Linket immunosorbent assay

Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 30. juni 2022; checks kræver 11 redigeringer .

Enzyme immunoassay (forkortet ELISA , engelsk enzym-linked immunosorbent assay, ELISA ) er en laboratorieimmunologisk metode til kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af forskellige lavmolekylære forbindelser, makromolekyler, vira osv., som er baseret på en specifik antigen - antistof reaktion . Påvisningen af det dannede kompleks udføres under anvendelse af enzymet som et mærke til signalregistrering. Det teoretiske grundlag for ELISA er baseret på moderne immunkemi og kemisk enzymologi, viden om de fysisk-kemiske love for antigen-antistof-reaktionen, samt på de grundlæggende principper for analytisk kemi.

ELISA er et af de mest aktivt udviklende områder inden for kemisk enzymologi. Dette skyldes det faktum, at i ELISA er den unikke specificitet af den immunkemiske reaktion (dvs. antistoffer binder udelukkende til visse antigener og ikke til andre) kombineret med en høj følsomhed for enzymmærkedetektion (op til 10-21 mol ) i en prøve). Den høje stabilitet af reagenser, enkelheden af registreringsmetoder, muligheden for at skabe kaskadesystemer til forstærkning af forskellige kemiske signaler, den relativt lave pris og mange andre fordele ved ELISA-metoden har bidraget til dens udbredte implementering inden for forskellige områder inden for medicin, landbrug , mikrobiologiske og fødevareindustrier, miljøbeskyttelse og også i videnskabelig forskning. [en]

Teoretisk grundlag

På grund af mangfoldigheden af undersøgelsesobjekter - fra forbindelser med lav molekylvægt, peptid- og steroidhormoner, farmakologiske præparater, pesticider, til vira og bakterier og endda til andre antistoffer - mangfoldigheden af bindingsprincipper og mangfoldigheden af betingelser for udførelse af ELISA, der er et stort antal muligheder for denne metode. Til registrering af enzymatisk aktivitet alene er det muligt at anvende fotometriske, fluorometriske, bio- og kemiluminescerende metoder, og i nogle tilfælde (især dem, der er forbundet med løsning af teknologiske problemer), anvendes elektrokemiske og mikrokalorimetriske sensorer med succes.

Fysiske og kemiske baser for interaktion

Den immunkemiske reaktion i opløsning forløber i flere trin, hvoraf den første er den reversible dannelse af et kompleks mellem antistoffer og antigener med en sammensætning på 1:1 (på grund af tilstedeværelsen af mere end ét bindingssted i antistofmolekylet for polyvalente antigener yderligere flertrinsdannelse af komplekse komplekser med forskellige forhold mellem komponenter er mulig). Kompleksdannelse medieres af hydrofobe , ioniske , van der Waals- og hydrogenbindinger . Den vigtigste rolle spilles af kræfterne i hydrofob interaktion, som stabiliserer hele systemet (reducerer dets frie energi, mens entropien øges ). Effektiviteten af sådanne interaktioner stiger med stigende temperatur.

I det enkleste tilfælde kan interaktionen af et antistofbindingssted ( AT ) med et monovalent antigen ( AG ) repræsenteres af skemaet

AG+AT\rightleftharpoons AG\times AT

På den kvantitative side er specificiteten af antigen-antistof-interaktionen karakteriseret ved affiniteten af antistoffer eller ligevægtskonstanten for dannelsen af immunkomplekset Ka (intrinsisk affinitet, l / mol):

Ka={\frac {[AG\times AT]}{[AG]\times [AT]}}

hvor [ AG ], [ AT ] og [ AG × AT ] er ligevægtskoncentrationerne af henholdsvis frit antigen, frit antistof og antigen-antistofkompleks. I praksis bruges ofte ligevægtsdissociationskonstanten for komplekset Kd (mol/L) , relateret til Ka ved en simpel sammenhæng

Kd={\frac {1}{Ka}}

Det er klart, at jo mindre Kd (eller omvendt, jo større Ka ), jo stærkere er det resulterende immunkompleks.

Kompleksdannelseskonstanten er en termodynamisk parameter, der karakteriserer ændringen i den frie energi af antigen-antistof-interaktionen, som kan beregnes med formlen:

\Delta F=-RT\ln Ka

hvor R er gaskonstanten, T er den absolutte temperatur. Den samlede ændring i fri energi under kompleks dannelse er summen af to termodynamiske størrelser - ændringer i entalpi og entropi :

\Delta F=\Delta HT\Delta S

Antigen-antistof-reaktionen fortsætter med frigivelse af varme, men som regel er ændringen i entalpien lille og beløber sig til omkring 40 kJ/mol. Ændringen i entropi er i de fleste tilfælde positiv, da de aktive centre af antistoffer i fri form er tilgængelige for opløsningsmidlet og er hydreret, og når de interagerer med antigenet frigives bundne vandmolekyler fra dem, hvilket fører til et fald i den overordnede ordning af systemet. Når man taler om antistoffers immunologiske specificitet, udføres der altid en sammenlignende vurdering af effektiviteten af et antigen-antistof, som er karakteriseret ved en ligevægtskonstant eller en ændring i systemets frie energi under kompleksdannelse.

