Entner-Dudoroff pathway , eller KDFG-pathway [1] ( Eng. Entner-Doudoroff pathway ) er en glucoseoxidationsvej (sammen med glykolyse og pentosephosphat-vejen ), der fører til dannelsen af to pyruvatmolekyler , et ATP -molekyle og to molekyler fra et reduceredeglukosemolekyle pyridinnukleotider ( NADH og NADPH ) [ 2] . Selvom man tidligere troede, at det kun forekommer i et lille antal gram -negative bakterier , er det nu fastslået, at denne vej er ekstremt udbredt i naturen og bruges af forskellige grupper af gram-positive og gram-negative bakterier, samt nogle arkæer og endda eukaryoter [3] .
Beskeden om opdagelsen af Entner-Dudorov-stien blev offentliggjort i 1952 af de amerikanske videnskabsmænd Nathan Entner og Mikhail Dudorov [4] . I deres arbejde leverede de overbevisende beviser for en ny, tidligere ubeskrevet glukosemetabolismevej i bakterien Pseudomonas saccharophila Deres konklusioner var baseret på den observation, at det første carbonatom ( C1) i glukose næsten alt går til CO 2 , mens mekanismen for glukosemetabolisme tydeligvis ikke inkluderede den primære decarboxylering af glukosemolekylet. Ved at bruge dinitrophenol - behandlede celler fandt de ud af, at 1 mol C1-mærket glucose til sidst blev omdannet til 2 mol pyrodruesyre (pyruvat), hvor alle de mærkede atomer var i pyruvats carboxylgruppe . I råcelleekstrakter blev enzymatisk aktivitet desuden fundet til at spalte 6 - phosphogluconsyre til pyruvat og glyceraldehyd-3-phosphat . De antog også, at 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconat (KDPG) var en nøgleforbindelse i spaltningen af en seks-carbon-forbindelse til to tre-carbon-forbindelser . Efterfølgende blev CDPG isoleret i krystallinsk form fra en enzymcelleblanding med 6-phosphogluconsyre. To stadier af processen - dannelsen af CDPG fra 6-phosphogluconat og spaltningen af CDPG til pyruvat og glyceraldehyd-3-phosphat - blev etableret efter isoleringen af enzymerne, der udfører disse transformationer (for flere detaljer, se nedenfor) [ 3] .
Den generelle ordning for Entner-Dudorov-stien er som følger. Glucose-6-phosphat , dannet under phosphoryleringen af 1 glucosemolekyle med forbruget af 1 ATP-molekyle, går over i 6-phosphogluconat med restaurering af NADP -molekylet og dannelsen af NADP٠H [5] . Med yderligere dehydrering af 6-phosphogluconat dannes 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconat (KDPG), nøgleforbindelsen i pathwayen [3] . CDPG spaltes til pyruvat og glyceraldehyd-3-phosphat ( 3-PHA ). Med yderligere oxidation af 3-PHA til pyruvat reduceres 1 NAD -molekyle til NADH og 2 ATP dannes ved substratphosphorylering . Entner-Doudoroff-vejen involverer 2 unikke enzymer: 6-phosphogluconate dehydratase , som omdanner 6-phosphogluconate til CDPG, og CDPG-aldolase , som katalyserer aldol-spaltningen CDPG til pyruvat og 3-PHA [6] .
Entner-Doudoroff-vejen kan ses som et alternativ til glykolyse . Det generelle skema for disse to glucoseoxidationsveje er ekstremt ens: 6-carbon- sukkere aktiveres ved phosphorylering og nedbrydes derefter af enzymer fra aldolasegruppen til to tre-carbon-forbindelser. Forskellen ligger i arten af de mellemliggende 6-carbon-forbindelser, som nedbrydes til tre-carbon-produkter. Under glykolyse nedbrydes fructose-1,6-bisphosphat til 3-PHA og dihydroxyacetonephosphat , og under Entner-Doudoroff-vejen spaltes CDPG til 3-PHA og pyruvat [3] . Entner-Doudoroff-vejen indeholder således kun to reaktioner, der er supplerende til reaktionerne af glykolyse og pentosephosphat-vejen. Entner-Dudoroff-vejen adskiller sig imidlertid fra glykolyse ved, at den producerer et NADPH-molekyle og, som et samlet energioutput, kun ét, ikke to, ATP-molekyler [6] .
Blandt bakterier er Entner-Doudoroff-vejen næsten udelukkende blevet beskrevet i gramnegative bakterier ; en sjælden undtagelse er den gram -positive tarmbakterie Enterococcus faecalis [7] .
