Lukket nukleinsyre

En låst nukleinsyre ( LNA), også kendt som en brodannende  nukleinsyre (BNA) [1] og ofte omtalt som utilgængelig RNA , er et modificeret RNA- nukleotid , hvori et ribosefragment er modificeret med en ekstra bro, der forbinder 2'- iltgruppe. og 4' carbon. Broen "låser" ribosen ind i den 3' - endo (nordlige) konformation, som ofte findes i A-form duplexer . Denne struktur giver øget modstand mod enzymatisk nedbrydning [2] [3] [4] [5] . LNA tilbyder også øget specificitet og affinitet for baseparring som en monomer eller komponent af et oligonukleotid [6] . LNA-nukleotider kan blandes med DNA- eller RNA-rester i et oligonukleotid.

Syntese

Obika et al. var de første til at syntetisere LNA kemisk i 1997 [7] og Jesper Wengels gruppe fulgte selvstændigt efter i 1998 [8] . Dette blev muligt efter at Zamechnik og Stevenson i 1978 lagde grunden til muligheden for, at oligonukleotider kunne være fremragende midler til at kontrollere genekspression [9] . Til dato har to forskellige tilgange, kaldet henholdsvis lineære og konvergerende strategier, vist sig at give høj ydeevne og effektivitet i LNA. Den lineære syntesestrategi blev først beskrevet i detaljer af Obick et al. [7] I denne tilgang kan uridin (eller et hvilket som helst tilgængeligt RNA- nukleosid ) bruges som udgangsmateriale . Den konvergerende strategi kræver syntese af et mellemliggende sukker, der tjener som en glycosyldonor , nødvendig for binding til nitrogenholdige baser . Typisk bruges D-glucose til at fremstille et mellemsukker, som efterfølgende reageres med nitrogenholdige baser ved hjælp af en modificeret Vorbrügen-procedure, der tillader stereoselektiv binding [10] .

Tilføjelsen af ​​forskellige fragmenter forbliver mulig, samtidig med at vigtige fysisk-kemiske egenskaber bevares, såsom høj affinitet og specificitet, der er tydelig i det oprindeligt syntetiserede LNA [11] . Sådanne oligomerer syntetiseres kemisk og er kommercielt tilgængelige.

Inklusion i DNA/RNA

LNA kan inkorporeres i DNA og RNA ved promiskuiteten af ​​visse DNA- og RNA-polymeraser. Phusion DNA polymerase, et kommercielt udviklet enzym baseret på Pfu DNA polymerase , inkorporerer effektivt LNA i DNA [12] .

Karakteristika

LNA giver øget biostabilitet sammenlignet med biologiske nukleinsyrer . LNA-modificerede oligonukleotider har vist forbedret termodynamik, når de er hybridiseret til RNA , enkeltstrenget DNA og dobbeltstrenget DNA [13] .

Ansøgning

LNA vintre

DNAzymer kan modificeres til at inkludere LNA-rester til dannelse af LNAzymer (LNA-modificerede DNAzymer). Disse modificerede oligonukleotider er, ligesom deres beslægtede DNAzymer, typisk endonukleaser , der binder til specifikke mål-RNA-sekvenser og spalter phosphodiesterbindingen, der eksisterer mellem nukleotider [14] . Imidlertid udviser de mere effektiv phosphodiesterbindingsspaltning sammenlignet med deres umodificerede modstykker [15] . Modifikation af DNAzyme- substratgenkendelsesarme med LNA- monomerer producerer et LNAzyme, der genkender Coxsackievirus A21 (CAV-21) og spalter dets mål -RNA- sekvens , svarende til den i den 5' utranslaterede region (5'UTR) af human rhinovirus -14 (HRV- 14); en sekvens, der ikke genkendes af umodificerede DNAzymer [16] .

Terapi

Den terapeutiske anvendelse af LNA-baserede oligonukleotider er et nyt område inden for bioteknologi [17] . Forskellige LNA-oligonukleotider blev evalueret for deres farmakokinetiske og toksicitetsprofiler. Undersøgelser har konkluderet, at LNA-toksicitet generelt er uafhængig af oligonukleotidsekvensen og udviser en foretrukken sikkerhedsprofil til translaterbare terapeutiske anvendelser [11] .

LNA er blevet undersøgt for dets terapeutiske egenskaber i behandlingen af ​​cancer og infektionssygdomme. Et blokeret antisense-nukleinsyre-phosphorthioat-molekyle, kaldet SPC2996, blev designet til at målrette mRNA , der koder for Bcl-2-oncoproteinet, et protein, der hæmmer apoptose i celler i kronisk lymfatisk leukæmi (CLL). Fase I og II kliniske forsøg viste en dosisafhængig reduktion i cirkulerende CLL-celler i cirka 30 % af prøven, hvilket tyder på yderligere undersøgelse af SPC2996 [18] .

LNA er også blevet anvendt på Miravirsen , et eksperimentelt terapeutisk middel mod hepatitis C , som er en 15-nukleotid phosphorthioatsekvens med bindingsspecificitet for MiR-122 ( miRNA udtrykt i hepatocytter ) [19] [20] .