Interaktion af et antigen med en subpopulation af antistoffer

Tidligere blev en simpel model for interaktionen mellem et monovalent antigen og et monovalent antistof taget som grundlag for en kvantitativ beskrivelse af effektiviteten af antigen-antistof-interaktion. Men da antistofmolekylet har flere antigenbindingscentre og derudover er i stand til at interagere med flere antigene determinanter af et antigenmolekyle, er denne karakteristik af dannelsen af et immunkemisk kompleks meget forenklet. For at beskrive processen med interaktion af et polyvalent antistof med et polyvalent antigen, som er tættere på virkeligheden, er udtrykket aviditet eller funktionel affinitet ( funktionel affinitet ) blevet introduceret. Fra et biologisk synspunkt er det funktionel affinitet, der spiller hovedrollen i immunresponset på infektion af kroppen med vira eller bakterier, der har gentagne antigene determinanter på deres overflade.

Processen med dannelse af et 1:1 antigen-antistofkompleks, hvori polyvalente interaktioner realiseres, er også reversibel og kan karakteriseres ved kompleksdannelseskonstanten . Fra et energisk synspunkt er dannelsen af et polyvalent kompleks meget mere fordelagtigt end et monovalent. For eksempel kan den effektive kompleksdannelseskonstant for IgG være 1000 eller flere gange større end enkeltbindingskonstanten.

Katalytiske egenskaber af enzymer

En meget vigtig og ofte brugt i praksis egenskab ved enzymer er deres katalytiske aktivitet . En enhed for katalytisk aktivitet (1 katal) af ethvert enzym tages som en sådan mængde, der katalyserer omdannelsen af 1 mol substrat til 1 s i reaktionsblandingen under visse betingelser. Til praktiske formål er nanokatal ( 10-9 kat) den mest bekvemme. Den gamle betegnelse for katalytisk aktivitet, kendt som den internationale enhed ( IU , engelsk U ), bruges dog stadig ofte , defineret som mængden af enzym, der katalyserer omdannelsen af 1 mmol af substratet på 1 min. Forholdet mellem disse enheder er som følger:

1 nkat \u003d 10 −9 kat \u003d 0,06 U.

Til en sammenlignende vurdering af forskellige enzympræparater anvendes ofte specifik katalytisk aktivitet , dvs. katalytisk aktivitet pr. masseenhed af proteinet.

Hastigheden af en enzymatisk reaktion er påvirket af forskellige faktorer, blandt hvilke de vigtigste er:

temperatur,
bufferens art og pH ,
underlag,
coenzymer ,
effektorer,
mængden af protein i systemet.

Temperaturafhængighederne har en kompleks form, hvilket både skyldes proteinmolekylernes termolabilitet og temperaturens indflydelse på Michaelis -konstanterne, hastighedskonstanterne for nedbrydningen af individuelle enzym-substratkomplekser og pH - optimumets position. Ved lave temperaturer, når strukturen af det aktive center er tilstrækkelig stabil, beskrives hastighedskonstanten for nedbrydningen af enzym-substratkomplekset ved en ligning af Arrhenius -typen .

Området for pH -optimal aktivitet kan være ret snævert. Det afhænger af ionstyrken og den anvendte buffertype og ændrer sig med temperaturen. For eksempel er pH - optimum for alkalisk phosphatase ved temperaturer på 37, 30 og 25 °C 9,9; henholdsvis 10.1 og 10.3.

Den bestemte katalytiske aktivitet afhænger stærkt af det anvendte substrat, som kan være både naturligt og syntetisk, mens deres omdannelseshastigheder også varierer betydeligt. For eksempel hydrolyserer enzymet β - D- galactosidase de syntetiske substrater 2-nitrophenyl-β- D - galactosid og 4-nitrophenyl-β- D - galactosid, henholdsvis 7 og 17 gange hurtigere end det naturlige substrat lactose.

Effektorer omfatter både inhibitorer og aktivatorer af enzymatiske reaktioner, det vil sige stoffer, der har en langsommere eller accelererende virkning på transformationen af substratet. I nogle tilfælde hæmmes enzymatiske reaktioner af høje koncentrationer af substratet eller af et af reaktionsprodukterne. Tilstedeværelsen af effektorer i reaktionsmediet kan føre til en uønsket afvigelse af den enzymatiske reaktionshastighed fra et lineært forhold til mængden af enzym i systemet.

Eksperimentelle metoder til bestemmelse af enzymatisk aktivitet

Fotometrisk metode

I ELISA, den mest udbredte fotometriske metode til registrering af enzymaktivitet. I dette tilfælde anvendes stoffer som enzymsubstrater, hvis omdannelsesprodukter er farvede forbindelser eller omvendt ændrer farven på selve substraterne under reaktionen. Farvede forbindelser absorberer synligt lys, det vil sige elektromagnetisk stråling med bølgelængder på 400-700 nm. Lysabsorption overholder Bouguer-Lambert-Beer-loven , ifølge hvilken den optiske densitet af en opløsning i et bestemt område er direkte proportional med koncentrationen af stoffet. Et spektrofotometer bruges til at måle optisk tæthed.