Forskellige organismer bruger Entner-Doudoroff-vejen på forskellige måder. Kun i et lille antal organismer er Entner-Dudoroff-vejen udelukkende involveret i katabolisme , forløber ifølge en lineær mekanisme, bruges konstant (konstitutivt) og danner grundlaget for central metabolisme. Så især sker det i Zymomonas mobilis ; denne bakterie er også den eneste organisme, der vides at bruge Entner-Doudoroff-vejen under anaerobe forhold. Det pyruvat, der dannes i løbet af denne vej, omdannes til acetaldehyd, som omdannes til ethanol og kuldioxid, dvs. Zymomonas mobilis udfører alkoholisk gæring [3] . Generelt bruger fermentorer ikke Entner-Doudoroff-vejen, formodentlig på grund af lavt ATP-udbytte, da fermentering også er karakteriseret ved lav energieffektivitet af sukkerudnyttelse [ 6 ] . Udover Zymomonas mobilis bruges den anaerobe Entner-Dudoroff-vej også af Clostridium [3] .
I mange bakterier, især intestinale, forløber Entner-Doudoroff-vejen ifølge en lineær mekanisme og induceres kun, når den vokser på visse kulstofkilder, for eksempel på gluconat, og glykolyse og pentosephosphat-vejen danner grundlaget for central metabolisme . Sådan er for eksempel E. coli . I hende begynder syntesen af enzymer fra Entner-Dudorov-vejen kun i nærvær af gluconat i det ydre miljø. Pyruvaten dannet under Entner-Dudoroff-vejen er involveret i Krebs-cyklussen [3] . I nærvær af eksogen pyrroloquinolinquinon (PQQ), er en glucoseoxidase- cofaktor , E. coli og adskillige andre bakterier desuden i stand til at oxidere glucose til gluconat med dette enzym. Derefter phosphoryleres gluconatet og omdannes til 6-phosphogluconat, som videre bruges langs Entner-Doudoroff-vejen. I andre tilfælde kan gluconat oxideres af gluconatdehydrogenase til 2-ketogluconat, som derefter phosphoryleres og igen reduceres til 6-phosphogluconat [6] .
For de fleste pseudomonader forløber Entner-Dudorov-stien ifølge en speciel cyklisk mekanisme. 3-PHA , dannet under spaltningen af KDPG af KDPG-aldolase, omdannes direkte til 6-phosphogluconat ved hjælp af gluconeogene enzymer. Ud over pseudomonader er en cyklisk variant af Entner-Doudoroff-vejen blevet beskrevet i nogle beslægtede mikroorganismer , især Azotobacter vinelandii og andre [3] .
Entner-Dudoroff-vejen bruges også af nogle methylotrofe mikroorganismer. Nogle obligate og fakultative methylotrofer fikserer formaldehyd ved hjælp af ribulose monophosphate pathway (RMP ) . I den første fase af denne vej dannes fructose-6-phosphat ud fra formaldehyd og ribulose-5-phosphat . I det andet trin, i nogle varianter af RMP , omdannes fructose-6-phosphat til forbindelser med tre carbonatomer via Entner-Doudoroff-vejen. Først omdannes fructose-6-phosphat til isomer glucose-6-phosphat, som spaltes til pyruvat og 3-FGK via Entner-Dudoroff-vejen . Sidstnævnte omdannes derefter til ribulose-5-phosphat. Denne variant af kulhydratmetabolisme blev fundet i en række obligate methylotrofer, såvel som i nogle fakultative. I dette tilfælde er Entner-Dudoroff-vejen således involveret i den anabolske proces (dannelsen af ribulose-5-phosphat), så den kan være vigtig ikke kun i kataboliske, men også i anabolske processer [3] .
En undersøgelse fra 2015 viste, at marine bakterier er meget afhængige af Entner-Doudoroff-vejen. Denne undersøgelse undersøgte forskellige stammer af glukose-brugende marine bakterier, der tilhører forskellige, fylogenetisk fjerne grupper af bakterier: phyla Alphaproteobacteria , Gammaproteobacteria og Bacteroidetes . Det viste sig, at 90 % af stammerne brugte Entner-Doudoroff-vejen til glukosemetabolisme, mens Embden-Meyerhof-Parnassus-vejen (normal glykolyse) kun brugte 10 %. Terrestriske bakterier bruger på den anden side fortrinsvis den anden vej, som giver et større udbytte af ATP. I marine bakterier giver brugen af Entner-Doudoroff-vejen større modstand mod oxidativt stress . Entner-Dudoroff-vejen kan således spille en vigtig rolle i omdannelsen af mono- og polysaccharider i bakteriesamfund i marine økosystemer [8] .
