturer og befolke volumenet af den ekstracellulære matrix af vævstekniske strukturer, anvendes dynamiske dyrkningssystemer [11] baseret på roterende og vortex bioreaktorer, bioreaktorer med direkte kontakt med stilladset: kompressionsbioreaktorer , bioreaktorer med mekanisk spænding og hydrostatisk tryk, specielle bioreaktorer til elektrisk stimulering af celler og væv, samt kombinerede bioreaktorer [12] .

Krydskontaminering af cellelinjer

Når man arbejder med cellekulturer, kan forskere stå over for problemet med krydskontaminering.

Funktioner af voksende celler

Når celler dyrkes, på grund af konstant deling, kan deres overflod i kultur forekomme, og som følge heraf opstår følgende problemer:

For at opretholde den normale funktion af cellekulturer, samt for at forhindre negative fænomener, udskiftes næringsmediet periodisk, celler passeres og transficeres . For at undgå kontaminering af kulturer med bakterier, gær eller andre cellelinjer udføres alle manipulationer normalt under aseptiske forhold i en steril boks. Antibiotika ( penicillin , streptomycin ) og svampedræbende midler ( amphotericin B ) kan tilsættes til dyrkningsmediet for at undertrykke mikrofloraen .

Et af produkterne af metabolisme i celler er syrer, som et resultat af hvilke pH-værdien af ​​mediet gradvist falder. For at kontrollere surhedsgraden af ​​næringsmedier tilsættes pH-indikatorer til dem .

Hvis cellekulturen er klæbende, kan næringsmediet udskiftes fuldstændigt.

Passering af celler

Passage (adskillelse) af celler  er udvælgelsen af ​​et lille antal celler til vækst i et andet laboratoriekar. Hvis kulturen vokser hurtigt, skal dette gøres regelmæssigt, da næringsstoffer opbruges i mediet, og stofskifteprodukter ophobes . Suspensionskulturer er lettere at passere, da det er nok bare at vælge det nødvendige antal celler, placere dem i andre beholdere og tilføje frisk næringsmedium. Klæbende celler skal adskilles fra substratet før dette, og deres klynger skal adskilles. Oftest anvendes en blanding af trypsin og EDTA eller andre enzymblandinger til dette formål , nogle gange er kun EDTA i fysiologisk saltvand (Versens opløsning) tilstrækkelig. Hvis kulturen vokser langsomt, fodres den sædvanligvis uden at blive overført til en anden beholder, med jævne mellemrum (normalt en gang hver 2-3 dag) en del af det brugte medium fjernes og frisk tilsættes.

Transfektion og transduktion

Fremmed DNA kan indføres i celler under deres dyrkning ved transfektion (ikke-viral metode). Denne teknologi bruges ofte til kontrolleret genekspression . Relativt for nylig er mRNA- transfektion blevet implementeret med succes til disse formål .

DNA kan også indføres i cellens genom af vira eller bakteriofager . De, som er intracellulære parasitter, er de bedst egnede til disse formål, da indførelsen af ​​genetisk materiale i værtscellen er en normal del af deres livscyklus [13] . Denne metode kaldes transduktion .

Humane cellelinjer

Dyrkning af menneskelige celler er noget imod bioetikkens regler , da celler dyrket i isolation kan overleve moderorganismen og derefter bruges til at udføre eksperimenter eller til at udvikle nye behandlinger og drage fordel af det. Den første retsafgørelse på dette område blev afsagt i Californiens højesteret i John Moore v. University of California , ifølge hvilken patienter ikke har nogen ejendomsret til cellelinjer opnået fra organer fjernet med deres samtykke [14] .

Hybridoma

Et hybridom  er en cellelinje, der er et resultat af fusionen af ​​normale lymfocytter med "udødelige" cancerceller. Bruges til at producere monoklonale antistoffer . Leukocytter isoleret fra milten eller blodet fra immuniserede dyr producerer antistoffer med den nødvendige specificitet, men som med enhver primær kultur er deres evne til at formere sig begrænset af Hayflick-grænsen . Til immortalisering fusioneres de kunstigt med en "udødelig" myelomcellelinje , hvilket resulterer i en rekombination af egenskaber. Derefter klones linjen, og der udvælges kloner , som er i stand til samtidig ubegrænset proliferation og producere antistoffer mod det udvalgte antigen .