Fluorimetrisk metode

For nylig er substrater blevet udbredt i ELISA, som danner produkter, der påvises ved den fluorimetriske metode . Når et molekyle absorberer en foton, går den fra jordens elektroniske tilstand til en exciteret. Et exciteret molekyle kan vende tilbage til grundtilstanden, mens den overskydende energi vil blive til varme, men den omvendte proces med elektronovergang til jordniveau kan forekomme, ledsaget af frigivelsen af et lyskvante, som kaldes fluorescens. På grund af det delvise tab af energi under overgangen af molekylet fra den exciterede tilstand til grundtilstanden, er bølgelængden af det udsendte lys altid større end bølgelængden af det absorberede lys. Fraktionen af molekyler, der er gået fra den exciterede tilstand til grundtilstanden med udsendelse af lys, bestemmes af kvanteudbyttet Φ. Fluorescensintensiteten er proportional med mængden af lys, der adsorberes af prøven. Det er således direkte proportionalt med koncentrationen af det opløste stof og den absolutte værdi af den indledende lysintensitet, mens fotometri sammenligner de relative intensiteter, der adsorberes af prøven. Dette faktum gør det muligt at øge følsomheden af bestemmelsen af et stof i opløsning ved den fluorimetriske metode med 1-2 størrelsesordener sammenlignet med den fotometriske metode.

Bioluminescens og kemiluminescens

Som detektionssystemer i ELISA er der brugt enzymatiske reaktioner, hvis energi realiseres i form af lysstråling - reaktioner af bio- og kemiluminescens . Hastigheden af sådanne reaktioner overvåges af intensiteten af reaktionssystemets glød, registreret ved anvendelse af et luminometer. Bioluminescensreaktioner katalyseres af luciferaser fra ildfluer og bakterier, og reaktionen af oxidation af cykliske hydrazider med hydrogenperoxid (kemiluminescensreaktion) katalyseres af peberrodsperoxidase.

Elektrokemisk metode

Også kendt er elektrokemiske metoder til bestemmelse af aktiviteten af enzymer, der anvendes som mærker i immunoassays. Sådanne sensorer gør det muligt at bestemme hastigheden af enzymatiske reaktioner i uklare medier og er bekvemme til at skabe gennemstrømningsimmunoassayceller.

I enzymimmunoassay-metoder kan både enzymer og deres substrater anvendes som mærker for antigener og antistoffer. Hvis et enzymmolekyle tjener som et mærke, så skal den valgte detektionsmetode sikre registreringen af et signal proportionalt afhængigt af enzymkoncentrationen, og i tilfælde af, at et substrat anvendes som mærke, af substratkoncentrationen. I det første tilfælde fungerer enzymet som en markør (det er kovalent bundet til et antigen eller antistofmolekyle), i det andet fungerer det som en detektor (frit enzym). Efter at have udført alle de immunkemiske stadier af enhver ELISA-metode, er det nødvendigt at fastslå koncentrationen af den enzymmærkede komponent i den immunkemiske reaktion, det vil sige at bestemme den katalytiske aktivitet af enzymet i prøven. Den observerede reaktionshastighed bruges til at bedømme koncentrationen af markørenzymet i systemet. Det skal bemærkes, at ELISA altid er baseret på en sammenlignende bestemmelse under identiske forhold for standardprøven og den målte prøve, og derfor er kravet om proportionalitet af hastighed og koncentration mere ønskeligt end obligatorisk. Det er tilstrækkeligt, at der er en en-til-en overensstemmelse mellem mængden af det dannede enzymatiske reaktionsprodukt og mængden af enzymet i systemet. Opfyldelsen af proportionalitetsbetingelsen i et bestemt koncentrationsområde sikrer imidlertid større nøjagtighed af eksperimentet og gør det muligt at konstruere en teoretisk model, der beskriver metoden til dets optimering.

Enzymer brugt som etiketter i ELISA

Den grundlæggende mulighed for at bruge enzymer som mærker i ELISA skyldes den ekstremt høje følsomhed ved påvisning af enzymer i opløsning. Hvis konventionelle spektrofotometriske eller fluorimetriske metoder kan registrere dannelsen af et produkt ved en koncentration på 10 −7 mol/l, så vil koncentrationen af enzymet være 10 −13 mol/l. Desuden er det grundlæggende muligt at reducere detektionsgrænserne for enzymer betydeligt både ved at øge tiden for den enzymatiske reaktion og ved at øge registreringsfølsomheden af det dannede produkt. I denne henseende er lovende luminescerende metoder til påvisning af enzymatiske reaktioner såvel som metoder baseret på enzymatisk forbedring af påvisningen af produkter fra den primære enzymatiske reaktion ("kaskader").

Der er en række generelle krav til valg af enzymmærker i ELISA. De vigtigste er følgende:

høj specificitet og specifik katalytisk aktivitet, som gør det muligt at påvise mærket ved lave koncentrationer;
tilgængeligheden af enzymet, muligheden for at opnå tilstrækkeligt rene enzympræparater, der bevarer høj aktivitet efter kemisk modifikation ved opnåelse af et konjugat med antigener eller antistoffer;
stabilitet under optimale betingelser for interaktionen af antigenet med antistoffet;
enkelhed og følsomhed af metoden til bestemmelse af koncentrationen af enzymet.

De mest udbredte i heterogen ELISA (som bruger reagenser immobiliseret på overfladen af faste bærere) er peberrodsperoxidase , alkalisk phosphatase og β - D - galactosidase . Alle tre enzymer bestemmes ved niveauet af picomolære koncentrationer.

Den mest tilgængelige er peberrodsperoxidase. Det indeholder kulhydratrester, der let oxideres af periodat, hvorigennem enzymet kan binde sig til antistoffer eller antigener. Sammensætningen af substratsystemet til måling af aktiviteten af peroxidase ved den fotometriske metode omfatter kromogener, som giver farvede forbindelser ved oxidation med peroxid.