I Vibrio cholerae er Entner-Doudoroff-vejen nødvendig for udnyttelsen af gluconat og er afgørende for virulensen af denne bakterie [9] . En undersøgelse fra 2014 viste, at i plantepatogenet Xanthomonas campestris , er Entner-Doudoroff-vejen hovedvejen for glucosekatabolisme [10] .
Som nævnt ovenfor er Entner-Doudoroff-vejen blevet fundet i nogle eukaryoter, nemlig Entamoeba histolytica , Aspergillus niger og Penicillum notatum . Derudover er der fundet enzymer, der ligner 6-phosphogluconate dehydratase og CDPG-aldolase i kolever , de er involveret i syntesen af hydroxyprolin [3] . Entner-Doudoroff-vejen er også blevet beskrevet i nogle fotosyntetiske eukaryoter, især kiselalgen Phaeodactylum tricornutum . I denne alge foregår reaktionsvejene i mitokondrierne . Måske gør tilstedeværelsen af denne variant det muligt for alger at bruge, i stedet for en højeffektiv glukosekatabolismevej, hvis enzymsyntese kræver meget energi (normal glykolyse), en vej med mindre effektivitet, men også billigere i hvad angår enzymsyntese, hvilket kan give en vis fordel [11] .
I 2014 blev der gjort et forsøg på at introducere Entner-Doudoroff-vejen i celler af gæren Saccharomyces cerevisiae . Til dette formål blev E. coli 6-phosphogluconat-dehydratase og CDPG-aldolase udtrykt i gærceller . Forsøget var dog mislykket: E. coli CDPG-aldolase indeholdende jern-svovl-klynger kunne ikke fungere normalt i gærceller [12] .
Der er følgende ændringer af Entner-Dudorov-stien:
Der er ingen konsensus blandt forskere, hvilken af mekanismerne bag glucoseoxidation (glykolyse eller Entner-Doudoroff-vejen) der dukkede op først. Tidligere troede man, at glykolysens større oldtid er bevist af dens ekstremt brede fordeling blandt alle cellulære livsformer. Men nu hvor det er åbenlyst, at Entner-Dudorov-stien også er meget udbredt, kan dette argument ikke længere tages i betragtning. Til fordel for Entner-Dudorov-stiens større oldtid er det faktum, at den findes hos nogle primitive vandrere ( Zymomonas mobilis ). Desuden indikerer eksistensen af modifikationer af Entner-Doudoroff-vejen, hvor ikke-phosphorylerede forbindelser omdannes, at den kan være blevet brugt af de første fermenteringsbeholdere på Jorden [ 3] .
Der er også et synspunkt om, at Entner-Dudoroff-vejen udviklede sig sammen med aerob respiration og Krebs-cyklussen som et middel til hurtig dannelse af pyruvat fra sukkerarter. Men tilstedeværelsen af Entner-Dudoroff-vejen i obligate fermentorer ( Zymomonas mobilis ) og obligate anaerober (clostridia) sår tvivl om denne antagelse [3] .
På nuværende tidspunkt begynder Entner-Dudoroff-vejen at blive brugt i bioteknologi til at udvikle eller øge effektiviteten af dannelsen af en række nyttige forbindelser. I 2015 blev der således udgivet et papir, der rapporterede om den vellykkede introduktion af yderligere enzymer af denne vej fra Zymomonas mobilis- celler til E. coli-celler . Som et resultat steg effektiviteten af NADPH-dannelse under denne vej med 25 gange. NADPH fungerer som en co-faktor i biosyntesen af en række værdifulde forbindelser, såsom isoprenoider , fedtsyrederivater og biopolymerer , derfor er metoder til at øge dannelsen af NADPH af stor bioteknologisk betydning [15] . I et andet arbejde blev Entner-Doudoroff-vejen sammen med serin - deamineringsvejen og pyruvatdehydrogenasekomplekset brugt til at forbedre produktionen af poly-3-hydroxybutyrat (en biologisk nedbrydelig bioplast ) af E. coli-celler [16] . Kombinationen af Entner-Doudoroff-vejen med 2-C-methyl-D-erytriol-4-phosphat-vejen tillader en stigning i isoprenproduktionen i genetisk modificerede E. coli-celler [17] .