Detektion og diagnose

Allel-specifik PCR ved hjælp af LNA tillader design af kortere primere uden at ofre bindingsspecificitet [21] .

LNA er blevet inkluderet i fluorescerende in situ hybridisering (FISH) [22] . FISH er en almindelig teknik, der bruges til at visualisere genetisk materiale i en række forskellige celler, men undersøgelser har vist, at denne teknik har været begrænset af probernes dårlige hybridiseringseffektivitet. Omvendt har LNA-inkorporerede prober vist øget hybridiseringseffektivitet i både DNA og RNA . Forbedret FISH-ydeevne med LNA-inkludering har ført til FISH-analyse af humane kromosomer, adskillige ikke-humane celletyper og mikroarrays [22] .

LNA-genotypebestemmelsesassays er også blevet udført, specifikt for at påvise mutationer i apolipoprotein B [23] .

På grund af dets høje evne til at skelne mellem uoverensstemmelser, er LNA blevet undersøgt for dets anvendelse i diagnostiske værktøjer. Immobiliserede LNA-prober er blevet indført i multiplekse SNP-genotypebestemmelsesassays [24] .

Genredigering

LNA-modificerede ssODN'er (syntetiske enkeltstrengede DNA-oligonukleotider) kan bruges, ligesom almindelige ssODN'er, til at redigere enkeltbase-gener. Brugen af ​​LNA på eller nær det tilsigtede modifikationssted undgår DNA- mismatch - reparation på grund af den højere termodynamiske stabilitet, det har [25] .