Den katalytiske aktivitet af glucoseoxidase registreres med de samme kromogener som aktiviteten af peroxidase, dog er følsomheden af dens bestemmelse sammenlignet med peroxidase noget lavere. Den største fordel ved enzymet er dets fuldstændige fravær i blodplasma, hvilket gør det muligt at bruge dette enzym i homogene ELISA-metoder (reagenser til alle stadier af ELISA er i vandig opløsning).

Alkalisk fosfatase og dens konjugater har høj stabilitet og lav detektionsgrænse, men har en relativt høj pris. Der er udviklet supersensitive enzymsystemer, der gør det muligt at detektere op til flere tusinde alkaliske fosfatasemolekyler i opløsning, baseret på brugen af et NADP -molekyle som substrat . NAD - produktet, der er et resultat af enzymatisk hydrolyse, bestemmes i det enzymatiske cofaktorregenereringssystem.

β - D- galactosidase er også et meget anvendt enzym i både homogen og heterogen ELISA. Det katalyserer hydrolysen af laktose til dannelse af glucose og galactose. Hvis 4-methylumbelliferyl-β- D - galactosid tages i stedet for det naturlige substrat, dannes galactose og 4-methylumbelliferon under hydrolyse, som påvises fluorimetrisk.

Alle kommercielle testsystemer anvender peberrodsperoxidase, hvis valg bestemmes af dens høje specifikke katalytiske aktivitet, tilgængelighed, stabilitet og nemme detektion. Ortho-phenylendiamin (OPD) eller tetramethylbenzidin (TMB) med hydrogenperoxid anvendes oftest som substratreagens, hvis oxidationsprodukt registreres fotometrisk. For at stoppe den enzymatiske reaktion anvendes et "stopreagens", som tilsættes alle test- og kontrolprøver i lige store mængder. Oftest bruges svovlsyre som "stopreagens". Regnskab for resultaterne udføres spektrofotometrisk ved en bølgelængde på 450-490 nm.

Klassificering af ELISA-metoder

Til dato er der udviklet en lang række forskellige muligheder for at udføre ELISA, med både grundlæggende og mindre forskelle. Der er ikke en enkelt klar klassificering af hele rækken af ELISA-metoder i litteraturen, hvilket gør det vanskeligt at identificere fælles mønstre og foretage en sammenlignende vurdering af forskellige metoders muligheder. Normalt udføres overvejelsen af ELISA-metoder fra synspunktet om adskillelse i heterogen og homogen, det vil sige i henhold til princippet om at udføre alle analysestadier med deltagelse af en fast fase eller kun i opløsning.

Den primære proces i ELISA er stadiet af "genkendelse" af den analyserede forbindelse af et antistof specifikt for det. Da processen med dannelse af immunokemiske komplekser forekommer i et strengt kvantitativt forhold på grund af affinitet, koncentrationer af komponenter og reaktionsbetingelser, er det tilstrækkeligt at bestemme den initiale koncentration af den analyserede forbindelse er en kvantitativ vurdering af de resulterende immunkomplekser. I tilfælde af antigenanalyse er der to tilgange til at foretage denne vurdering:

direkte måling af koncentrationen af de dannede komplekser;
bestemmelse af koncentrationen af resterende frie (ureagerede) antistoffer.

I sidstnævnte tilfælde er antallet af dannede immunkomplekser naturligvis bestemt af forskellen mellem det samlede antal tilsatte antistoffer og antallet af antistoffer, der forbliver frie.

Klassiske ELISA-metoder er baseret på dannelse af et præcipitat (præcipitat) af antistoffer i nærvær af et antigen, dog kræves høje koncentrationer af komponenter og en lang reaktionstid for visuel registrering af præcipitationsprocessen. Derudover kan resultaterne af en sådan analyse ikke altid tolkes entydigt og i de fleste tilfælde er de af kvalitativ eller semikvantitativ karakter. For mange monovalente antigener ( haptener ), såsom hormoner og lægemiddelforbindelser, er disse metoder desuden uegnede. Indikationen af det dannede antigen-antistofkompleks i opløsning kan udføres, hvis en markør indføres i en af reaktionssystemets initiale komponenter, som let påvises ved den tilsvarende meget følsomme fysisk-kemiske metode. Isotopiske, enzymatiske, fluorescerende, paramagnetiske mærker viste sig at være meget praktiske til dette formål, hvis brug gjorde det muligt at øge følsomheden af immunkemiske metoder med millioner af gange og reducere analysetiden til flere timer. Da kompleksdannelsesprocessen forekommer i en strengt kvantitativ forstand, er koncentrationen af mærket inkluderet i komplekset entydigt relateret til den initiale koncentration af antigenet.

Heterogen ELISA i mikropladeformat

For at analysere effektiviteten af kompleksdannelse er det nødvendigt at rense komplekserne fuldstændigt fra frie komponenter. Dette problem viste sig at være let at løse, hvis en af komponenterne i antigen-antistof-parret er fast bundet ( immobiliseret ) på en fast bærer. Immobilisering gør det muligt at forhindre aggregering i opløsning og fysisk at adskille de resulterende komplekser fra frie komponenter. Anvendelsen af immobilisering af antistoffer på en fast bærer lagde grundlaget for metoder til fastfase (heterogen) ELISA .

