Reaktive oxygenarter (ROS, reactive oxygen species, ROS, eng. Reactive oxygen species, ROS ) - omfatter oxygenioner , frie radikaler og peroxider af både uorganisk og organisk oprindelse. Disse er normalt små molekyler med exceptionel reaktivitet på grund af tilstedeværelsen af en uparret elektron i det ydre elektroniske niveau.
ROS dannes konstant i en levende celle som produkter af normalt iltstofskifte . Reaktive oxygenarter dannes også under påvirkning af ioniserende stråling . Nogle ROS kan spille rollen som mediatorer af vigtige intracellulære signalveje. Øget ROS-produktion fører dog til oxidativt stress . ROS' normale funktioner omfatter induktion af immunsystemet og mobilisering af iontransportsystemer . For eksempel begynder blodceller på skadestedet at producere ROS, som rekrutterer blodplader, der er nødvendige for at starte sårhelingsprocessen. ROS udløser også programmeret celledød ( apoptose ).
Omkring 98% af den totale ilt, der forbruges af cellen, reduceres i mitokondrier til vand i processen med oxidativ fosforylering , men 2% på grund af bivirkninger, hovedsageligt i begyndelsen eller midt i den mitokondrielle respirationskæde , inklusive reaktioner katalyseret af cytochrom c-oxidase , omdannes først til delvist reduceret oxygensuperoxid , og derefter til hydroxylgruppen OH•, også relateret til ROS [1] . Ud over mitokondrier kan lipofuscin , der akkumuleres i celler, føre til dannelsen af ROS som følge af Fenton-reaktionen på grund af dets evne til at kombinere med visse overgangsmetaller [2] [3] . Cellebeskyttelse mod ROS udføres af adskillige antioxidantenzymer ( superoxiddismutase , katalase og peroxiredoxiner ) og antioxidanter med lille molekylvægt ( vitamin C , glutathion , urinsyre ). Derudover har polyfenoler (for eksempel analoger af nogle komponenter af rødvin ) antioxidantegenskaber .
Effekten af ROS på cellulær metabolisme er videnskabeligt bevist og understøttet af beviser fra forskellige undersøgelser [4] . De er ikke kun involveret i apoptose (programmeret celledød), men fører også til positive resultater, såsom induktion af beskyttende [5] [6] værtsgener og mobilisering af iontransportører . Dette tyder på, at de kontrollerer cellulære funktioner. Især blodplader, som er involveret i sårheling og homeostase, frigiver ROS for at tiltrække endnu flere blodplader til skadestedet. Der er også en forbindelse med det adaptive immunsystem ved at tiltrække leukocytter .
Reaktive oxygenarter er involveret i cellulære processer i forskellige inflammatoriske reaktioner, herunder sygdomme i det kardiovaskulære system . Derudover er de ansvarlige for høretab på grund af beskadigelse af sneglen ved høje lyde, på grund af ototoksiciteten af lægemidler som cisplatin, og medfødt døvhed hos dyr og mennesker. ROS medierer processen med apoptose eller programmeret celledød og iskæmi. Eksempler er slagtilfælde og hjerteanfald.
Generelt består den destruktive effekt af reaktive oxygenarter på cellen oftest i [7] :
Når en plante genkender et fremmed patogen, producerer den først og fremmest hurtigt superoxid eller hydrogenperoxid for at styrke cellevæggen. Dette forhindrer patogenet i at sprede sig til andre dele af planten. Et net dannes faktisk omkring patogenet, hvilket begrænser dets bevægelse og reproduktion.
Hos en pattedyrvært aktiverer ROS antimikrobiel beskyttelse [8] . Betydningen af denne beskyttelse kan ses hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom, som lider af utilstrækkelig produktion af ROS. De er meget modtagelige for forskellige infektioner, herunder dem forårsaget af Salmonella enterica , Staphylococcus aureus , Serratia marcescens og Aspergillus spp .