Brug af cellekulturer

Massecellekultur er grundlaget for industriel produktion af virale vacciner og en række bioteknologiske produkter .

Bioteknologiske produkter

En industriel metode fra cellekulturer producerer produkter som enzymer , syntetiske hormoner , monoklonale antistoffer , interleukiner , lymfokiner , antitumorlægemidler . Selvom mange simple proteiner relativt let kan opnås ved hjælp af rDNA i bakteriekulturer, kan mere komplekse proteiner såsom glycoproteiner i øjeblikket kun opnås fra dyreceller. Et af disse vigtige proteiner er hormonet erythropoietin . Omkostningerne ved at dyrke pattedyrcellekulturer er ret høje, så der forskes i øjeblikket i muligheden for at producere komplekse proteiner i insekt- eller højere plantecellekulturer .

Vævskulturer

Cellekultur er en integreret del af vævskulturteknologi og vævsteknologi, da den definerer grundlaget for dyrkning af celler og opretholdelse af dem i en levedygtig tilstand ex vivo .

Vacciner

Ved hjælp af cellekulturteknikker produceres der i øjeblikket vacciner mod poliomyelitis , mæslinger , fåresyge , røde hunde og skoldkopper . På grund af truslen om en influenzapandemi forårsaget af H5N1-stammen af ​​virussen, finansierer den amerikanske regering i øjeblikket forskning i en fugleinfluenzavaccine ved hjælp af cellekulturer.

Ikke-pattedyr cellekulturer

Plantecellekulturer

Plantecellekulturer dyrkes sædvanligvis enten som en suspension i et flydende næringsmedium eller som en calluskultur på en fast næringsstofbase. Dyrkning af udifferentierede celler og callus kræver opretholdelse af en vis balance mellem plantevæksthormoner auxiner og cytokininer .

Bakterie-, gærkulturer

Til dyrkning af et lille antal bakterie- og gærceller udplades cellerne på et fast næringsmedium baseret på gelatine eller agar-agar . Til masseproduktion anvendes dyrkning i flydende næringsmedier (bouillon).

Virale kulturer

Viruskulturer dyrkes i pattedyr- , plante- , svampe- eller bakteriecellekulturer , afhængigt af den naturlige vært for den særlige type virus . Men under visse forhold kan de dyrkes i celler af en anden type.

I dette tilfælde tjener selve cellekulturen som et medium til vækst og replikation af virussen.

Typer af cellelinjer

Kort liste over cellelinjer

Listen over de mest almindelige cellelinjer givet her er på ingen måde udtømmende.

cellelinje Forklaring af forkortelsen organisme Tekstil Morfologi Noter og links
293-T human nyre (embryonal) Afledt af HEK-293 ECACC
3T3 celler "3-dages overførsel, inokulum 3 x 105 celler" mus embryonale fibroblaster Også kendt som NIH 3T3 CLS ECACC
721 human melanom
9L rotte glioblastom
A2780 human æggestok livmoderhalskræft ECACC
A2780ADR human æggestok derivat af A2780 med resistens over for adriamycin ECACC
A2780cis human æggestok cisplatin-resistent derivat af A2780 ECACC
A172 human glioblastom ondartet gliom CLS ECACC
A431 human hudepitel planocellulært karcinom CLS ECACC cellelinjedatabase
A-549 human lungekarcinom epitel CLS DSMZ ECACC
B35 rotte neuroblastom ATCC  (utilgængeligt link)
BCP-1 human perifere leukocytter HIV+ lymfom ATCC
BEAS-2B bronkial epitel + adenovirus 12-SV40 virus hybrid (Ad12SV40) human lunger epitel ATCC  (utilgængeligt link)
bøjning.3 endotel i hjernen mus cortex endotel ATCC
BHK-21 "Baby Hamster Nyre" hamster knop fibroblaster CLS ECACC Olympus Arkiveret 27. december 2009 på Wayback Machine
BR 293 human bryst krebs
BxPC3 Biopsi xenograf af bugspytkirtelcarcinom linje 3 human pancreas adenocarcinom epitel ATCC  (utilgængeligt link)
C3H-10T1/2 mus embryonale mesenkymale celler ECACC
C6/36 Aedes albopictus (myg) larvevæv ECACC
CHO Kinesisk hamster æggestok grå hamster (Cricetulus griseus) æggestok epitel CLS ECACC ICLC  (utilgængeligt link)
COR-L23 human lunger ECACC
COR-L23/CPR human lunger ECACC
COR-L23/5010 human lunger ECACC
COR-L23/R23 human lunger epitel ECACC
COS-7 Cercopithecus aethiops, oprindelsesdefekt SV-40 abe Cercopithecus aethiops knop fibroblaster CLS ECACC ATCC
CML T1 Kronisk myelod leukæmi T-lymfocyt 1 human kronisk myeloid leukæmi T-celle leukæmi Blod
CMT hunde brysttumor hund bryst epitel
D17 hund osteosarkom ECACC
DH82 hund histiocytose monocytter/makrofager ECACC