Af særlig betydning for den udbredte introduktion af fastfase ELISA i praksis var udviklingen af specielle polystyrenplader indeholdende 96 brønde som bærere til sorptionsimmobilisering af antistoffer og antigener. Faktum om sorption af antistoffer på overfladen af polystyren blev etableret i midten af 60'erne og blev oprindeligt brugt i metoderne til radioimmunoassay (RIA) . Introduktionen af polystyrenplader i praksis med ELISA gjorde det muligt at øge antallet af udførte analyser betydeligt og forenkle den metodiske procedure for dens implementering. Specielle enheder blev designet til at automatisere stadierne med tilsætning af reagenser, vask og samtidig registrering af den katalytiske aktivitet af mærket enzym i hver brønd på pladen. [en]

Heterogen (fastfase) ELISA i en mikropladeversion er mest udbredt i testsystemer til kliniske laboratorieundersøgelser. Som en fast fase anvendes overfladen af brøndene på en polystyrenmikroplade, hvorpå de kendte antigener eller antistoffer, der indgår i testsystemet, adsorberes (kaldet i dette tilfælde immunosorbent ). I løbet af en specifik reaktion af immunosorbenten med antistoffer eller antigener bestemt i testprøven, dannes immunkomplekser, som er fikseret på den faste fase. Stoffer, der ikke deltog i reaktionen, såvel som overskydende reagenser, fjernes under gentagen vask. Konjugater bruges - antistoffer mod stoffet, der skal påvises, forbundet med en specifik mærkning (f.eks. enzymet peberrodsperoxidase , alkalisk fosfatase , β-D-galactosidase, ruthenium eller fluorescein), som er en katalysator for den enzymatiske reaktion. [2] Dette skema gør det muligt at forenkle processen med effektiv adskillelse af reaktionskomponenterne. [3]

Ikke-konkurrerende ELISA-metoder

Hvis kun den analyserede forbindelse og dens tilsvarende bindingscentre (antigen og specifikke antistoffer ) er til stede i systemet, er metoden ikke-konkurrerende .

Direkte ELISA

Bruges til at bestemme antigenet. Kan gøres på to måder. I den første fikseres det indførte materiale (antigen) under inkubation på overfladen af rene brønde. Mængden af testmaterialet detekteres ved hjælp af konjugatet. I den anden immobiliseres antistofferne på brønden, og teststoffet, der tidligere er mærket med enzymet, påvises.

Analyse struktur.

Biologisk materiale (blod, afskrabninger fra slimhinder, udstrygninger) anbringes i rene brønde i nogen tid (normalt 15-30 minutter), tilstrækkeligt til at antigener klæber til overfladen af brøndene.

Derefter tilsættes mærkede antistoffer mod det detekterede antigen (konjugat) til brøndene. Det betyder, at ved påvisning af antigener, for eksempel syfilis, tilsættes antistoffer mod syfilis-antigener. Denne blanding efterlades i nogen tid (fra 30 minutter til 4-5 timer), så konjugatets antistoffer kan finde og binde sig til "deres" antigen. Jo flere antigener i en biologisk prøve, jo flere antistoffer vil binde til dem. Da antistoffer tilsættes i overskud, vil ikke alle af dem binde til antigener, og hvis der overhovedet ikke er noget antigen i prøven, vil derfor ikke et eneste antistof binde til det ønskede antigen. For at fjerne "ekstra" antistoffer hældes indholdet af brøndene ud (eller udvaskes ved dekantering ). Som et resultat forbliver kun dem, der har kontaktet antigenerne "limet" til overfladen af brøndene.

Det næste trin er den enzymatiske reaktion. Tilsæt en opløsning med enzymet i de vaskede brønde og lad det stå i 30-60 minutter. Dette enzym har en affinitet for det stof (specifikt mærke), som antistofferne er bundet til. Enzymet udfører en reaktion, hvorved dette specifikke mærke (substrat) omdannes til et farvet stof (produkt).

Kort skema: (Antigen) → Antistof

Da det tilføjede specifikke mærke er forbundet med antistoffer i den første metode eller med et mærket antigen i den anden, betyder det, at koncentrationen af det farvede reaktionsprodukt er lig med koncentrationen af analytten. [2]

Indirekte ikke-konkurrerende ELISA

Bruges til at påvise antistoffer. Det biologiske testmateriale (oftest humant serum eller plasma), der indeholder eller ikke indeholder antistoffer mod antigenet, indføres i brøndene, på hvis faste overflade antigenet er foreløbigt sorberet. Antallet af bundne antistoffer påvises ved hjælp af et konjugat til dem.

Analyse struktur.

De testede antistoffer fra den indførte prøve af biologisk materiale binder til antigenet under inkubation og immobiliserer således på overfladen af brønden. Ubundne antistoffer fjernes ved vask.

Et konjugat, der er i stand til at binde til antistoffet immobiliseret i det første trin, indføres i brønden. Hvis cellen indeholder immunkomplekser dannet i det første trin, så kombineres konjugatet med dem under den anden inkubation, og det ubundne konjugat fjernes ved efterfølgende vask.

Dernæst tilsættes et substrat-kromogent reagens til brønden, som bliver til et farvet produkt under påvirkning af enzymkomponenten i konjugatet. [3]

Kort skema: Antigen → (Antistof) → Antistof-K

Forskellen fra den direkte metode er således, at de testede antistoffer ikke klæber til overfladen af en ren brønd, men binder sig til antigenet immobiliseret på pladen.