Undersøgelser af homeostasen af frugtfluers fordøjelseskanal (Drosophila melanogaster) viser, at ROS-produktionen fungerer som en nøglefaktor i immunresponset i insekttarmen. ROS udfører en bakteriedræbende funktion, beskadiger DNA, RNA og proteiner og fungerer også som signalmolekyler, der udløser epitelregenereringsmekanismer [9] . Uracil , som udskilles af mikroorganismer, sætter gang i produktionen og den efterfølgende aktivitet af dobbeltoxidase (Duox), et enzym, der producerer ROS i tarmen. Duox-aktivitet korrelerer med uracilkoncentrationen i tarmen, og under basale forhold undertrykkes den af proteinkinasen MkP3 . Stram kontrol af Duox hæmmer overdreven produktion af ROS og letter genkendelsen af gavnlige og skadelige mikroorganismer i tarmen [10] .
Den måde, hvorpå ROS beskytter værten mod skadelige mikroorganismer, er endnu ikke fuldt ud forstået. Mest sandsynligt består det i beskadigelse af mikrobernes DNA. Salmonella-forskning viser, at den havde brug for DNA-reparationsmekanismer for at forsvare sig mod dødelige ATP-angreb. Rollen af ROS i antivirale forsvarsmekanismer kan observeres gennem Rig-lignende helicase-1 og mitokondrielt antiviralt signalprotein. Høje niveauer af ROS amplificerer signaler gennem disse mitokondrielle antivirale receptorer for at aktivere interferon regulatorisk faktor (IRF) 3, IRF7 og nuklear faktor kappa B (NF-KB) og neutralisere vira [11] . Luftvejsepitelceller tænder mitokondriel ROS som reaktion på influenzainfektion. Aktiviteten af ROS indebærer stimulering af type III interferon og neutralisering af vira, hvilket begrænser muligheden for replikation [12] . ROS er involveret i værtens forsvar mod mykobakterier, selvom de sandsynligvis ikke direkte dræber dem. ROS virker snarere på ROS-afhængig signalering, for eksempel til cytokinproduktion, autofagi og granulomdannelse [13] [14] .
Reaktive oxygenarter er også involveret i aktivering, anergi og apoptose af T-lymfocytter [15] .
I aerobe livsformer produceres den energi, der er nødvendig for implementeringen af biologiske funktioner, af mitokondrier langs elektrontransportkæden . Reaktive oxygenarter (ROS), som har potentiale til at skade celler, produceres sammen med energi. ROS kan beskadige lipider, DNA, RNA og proteiner, som i teorien bidrager til fysiologiske ændringer under aldring.
ROS forekommer som et normalt produkt af cellulær metabolisme . Blandt dem er den vigtigste anstifter af oxidativ skade hydrogenperoxid (H 2 O 2 ), som opstår fra superoxid udskilt af mitokondrier. Catalase og superoxiddismutase afbøder de skadelige virkninger af henholdsvis hydrogenperoxid og superoxid ved at omdanne disse stoffer til oxygen og hydrogenperoxid (som senere bliver til vand) - det vil sige, at de producerer harmløse molekyler. Disse transformationer er imidlertid ikke 100 % effektive, og peroxidrester forbliver i cellerne. Selvom ROS er et produkt af cellernes normale funktion, fører deres overskud til skadelige konsekvenser [16] .