J Vir Meth

DU145 human karcinom prostata CLS
DuCaP Dura mater kræft i prostata human metastatisk prostatacancer epitel 11317521
EL4 mus T-celle leukæmi ECACC
EMT6/AR1 mus bryst epitel ECACC
EMT6/AR10.0 mus bryst epitel ECACC
FM3 human metastaser til en lymfeknude melanom
H1299 human lunger krebs
H69 human lunger ECACC
HB54 hybridom hybridom udskiller MA2.1 mAb (mod HLA-A2 og HLA-B17) Journal of Immunology
HB55 hybridom hybridom udskiller L243 mAb (mod HLA-DR) Human immunologi
HCA2 human fibroblaster Journal of General Virology
HEK-293 menneskelig embryonal nyre human nyre (embryonal) epitel CLS ATCC
HeLa Henriette mangler human livmoderhalskræft epitel CLS DSMZ ECACC
Hepa1c1c7 klon 7 af klon 1 hepatom linje 1 mus hepatom epitel ECACC

ATCC  (utilgængeligt link)

HL-60 human leukæmi human myeloblaster blodceller CLS ECACC DSMZ
HMEC human brystepitelcelle human epitel ECACC
HT-29 human colon epitel adenocarcinom HT-29 ECACC

Cellelinjedatabase

Jurkat human T-celle leukæmi hvide blodceller ECACC

DSMZ

JY human lymfoblaster B-celler udødeliggjort af EBV
K562 human lymfoblaster kronisk myeloid leukæmi CLS ECACC
Ku812 human lymfoblaster erythroleukæmi ECACC

LGC-standarder

KCL22 human lymfoblaster kronisk myeloid leukæmi
KYO1 Kyoto 1 human lymfoblaster kronisk myeloid leukæmi DSMZ
LNCap Lymfeknudekræft i prostata human prostata adenokarcinom epitel CLS ECACC ATCC  (utilgængeligt link)
Ma-Mel 1, 2, 3….48 human melanom cellelinjer
MC-38 mus adenocarcinom
MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 human bryst invasivt duktalt karcinom i brystet ER+, PR+ CLS
MCF-10A Michigan Cancer Foundation human bryst epitel ATCC
MDA-MB-231 MD Anderson-metastatisk bryst human bryst krebs ECACC
MDA-MB-468 MD Anderson-metastatisk bryst human bryst krebs ECACC
MDA-MB-435 MD Anderson-metastatisk bryst human bryst melanom eller karcinom (ingen konsensus) Cambridge Pathology ECACC
MDCK II Madin Darby hundenyre hund knop epitel CLS ECACC ATCC
MOR/0,2R human lunger ECACC
NCI-H69/CPR human lunger ECACC
NCI-H69/LX10 human lunger ECACC
NCI-H69/LX20 human lunger ECACC
NCI-H69/LX4 human lunger ECACC
NIH-3T3 National Institutes of Health, 3-dages overførsel, inokulum 3 x 10 5 celler mus Foster fibroblaster CLS ECACC ATCC
NALM-1 perifert blod kronisk myeloid leukæmi Kræftgenetik og cytogenetik
NW-145 melanom ESTDAB Arkiveret 16. november 2011 på Wayback Machine
OPCN/OPCT Onyvax [1] Prostatakræft…. human prostatacancer cellelinjer Asterand Arkiveret 7. juli 2011 på Wayback Machine
jævnaldrende human T-celle leukæmi DSMZ
PNT-1A / PNT 2 prostatacancer cellelinjer ECACC
RenCa Nyrekarcinom mus nyrekarcinom CLS
RIN-5F mus bugspytkirtlen
RMA/RMAS mus T-cellekræft
Saos-2 human osteoxarkom CLS ECACC
Sf-9 Spodoptera frugiperda sommerfugl Spodoptera frugiperda æggestok CLS DSMZ ECACC
SkBr3 human brystkarcinom CLS
T2 human hybridom af B-celler og T-celle leukæmi DSMZ
T-47D human bryst kanalkarcinom CLS
T84 human tyktarmskarcinom/lungemetastaser epitel [2] ECACC ATCC
THP1 human monocytter akut myeloid leukæmi CLS ECACC
U373 human glioblastom-astrocytom epitel
U87 human glioblastom-astrocytom epitel CLS Abcam
U937 human leukæmi monocytisk lymfom CLS ECACC
VCaP Vertebra Prostatakræft human metastatisk prostatacancer epitel ECACC ATCC Arkiveret 19. februar 2012 på Wayback Machine
Vero 'Vera Reno' ('grøn knop') / 'Vero' ('sand') Afrikansk grøn abe nyreepitel CLS ECACC
WM39 human læder primært melanom
WT-49 human lymfoblaster
X63 mus melanom
YAC-1 mus lymfom Cellelinjedatabase CLS ECACC
YAR human B-lymfocytter transformeret EBV [3] Human Immunology Arkiveret 20. september 2008 på Wayback Machine