"Sandwich"

Bruges til at bestemme antigenet. "Sandwich" er en variant af indirekte ikke-kompetitiv heterogen ELISA, hvor primære antistoffer er immobiliseret på pladen. [3]

Analyse struktur.

En opløsning indeholdende det analyserede antigen tilsættes til bæreren med immobiliserede antistoffer. I inkubationsprocessen i det første trin dannes et antigen-antistofkompleks på den faste fase.

Derefter vaskes bæreren fra ubundne komponenter, og konjugatet tilsættes.

Efter den sekundære inkubation og fjernelse af overskydende konjugat bestemmes den enzymatiske aktivitet af bæreren, hvilket er proportionalt med den initiale koncentration af antigenet, der undersøges. Den enzymatiske reaktion (farvereaktion) finder sted i nærvær af hydrogenperoxid og et substrat repræsenteret af en ufarvet forbindelse, som oxideres under peroxidasereaktionen til et farvet reaktionsprodukt i sidste fase af undersøgelsen. Intensiteten af farvning afhænger af mængden af specifikke antistoffer påvist.

Resultatet vurderes spektrofotometrisk eller visuelt.

Kort skema: Antistof → (Antigen) → Antistof-K

På tidspunktet for identifikation af et specifikt immunkompleks er antigenet så at sige klemt mellem molekylerne af immobiliserede og mærkede antistoffer, hvilket var årsagen til den udbredte brug af navnet "sandwich"-metoden . Testsystemer til påvisning af antistoffer fungerer på lignende måde, men de bruger et antigen som immunosorbent, og konjugatet indeholder en opløsning af et antigen mærket med et enzym.

"Sandwich"-metoden kan kun anvendes til at analysere de antigener, på hvis overflade der er mindst to rumligt fjerne antigene determinanter. Et stort antal testsystemer til enzymimmunoassay for forskellige infektioner er baseret på dette format: HIV-infektion , viral hepatitis , cytomegalovirus , herpes , toxoplasma og andre infektioner.

I øjeblikket er testsystemer, der anvender streptavidin og biotinylerede monoklonale antistoffer (som er en blanding af højt oprensede specifikke monoklonale antistoffer mod forskellige epitoper) blevet udbredt. Standarder, kontroller og patientprøver tilsættes til streptavidin-coatede mikrobrønde, efterfulgt af biotinylerede antistoffer og konjugat. Efter blanding resulterer reaktionen i dannelsen af et "sandwich"-kompleks, som binder sig til streptavidin i cellerne. Ubundne komponenter fjernes ved vask. Efter inkubation med substratopløsningen bestemmes den optiske tæthed af opløsningerne i brøndene fotometrisk. Et træk ved sådanne systemer er afstanden af den enzymatiske reaktion fra pladens væg, så farven udvikler sig i volumen, og testsystemet bliver analytisk mere følsomt. [3]

Konkurrencedygtige ELISA-metoder

Hvis i det første trin i systemet både analytten og dens analog (en enzymmærket analyt eller en analyt immobiliseret på den faste fase) er samtidig tilstede i systemet og konkurrerer om et begrænset antal specifikke bindingssteder, så er metoden konkurrencedygtige . Denne type assay bruges ofte til at detektere antigener, der er til stede i høje koncentrationer eller hormoner, der kun har ét antigenbindingssted.

Den kompetitive ELISA-metode er opdelt i flere typer: efter påvisningstypen (direkte eller indirekte) og efter typen af stof immobiliseret på den faste fase (antigen eller antistof).

Direkte konkurrerende ELISA

Bruges til at påvise et antigen eller antistof. Hvis et antigen påvises, bruger det direkte kompetitive ELISA-format specifikke antigener immobiliseret på den faste fase. Når testprøven og konjugatet indføres, konkurrerer sidstnævnte om binding med antigenerne til stede i prøven (opløst) og med immobiliserede antigener.

Analyse struktur.

Testprøven (humant serum eller plasma) og konjugatet tilsættes til tablettens brønd, på hvis overflade antigenerne er adsorberet. Efter inkubation dannes to typer immunkomplekser: associeret og ikke associeret med konjugatet, dvs. indeholdende et enzymmærke (mærket) og uden det (umærket). Tabletten vaskes. Jo flere umærkede antistoffer der er tilbage i brønden, jo større er konkurrencen med antistofferne i testprøven.

Yderligere, efter vask af bæreren fra ubundne komponenter, tilsættes et substrat-kromogent reagens, og den enzymatiske aktivitet af de specifikke immunkomplekser dannet på den faste fase registreres. [3]

Kort skema: Antigen → (Antigen) + Antistof-K

Således er størrelsen af det detekterede signal opnået ved direkte kompetitiv ELISA omvendt relateret til antigenkoncentrationen.

For at påvise antistoffer udføres en lignende version af direkte kompetitiv ELISA med et antistof immobiliseret på den faste fase.

Fordelen ved den direkte ordning er et lille antal faser, som gør det nemt at automatisere analysen. Ulemperne ved skemaet omfatter kompleksiteten af metoder til syntese af enzymkonjugater, såvel som prøvekomponenternes mulige indflydelse på enzymets aktivitet.