Referencer

1. ↑ Elayadi, Anissa N. (august 2002). "Implikationer af højaffinitetshybridisering af låste nukleinsyreoligomerer for inhibering af human telomerase †" . Biokemi _ _ ]. 41 (31): 9973-9981. DOI : 10.1021/bi025907j . ISSN  0006-2960 . PMID  12146961 .
2. ↑ Kurreck, J. (2002-05-01). "Design af antisense-oligonukleotider stabiliseret af låste nukleinsyrer". Nukleinsyreforskning . 30 (9): 1911-1918. DOI : 10.1093/nar/30.9.1911 . PMID  11972327 .
3. ↑ Frieden, M. (2003-11-01). "Udvidelse af designhorisonten for antisense-oligonukleotider med alfa-L-LNA". Nukleinsyreforskning _ _ ]. 31 (21): 6365-6372. DOI : 10.1093/nar/gkg820 . ISSN  1362-4962 . PMID  14576324 .
4. ↑ Frieden, Miriam (oktober 2003). "Nukleasestabilitet af LNA-oligonukleotider og LNA-DNA-kimærer" . Nukleosider , nukleotider og nukleinsyrer ]. 22 (5-8): 1041-1043. DOI : 10.1081/NCN-120022731 . ISSN 1525-7770 . PMID 14565339 .  
5. ↑ Morita, K. (2001-11-01). "2'-O, 4'-C-Ethylen-broforbundne nukleinsyrer (ENA) med nuklease-resistens og høj affnitet for RNA". Nucleic Acids Symposium Series ]. 1 (1): 241-242. DOI : 10.1093/nass/1.1.241 . ISSN 0261-3166 . PMID 12836354 .  
6. ↑ Medicinsk kemi af nukleinsyrer . - Hoboken, NJ: John Wiley & Sons, 2011. - 1 online ressource s. - ISBN 978-1-118-09280-4 , 1-118-09280-5 , 978-1-118-09283-5 , 1-118-09283-X 283-23990-5, 1-1818-392 , 978-1-118-09281-1.
7. ↑ 1 2 Obika, Satoshi (1997-12-15). "Syntese af 2'-O,4'-C-methyleneuridin og -cytidin. Nye bicykliske nukleosider med en fast C3, -endo sukkerrynkning” . Tetrahedron bogstaver [ engelsk ] ]. 38 (50): 8735-8738. DOI : 10.1016/S0040-4039(97)10322-7 . ISSN  0040-4039 .
8. ↑ Orum, Miriam Frieden og Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyre holder løfte i behandlingen af ​​kræft" . Nuværende farmaceutisk design ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Hentet 2020-10-06 . 
9. ↑ Zamecnik, PC (1978-01-01). "Inhibering af Rous sarcoma virus replikation og celletransformation af et specifikt oligodeoxynukleotid". Proceedings of the National Academy of Sciences ]. 75 (1): 280-284. Bibcode : 1978PNAS...75..280Z . DOI : 10.1073/pnas.75.1.280 . ISSN 0027-8424 . PMID 75545 .  
10. ↑ Koshkin, Alexei A. (2001-12-01). "En forenklet og effektiv rute til 2'-O, 4'-C-Methylen-forbundne bicykliske ribonukleosider (låst nukleinsyre)" . Journal of Organic Chemistry . 66 (25): 8504-8512. doi : 10.1021/ jo010732p . ISSN 0022-3263 . PMID 11735531 .  
11. ↑ 1 2 Orum, Miriam Frieden og Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyre holder løfte i behandlingen af ​​kræft" . Nuværende farmaceutisk design ]. 14 (11): 1138-1142. DOI : 10.2174/138161208784246234 . PMID 18473860 . Hentet 2020-10-06 . Orum, Miriam Frieden og Henrik (2008-03-31). "Låst nukleinsyre holder løfte i behandlingen af ​​kræft" . Nuværende farmaceutisk design . 14 (11): 1138-1142. doi : 10.2174/138161208784246234 . PMID  18473860 . Hentet 2020-10-06 .
12. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering af LNA-nukleotider i DNA-strenge" . ChemBioChem [ engelsk ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . 
13. ↑ Veedu, Rakesh N. (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering af LNA-nukleotider i DNA-strenge" . ChemBioChem [ engelsk ] ]. 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/ cbic.200600501 . PMID 17315250 . Veedu, Rakesh N.; Vester, Birte; Wengel, Jesper (2007-03-26). "Enzymatisk inkorporering af LNA-nukleotider i DNA-strenge" . ChemBioChem . 8 (5): 490-492. doi : 10.1002/cbic.200600501 . PMID  17315250 . S2CID  10206060 .
14. ↑ Breaker, R. R. (december 1994). "Et DNA-enzym, der spalter RNA" . Kemi og biologi . 1 (4): 223-229. DOI : 10.1016/1074-5521(94)90014-0 . ISSN  1074-5521 . PMID  9383394 .
15. ↑ Vester, Birte (november 2002). "LNAzymes: Inkorporering af LNA-type monomerer i DNAzymer øger markant RNA-spaltning" . Journal of the American Chemical Society ]. 124 (46): 13682-13683. DOI : 10.1021/ja0276220 . ISSN 0002-7863 . PMID 12431091 .  
16. ↑ Schubert, Steffen (maj 2004). "Få måladgang for deoxyribozymer." Journal of Molecular Biology ]. 339 (2): 355-363. DOI : 10.1016/j.jmb.2004.03.064 . PMID 15136038 . 
17. ↑ "LNA: et alsidigt værktøj til terapeutik og genomik". Tendenser inden for bioteknologi . 21 (2): 74-81. februar 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
18. ↑ Dürig, J. (april 2011). "Den nye antisense Bcl-2-hæmmer SPC2996 forårsager hurtig leukæmicelleclearance og immunaktivering ved kronisk lymfatisk leukæmi." Leukæmi [ engelsk ] ]. 25 (4): 638-647. DOI : 10.1038/leu.2010.322 . ISSN  1476-5551 . PMID21358717  . _
19. ↑ Gebert, Luca F.R. (2014-01-01). "Miravirsen (SPC3649) kan hæmme biogenesen af ​​miR-122." Nukleinsyreforskning . 42 (1): 609-621. doi : 10.1093/nar/ gkt852 . ISSN 0305-1048 . PMID24068553 . _  
20. ↑ Bonneau, E. (2019-06-24). "Hvor tæt er miRNA'er fra klinisk praksis? Et perspektiv på det diagnostiske og terapeutiske marked”. EJIFCC . 30 (2): 114-127. ISSN  1650-3414 . PMID  31263388 .
21. ↑ Bonetta L (2005). "Prime time for real-time PCR". Nat. Metoder . 2 (4): 305-312. DOI : 10.1038/nmeth0405-305 .
22. ↑ 1 2 Kubota, Kengo (august 2006). "Forbedret in situ hybridiseringseffektivitet med låst-nukleinsyre-inkorporerede DNA-prober". Anvendt og miljømæssig mikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .
23. ↑ Kubota, Kengo (august 2006). "Forbedret in situ hybridiseringseffektivitet med låst-nukleinsyre-inkorporerede DNA-prober". Anvendt og miljømæssig mikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. DOI : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMID  16885281 .Kubota, Kengo; Ohashi, Akiyoshi; Imachi, Hiroyuki; Harada, Hideki (august 2006). "Forbedret in situ hybridiseringseffektivitet med låst-nukleinsyre-inkorporerede DNA-prober" . Anvendt og miljømæssig mikrobiologi . 72 (8): 5311-5317. doi : 10.1128/AEM.03039-05 . ISSN  0099-2240 . PMC  1538721 . PMID  16885281 .
24. ↑ "LNA: et alsidigt værktøj til terapeutik og genomik". Tendenser inden for bioteknologi . 21 (2): 74-81. februar 2003. DOI : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .Petersen M, Wengel J (februar 2003). "LNA: et alsidigt værktøj til terapeutik og genomik". Tendenser inden for bioteknologi . 21 (2):74-81. doi : 10.1016/S0167-7799(02)00038-0 . PMID  12573856 .
25. ↑ van Ravesteyn, TW (12. april 2016). "LNA-modifikation af enkeltstrengede DNA-oligonukleotider tillader subtil genmodifikation i mismatch-reparation-dygtige celler." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America . 113 (15): 4122-7. DOI : 10.1073/pnas.1513315113 . PMID  26951689 .