Med alderen forringes en persons hukommelse, som det er tydeligt i degenerative sygdomme som Alzheimers sygdom , som er ledsaget af ophobning af oxidativ skade. Moderne forskning viser, at ophobning af ROS reducerer kroppens fysiske ydeevne, da oxidative skader bidrager til senilitet. Især fører akkumulering af oxidative skader til kognitiv dysfunktion, som bekræftet af en undersøgelse i gamle rotter, der fik mitokondrielle metabolitter og derefter fik dem til at gennemgå kognitive tests. Baseret på resultaterne klarede rotterne sig bedre på opgaver efter metabolitterne, hvilket tyder på, at metabolitterne vendte oxidativ skade og forbedrede mitokondriefunktionen [17] . Akkumuleringen af oxidativ skade kan påvirke effektiviteten af mitokondrier og fremskynde produktionen af ROS [18] . Den akkumulerede oxidative skade og dens rolle i ældningsprocessen afhænger af typen af beskadiget væv. Yderligere test har hjulpet med at fastslå, at oxidativ skade er ansvarlig for aldersrelateret forringelse af hjernens funktion. Gamle klorede ørkenrotter har en højere koncentration af oxiderede proteiner end unge gnavere. Behandling af gamle og unge mus med spin-fælder resulterede i et fald i oxiderede proteiner hos gamle ørkenrotter, men havde ingen effekt på unge. Derudover klarede ældre ørkenrotter sig bedre på kognitive test under behandlingen, men havde nedsat funktionalitet, når behandlingen blev stoppet og niveauet af oxiderede proteiner steg igen. Baseret på disse resultater konkluderede forskerne, at oxidationen af cellulære proteiner potentielt er forbundet med hjernens funktion [19] .
Teorien om frie radikaler om aldring siger, at oxidativ skade forårsaget af reaktive oxygenarter fremkalder forringelsen af de funktioner, der er karakteristiske for aldring. Resultaterne af invertebratundersøgelser tyder på, at dyr, der er genetisk disponerede for mangel på visse antioxidantenzymer (såsom SOD ( superoxiddismutase )) har en reduceret levetid (som man ville foreslå baseret på teori), men omvendt manipulation for at øge antioxidantenzymer gjorde det ikke have en vedvarende effekt på levetiden (selvom nogle undersøgelser i Drosophila bekræfter, at levetiden kan øges ved overekspression af mangan-SOD og enzymer involveret i glutathionbiosyntese). Denne teori modsiges af det faktum, at fjernelse af mitokondriel SOD2 øger levetiden hos Caenorhabditis elegans [20] .
Med mus er der en forbipasserende historie. Fjernelse af antioxidantenzymer resulterer generelt i en forkortet levetid, selvom overekspressionsundersøgelser (med få nylige undtagelser) ikke konsekvent har øget levetiden [21] . En undersøgelse af for tidlig ældning hos rotter afslørede øget oxidativt stress, reduceret aktivitet af antioxidantenzymer og signifikant DNA-skade i neocortex og hippocampus hos for tidligt ældede modeldyr sammenlignet med normalt aldrende kontrolrotter [22] . DNA-skademarkør 8-OHdG ( 8-Oxo-2'-deoxyguanosin ) er et produkt af ROS-interaktion med DNA. Talrige undersøgelser har vist, at indholdet af 8-OHdG stiger med alderen i forskellige organer hos pattedyr [23] .
ROS vises konstant i det biologiske system for at udføre regulatoriske funktioner og fjernes derefter fra det [24] . Under normale fysiologiske forhold kontrollerer celler niveauet af ROS ved at opretholde en balance mellem generering og fjernelse af ROS gennem oprensningssystemerne. Men under forhold med oxidativ stress ødelægger overdreven akkumulering af ROS cellulære proteiner, lipider og DNA, hvilket forårsager irreversible fokale læsioner i cellen, som bidrager til carcinogenese.