Indirekte (indirekte) kompetitiv ELISA

Bruges til at bestemme antigenet. I lighed med den direkte kompetitive metode immobiliseres antigenet også på den faste fase, men i stedet for konjugatet til antigenet anvendes mærkede mærkede anti-antistof-antistoffer (sekundære antistoffer). Der tilsættes antistoffer til prøven, som konkurrerer om binding enten med antigenet fra testpersonens blodserum (fri, fjernet ved vask), eller med antigenet immobiliseret på den faste fase (ikke fjernet ved vask). Dernæst fæstnes et konjugat af mærkede antistoffer til de bundne antistoffer, og den optiske densitet bestemmes. Det vil sige, at hvis der overhovedet ikke er noget målbart stof i den indførte prøve, vil alle antistoffer binde til antigenet, der er immobiliseret gennem bærerproteinet på overfladen af brønden, de vil forblive i brønden under vask, og det detekterede signal vil være høj. Hvis der er meget af det målte stof i testpersonens serum (dvs. det vil være i opløsning i fri tilstand), vil en del af antistofferne binde til dette stof og en del til det immobiliserede; antistoffer, der er i fri tilstand (bundet til antigenet fra serum) vil blive fjernet ved vask, og det detekterede signal vil give antistoffer bundet til antigenet immobiliseret i brønden - det vil være lavt, da en del af antistofferne blev fjernet ved at vaske.

Analyse struktur.

Et antigen- protein immobiliseres på overfladen af bæreren , hvortil en opløsning indeholdende antigenet , der skal bestemmes, og en fast koncentration af umærkede specifikke antistoffer tilsættes og inkuberes.

Efter fjernelse af ubundne komponenter tilsættes en fast koncentration af konjugatet (i dette tilfælde mærkede sekundære anti-arts-antistoffer).

Efter inkubation og vask af bæreren påvises den enzymatiske aktivitet af de specifikke immunkomplekser dannet på den faste fase.

Kort skema: Antigen → (Antigen) + Antistof → Antistof-K

Værdien af det detekterede signal, såvel som ved brug af den direkte kompetitive metode, er omvendt proportional med koncentrationen af det detekterede antigen .

Anvendelsen af et universelt reagens - mærkede anti-arts antistoffer - gør det muligt at påvise antistoffer mod forskellige antigener. Derudover indføres den analyserede prøve og det mærkede reagens i systemet på forskellige stadier, hvilket eliminerer indflydelsen af forskellige effektorer indeholdt i prøven på enzymmærkets katalytiske egenskaber. En sådan analyseordning komplicerer imidlertid implementeringen på grund af indførelsen af yderligere faser. Denne metode bruges til kvalitativ og kvantitativ påvisning af for eksempel opiater (morfin, heroin), cannabinoider (marihuana, hash), amfetamin og metamfetamin, barbiturater. [fire]

Homogen ELISA

I 1972 udviklede Rubenshetein og kolleger en ny tilgang til at køre hele analysen uden en solid fase. Metoden blev kaldt homogen ELISA (eng. "EMIT" - enzym multiplied immunoassay technique) og var baseret på forskelle i enzymmærkets katalytiske egenskaber i fri form og i det immunkemiske kompleks. Dens essens ligger i bindingen af et lavmolekylært antigen til enzymet lysozym nær det aktive center. I kompleks med antistoffer bliver enzymets aktive center sterisk utilgængeligt for det makromolekylære substrat, som er væggene i bakterieceller. Med en stigning i koncentrationen af det bestemte antigen falder koncentrationen af det inaktive kompleks af konjugatet med antistoffer, og følgelig stiger den registrerede parameter for den enzymatiske reaktion. Baseret på denne tilgang blev der udviklet kits til bestemmelse af en bred vifte af giftige, narkotiske og medicinske lægemidler. En væsentlig fordel ved EMIT-analyse er muligheden for at bruge små volumener af den analyserede prøve (5-50 μl) og den høje detektionshastighed (2-5 min), på grund af fraværet af et separationstrin mellem fri og mærket analyt. Ulemperne ved metoden omfatter lavere følsomhed end ved heterogen ELISA (~ 1 μg/ml), og muligheden for kun at bestemme lavmolekylære antigener. [en]

Funktioner og problemer ved ELISA

Som enhver anden immunkemisk analysemetode kan ELISA give falsk positive og falsk negative resultater. For eksempel kan falske positive resultater i bestemmelsen af antistoffer mod forskellige infektioner forekomme på grund af rheumatoid faktor , som er immunoglobulin M mod en persons egne immunglobuliner G; på grund af antistoffer dannet i forskellige systemiske sygdomme, stofskifteforstyrrelser eller indtagelse af medicin; hos nyfødte kan sådanne falske positive reaktioner forekomme på grund af dannelsen i barnets krop af M-antistoffer mod moderens immunglobulin G. Derudover kan polyklonalt aktiveringssyndrom være årsag til falske positive resultater. Samtidig stimulerer specielle stoffer - superantigener - ikke-specifikt produktionen af antistoffer mod forskellige infektioner af B-lymfocytter. I praksis kommer dette til udtryk i en ikke-specifik stigning i antistoftiter mod mange patogener på én gang. [5] Falsk-negative resultater i bestemmelsen af antistoffer kan skyldes immundefekt tilstande, samt tekniske fejl i formuleringen af reaktionen.