Se også

Noter

  1. ↑ Ringers løsning
  2. ↑ Arkiveret kopi (link ikke tilgængeligt) . Hentet 24. marts 2009. Arkiveret fra originalen 1. september 2006. 
  3. ↑ Celler kan isoleres fra væv og opdeles i forskellige typer (utilgængeligt link) . Dato for adgang: 24. marts 2009. Arkiveret fra originalen 26. maj 2009. 
  4. ↑ Laboratorium. Dyrkning af celler og væv . www.primer.ru (2003). Hentet 27. marts 2010. Arkiveret fra originalen 10. maj 2003.
  5. ↑ Telomerase . Mørkt stof (15. september 2006). Hentet: 27. marts 2010.
  6. ↑ Maqsood MI, Matin MM, Bahrami AR, Ghasroldasht MM (2013). Udødelighed af cellelinjer: udfordringer og fordele ved etablering. Cellebiologi International. 37(10), 1038-1045. doi : 10.1002/cbin.10137 PMID 23723166
  7. ↑ Binder CO2 inkubatorer (Tyskland) . Techservice . Hentet 27. marts 2010. Arkiveret fra originalen 19. november 2012.
  8. ↑ Laboratorieudstyr og forbrugsstoffer. Inkubatorer (2007). Hentet 27. marts 2010. Arkiveret fra originalen 8. juni 2012.
  9. ↑ Ved hjælp af medier med en bestemt kemisk sammensætning kan specifikke vækstfaktorer identificeres (utilgængeligt link) . Hentet 24. marts 2009. Arkiveret fra originalen 10. november 2007. 
  10. ↑ LipiMAX oprenset lipoproteinopløsning fra bovint serum . Selborne Biological Services (2006). Hentet 27. marts 2010. Arkiveret fra originalen 8. juni 2012.
  11. ↑ Lundup A.V., Demchenko A.G., Tenchurin T.Kh., Krasheninnikov M.E., Klabukov I.D., Shepelev A.D., Mamagulashvili V.G., Oganesyan R.V., Orekhov A.S., Chvalun S.N., Dyuzheva T.G. Forbedring af effektiviteten af ​​kolonisering af bionedbrydelige matricer af stroma- og epitelceller under dynamisk dyrkning  // gener og celler. - 2016. - T. 11 , nr. 3 . - S. 102-107 . — ISSN 2313-1829 .
  12. ↑ Guller A.E., Grebenyuk P.N., Shekhter A.B., Zvyagin A.V., Deev S.M. Vævskonstruktion af tumorer ved hjælp af bioreaktorteknologier  // Acta Naturae (russisk version). - 2016. - T. 8 , nr. 3 . - S. 49-65 . — ISSN 2075-8243 .
  13. ↑ Mekanisme for virusinfektion
  14. ↑ V. Bogomolova. Hvem ejer vores krop? . Arcanus (3. august 2009). Hentet 27. marts 2010. Arkiveret fra originalen 5. marts 2016.

Links

  Gå til Wikidata-elementet  Ordbøger og encyklopædier
I bibliografiske kataloger