Kræftceller oplever større ROS-stress end raske celler, delvist på grund af onkogen stimulering, øget metabolisk aktivitet og mitokondriesvigt. AFC er et tveægget sværd. På den ene side bidrager de til kræftcellernes overlevelse, da progressionen af cellecyklussen under påvirkning af vækstfaktorer og receptortyrosinkinaser (RTK'er) kræver ROS for aktivering [25] . Kronisk inflammation, den vigtigste mediator af kræft, styres også af ROS. På den anden side undertrykker en øget koncentration af ROS tumorvækst gennem vedvarende aktivering af en cellecyklushæmmer [26] [27] og initiering af et program for celledød og fysiologisk aldring på grund af skade på makromolekyler. De fleste kemoterapeutiske og radioterapeutiske midler dræber faktisk kræftceller ved at forværre ROS-stress [28] [29] . Kræftcellers evne til at skelne mellem ROS-signaler for overlevelse og apoptose bestemmes af dosis, varighed, type og placering af ROS-produktion. Kræftceller kræver en moderat koncentration af ROS for at overleve, og et for højt niveau fører til deres død.
Metabolisk tilpasning af tumorvævet balancerer cellens behov for energi med det lige så vigtige behov for makromolekylære komponenter og streng kontrol med redoxbalancen. Som et resultat er produktionen af NADPH som en reducerende cofaktor i mange enzymatiske reaktioner af makromolekylær biosyntese stærkt forbedret . Samtidig redder denne forbindelse celler fra overskydende ROS som følge af hurtig spredning. Celler modvægter de skadelige virkninger af ROS ved at producere antioxidanter såsom reduceret glutathion (GSH) og thioredoxin (TRX), som kræver NADPH's reducerende evne til at opretholde aktivitet [30] .
De fleste kræftrisikofaktorer interagerer med celler gennem ROS. ROS aktiverer forskellige transkriptionsfaktorer såsom universel aktiveret B-celle transkriptionsfaktor ( NF-KB ), aktivatorprotein-1 (AP-1), hypoxi-inducerbar faktor 1-alfa, signaltransducer og transkriptionsaktivator 3 (STAT3), som fører til ekspression af proteiner, der kontrollerer inflammation, celletransformation, tumorcelleoverlevelse, tumorcelleproliferation, invasion, angiogenese og metastase. ROS kontrollerer også ekspressionen af forskellige tumorsuppressorgener, såsom p53, retinoblastomprotein (Rb-gen), phosphatase og tensinhomolog (PTEN) [31] .
ROS-relateret DNA-oxidation er en af hovedårsagerne til mutationer, der fører til flere typer DNA-skader, herunder modifikationer af svage (8-oxoguanin og formamidopyrimidin) og stærke (cyclopurin og ethnoaddukter) baser, AP-steder, atypiske enkeltstrengede baser. brud, DNA-addukter og intra- og intermolekylære tværbindinger [32] . Forskerne har beregnet, at endogene ROS, som dannes som et resultat af normal cellulær metabolisme, modificerer cirka 20.000 DNA-baser om dagen i en celle. 8-oxoguanin er den mest almindelige af alle de forskellige observerede oxiderede nitrogenholdige baser. Under replikation mismatcher DNA-polymerase 8-oxoguanin med adenin, hvilket resulterer i en G→T-transversion. Den resulterende genomiske ustabilitet bidrager direkte til carcinogenese. Cellulær transformation fører til kræftudvikling, og interaktionen af en atypisk isoform af proteinkinase C type zeta ( PKC-ζ) med p47phox kontrollerer ROS-produktion og transformation fra tumorstamceller gennem et nødstilfælde "bobleskjold"-program [33] [34] .
Ukontrolleret spredning er et karakteristisk træk ved cancerceller. Eksogen og endogen ROS øger proliferationen af kræftceller. Det faktum, at ROS fremmer tumorvækst, understøtter yderligere iagttagelser af, at midler med potentiale til at hæmme ROS-dannelse også kan hæmme cancercelleproliferation [31] . Selvom ROS fremmer tumorcelleproliferation, er en signifikant stigning i ROS-koncentration forbundet med et fald i proliferation på grund af G2/M-fasestop af cellecyklussen, øget phosphorylering af mutantproteinet i ataxia telangiectasia (ATM), checkpoint kinase 1 (Chk1) ), Chk 2 og forkortelse af cykluscelledeling 25 homolog C (CDC25) [35] .