På grund af de utvivlsomme fordele ved enzymimmunoassay: brugervenlighed, hastighed, objektivitet på grund af automatisering af registreringsresultater, muligheden for at studere immunglobuliner af forskellige klasser (som er vigtig for den tidlige diagnose af sygdomme og deres prognose), er det således i øjeblikket en af de vigtigste metoder til laboratoriediagnostik.

De vigtigste typer af testsystemer afhængigt af de anvendte antigener

Afhængigt af hvilke antigener der anvendes, er ELISA testsystemer opdelt i:

Lysat - som bruger en blanding af native antigener (lyseret eller sonikeret infektiøst middel opnået i kultur);
Rekombinant - hvori gensplejsede proteiner anvendes - analoger af visse proteinantigener af patogenet;
Peptid - ved hjælp af kemisk syntetiserede fragmenter af proteiner.

Den generelle udviklingsretning af ELISA diagnosticums er retningen fra lysattestsystemer, som almindeligvis kaldes førstegenerationstestsystemer, til rekombinante og peptidsystemer.

Teknologien til opnåelse af rekombinante proteiner gør det muligt i en ret ren form at opnå en analog af næsten ethvert individuelt antigen.

For at skabe et rekombinant testsystem af høj kvalitet er det nødvendigt at udvælge antigener fra hele den antigene variant af patogenet, der ville være immunogen (dvs. antistoffer mod disse antigener skal produceres i kroppen af en inficeret person) og meget specifikke (dvs. kun karakteristisk for dette patogen og efter muligheder, der ikke giver krydsreaktioner med antistoffer mod andre antigener).

Derudover er kvaliteten af oprensningen af rekombinante proteiner af stor betydning. I det ideelle tilfælde er det muligt at opnå et rekombinant testsystem med næsten 100 % specificitet og høj sensitivitet.

I praksis er dette ikke altid muligt at opnå, men specificiteten af de bedste rekombinante testsystemer nærmer sig 100%. På nuværende tidspunkt, på basis af peptidenzymimmunoassay, kan det siges, at quantiferon-testen til hurtig og højpræcisionsdiagnose af tuberkulose er blevet implementeret med succes.

Perspektiver og udvikling af metoden

En af de vigtige opgaver er at finde tilgange, der kan reducere analysetiden markant og samtidig bevare høj følsomhed. En af disse tilgange er overførslen af analyse til det kinetiske regime, som realiseres ved at skabe automatiske enheder baseret på reaktionen i flowsystemer.

Anvendelsen af monoklonale antistoffer , der udelukkende er specifikke for et bestemt antigensted i den analyserede forbindelse, åbner store muligheder . Ved at vælge de passende antistoffer er det muligt at skabe ret komplekse immunkemiske systemer, der gør det muligt at identificere forbindelser af det mest forskelligartede område.

ELISA-metoden er i konstant udvikling. På den ene side udvides antallet af forskningsobjekter, på den anden side bliver selve analysemetoderne uddybet og forbedret. Dette fører til, at analyseskemaet er forenklet, tidspunktet for dets implementering reduceres, og forbruget af reagenser reduceres. Der er en konstant søgen efter flere og flere nye enzymer, der bruges som markører. Kemien af makromolekylære forbindelser, celle- og genteknologi, under påvirkning af hvilken teknologierne til at opnå reagenser til ELISA ændrer sig, har en stadig større indflydelse på ELISA. [1] Så hvis det før introduktionen af genteknologiske metoder var nødvendigt at isolere antistoffer fra biologiske medier (og god oprensning kræver betydelige omkostninger og tid, og reagenser og udstyrs levetid), så er det på nuværende tidspunkt muligt at bruge insektceller ( cricket, cicada, kakerlak ) eller E. coli til at producere det ønskede rekombinante protein, der samtidig med at de ønskede biologiske egenskaber bevares, også er relativt rent, så det er meget nemmere at isolere fra blandingen og opbevare i en stabiliserende opløsning.

Noter

↑ 1 2 3 4 A.M. Egorov, A.P. Osipov, B.B. Dzantiev, E.M. Gavrilov. [http://www.booksshare.net/index.php?id1=4&category=biol&author=egorov-am&book=1991 Teori og praksis for enzymimmunoassay ]. - M . : Forlaget "Højere skole", 1991. - S. 3 -42. — ISBN 5-06-000644-1 .
↑ 1 2 www.polismed.com . Hentet 12. april 2017. Arkiveret fra originalen 13. april 2017. (ubestemt)
↑ 1 2 3 4 5 Immunkemisk analyse i laboratoriemedicin / V. V. Dolgov. - M.-Tver: LLC "Publishing house" Triada "", 2015. - S. 34-38. — ISBN 978-5-94789-695-4 .
↑ www.monographies.ru
↑ Polyklonalt aktiveringssyndrom som årsag til falsk positive ELISA-resultater (utilgængeligt link)

Personlig medicin
Omix-datasektioner	Genom Transkriptom epigenom Proteom Metabole Mikrobiom Metagenom Exposom V(D)J-ohm
Ansøgningssektioner	Klinisk undersøgelse medicinsk genetik Molekylær kirurgi Personlig genomik Regenerativ medicin Farmakogenetik
Metoder	Genotyping Linket immunosorbent assay Sekvensering
Relaterede artikler	bioinformatik Systemisk medicin Teranostik Accelereret genoptræningskirurgi