Kræftcelledød kan forekomme på tre måder: apoptose , nekrose og autofagi . Overskydende ROS inducerer apoptose gennem både ydre og indre veje [36] . I den ydre vej for apoptose genereres ROS af Fas-liganden som en forløber for Fas-aktivering via phosphorylering, hvilket er nødvendigt for den efterfølgende rekruttering af det Fas-associerede dødsdomæneprotein og caspase 8, såvel som for induktion af apoptose [31] . I den interne vej fremmer ROS frigivelsen af cytochrom C ved at aktivere porestabiliserende proteiner (Bcl-2 og Bcl-xL) og blokere poredestabiliserende proteiner (Bcl-2-linked X-protein, Bcl-2 homologt antagonist-dræberprotein ) [37] . Den iboende vej, også kaldet caspase-kaskaden, begynder med mitokondriel skade, der udløser frigivelsen af cytochrom C. DNA-skader, oxidativt stress og tab af mitokondrielt membranpotentiale fører til frigivelsen af de førnævnte pro-apoptotiske proteiner, der stimulerer apoptose [38] . Mitokondriel skade er tæt forbundet med apoptose, og da mitokondrier let påvirkes, er der potentiale for onkoterapi [39] . De cytotoksiske egenskaber ved ROS virker som en drivkraft for apoptose, men kan ved en endnu højere koncentration af ROS føre til både apoptose og nekrose - en ukontrolleret form for celledød - af kræftceller [40] .
Talrige undersøgelser peger på veje og associationer af ROS-niveau med apoptose, men en ny forskningslinje forbinder ROS-koncentration og autofagi [41] . ROS kan forårsage celledød gennem autofagi, en uafhængig katabolisk proces, der består i sekvestrering af cytoplasmatisk indhold (udtømte eller beskadigede organeller og aggregerede proteiner) og dets nedbrydning af lysosomer [42] . Derfor opretholder autofagi cellesundhed under oxidativ stress. ROS-koncentrationsniveauer kan inducere autofagi i cellen på en række forskellige måder for at slippe af med skadelige organeller såsom kræftfremkaldende stoffer og forhindre skader uden at udløse apoptose [43] . Autofagisk celledød kan opstå som følge af overekspression af autofagi, når en celle opsluger for mange dele af sig selv i et forsøg på at kompensere for skader og ikke længere er i stand til at leve videre. Ved denne type død er der en stigning eller tab af kontrol over gener, der regulerer autofagi [44] . Så snart forskerne får en dybere forståelse af processen med autofagisk celledød og dens forhold til ROS, kan denne form for programmeret celledød tjene som en ny cancerterapi. Autofagi og apoptose er forskellige mekanismer for celledød forårsaget af høje niveauer af ROS. Imidlertid udvikler autofagi og apoptose sjældent i strengt uafhængige veje. Der er en bevist sammenhæng mellem ROS og autofagi og en sammenhæng mellem overskydende ROS og apoptose [43] . Depolarisering af mitokondriemembranen er et andet kendetegn ved begyndelsen af autofagi. Når beskadigede mitokondrier begynder at frigive ROS, påbegyndes autofagi for at slippe af med ubrugelige organeller. Hvis lægemidlet retter sig mod mitokondrierne og skaber ROS, vil autofagi hjælpe med at befri cellen for et stort antal mitokondrier og andre beskadigede organeller, der ikke var levedygtige. En overdreven mængde ROS og beskadigelse af mitokondrier kan også tjene som et signal om apoptose. Balancen mellem autofagi i cellen og den gensidige påvirkning af autofagi og apoptose medieret af ROS er afgørende for celleoverlevelse. Interaktionen og forholdet mellem autofagi og apoptose kan blive et mål for onkoterapier eller finde anvendelse i metoder til kombineret behandling af resistente kræftformer.
Ved stimulering med vækstfaktor receptor tyrosinkinaser (RTK'er), kan ROS udløse aktivering af signalveje involveret i cellemigration og -invasion, for eksempel fra mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) familien - ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK), c-jun NH-2-terminal kinase og p38 MAPK. ROS fremmer migration ved at øge phosphorylering af focal adhesion kinase (FAK) p130Cas og paxilin [45] .
In vitro og in vivo undersøgelser afslørede, at ROS inducerer transkriptionsfaktorer og modulerer signalmolekyler involveret i angiogenese (MMP, VEGF) og metastase (opregulering af AP-1, CXCR4, AKT og suppression af PTEN) [31] .
Eksperimentelle og epidemiologiske undersøgelser gennem de seneste år har fundet tætte sammenhænge mellem ROS, kronisk inflammation og cancer [31] . ROS fremkalder kronisk inflammation gennem induktion af COX-2, inflammatoriske cytokiner (TNFα, interleukin 1 ((IL-1), IL-6, kemokiner (IL-8, CXCR4) og pro-inflammatoriske transkriptionsfaktorer ( NF-κB ) [ 31]) Kemokiner og kemokinreceptorer fremmer igen invasion og metastasering af forskellige typer tumorer.
Der er strategier til at øge og reducere ROS-niveauer, men sidstnævnte foretrækkes oftere. Kræftceller med en høj koncentration af ROS er afhængige af et antioxidantforsvarssystem. ROS-forøgende lægemidler øger oxidativt stress, enten ved at generere ROS direkte (f.eks. motexafin gadolinium og elesclomol) eller ved midler, der lukker ned for det iboende antioxidantsystem, såsom en SOD-hæmmer (ATN-224, 2-methoxyestradiol) og en GSH-hæmmer (PEITC), butioninsulfoximin). Som følge heraf stiger niveauet af endogen ROS, hvilket, hvis tolerancetærsklen overskrides, kan forårsage celledød [46] . På den anden side er normale celler ved et lavt stressniveau bedre i stand til at klare de yderligere effekter, der genererer ROS, end kræftceller [47] . En stigning i koncentrationen af ROS i alle celler kan således betragtes som en måde at selektivt ødelægge cancerceller.
Strålebehandling er også baseret på toksiciteten af ROS, som ødelægger tumorceller. Stråleterapi bruger røntgenstråler, gammastråler og stråling fra tunge partikler såsom protoner og neutroner til at inducere celledød og ROS-medieret mitotisk katastrofe [31] .
På grund af ROS' dobbeltrolle er der udviklet både prooxidante og antioxidante anticancermidler. Imidlertid kan ROS-signalmodulation alene ikke betragtes som en ideel metode på grund af kræftcellernes tilpasning til ROS-stress, overflødige veje til at understøtte tumorvækst og toksiciteten af ROS-genererende anticancerlægemidler. Det er nødvendigt at kombinere ROS-genererende lægemidler med lægemidler, der kan interferere med redoxtilpasning for at opbygge den mest succesrige strategi til at øge kræftcellernes cytotoksicitet [31] .
James Watson [48] sammen med kolleger [49] foreslog, at manglen på intracellulær ROS på grund af manglende motion bidrager til tumormalignitet, da en maksimal koncentration af ROS er nødvendig for korrekt proteinfoldning i det endoplasmatiske retikulum. Et lavt niveau af ROS forhindrer specifikt dannelsen af tumorsuppressorproteiner [49] . Da fysisk træning forårsager midlertidige stigninger i ROS, forklarer dette det faktum, at fysisk aktivitet forbedrer prognosen for kræftpatienter. [50] Desuden er lægemidler, der kraftigt øger ROS-niveauer (f.eks. 2-deoxy-D-glucose og kulhydratbaserede cellulære stressinducere) mere effektive til at inducere kræftcelledød på grund af kræftcellers grådighed efter sukker [51] .