Chitinaser ( EC 3.2.1.14 ) er enzymer , der katalyserer nedbrydningen af chitin , fungerer oftest som endoenzymer, og spalter chitooligosaccharider 2-6 N-acetylglucosaminrester lange [1] . Chitinaser tilhører gruppen af O-glykosidhydrolaser, der bryder glykosidbindingen mellem to eller flere kulhydratrester eller mellem et kulhydrat og en ikke-kulhydratkomponent. Sådanne hydrolaser er grupperet i familier baseret på deres aminosyresekvens. I øjeblikket kendes 110 familier af disse enzymer [2] , de fleste af chitinaserne tilhører GH18- og GH19-familierne [3] , en (der hører til insektet af ordenen Coleoptera Gastrophysa atrocyanea ) tilhører GH48-familien. Deres vigtigste egenskaber er vist i tabel 1.
Alle organismer, der indeholder kitin , producerer kitinaser, som de sandsynligvis har brug for til cellevægs- eller eksoskeletmorfogenese [ 3] . Mange bakteriearter af slægterne Bacillus , Pseudomonas og Streptomyces er i stand til at bruge kitin som den eneste kulstofkilde på grund af udskillelsen af chitinaser [4] [5] [6] . Derudover er produktionen af kitinaser af mange organismer en vigtig beskyttende faktor mod eksponering for forskellige patogener . Chitinaser tilhører klassen af PR-3-proteiner [3] . Ifølge deres aminosyresekvens er PR-3-proteiner igen opdelt i fire klasser. Klasse I-chitinaser indeholder et chitin-bindende hevein -lignende domæne og en meget konserveret central region adskilt fra hevein-domænet af en hængselregion. Klasse II kitinaser ligner dem i klasse I, men de mangler hevein - domænet. Klasse III chitinaser viser ingen signifikant homologi med chitinaser af andre klasser. Klasse IV-chitinaser ligner klasse I-chitinaser, men signifikante områder er fraværende i denne klasse af enzymer .
| Egenskaber | Chitinaser af GH18-familien | Chitinaser af GH19-familien | Chitinase fra GH48-familien [7] |
|---|---|---|---|
| Familie, der tilhører klanen af glycosylhydrolaser | GH-K | tæt på GH-I | GH-M |
| Breder sig | Kitinaser af bakterier , svampe , vira , dyr , klasse III og IV plantekitinaser | Klasse I, II og IV plantekitinaser , Streptomyces chitinases | Chitinase tilhørende insektordenen Coleoptera Gastrophysa atrocyanea |
| Struktur af det katalytiske domæne | (β/a) 8 -tønde | Lysozym type (α+β) | (α/α) 6 |
| Hydrolyse af glykosidbindinger | Konformationsbevarende [ 8] | Med konformationel inversion [9] | Med konformationel inversion |
| Et brudt bånd | GlcNAc-GlcNAc og GlcNAc-GlcN [9] | GlcNAc-GlcNAc og GlcN-GlcNAc [10] | — |
| følsomhed over for inhibitorer | Følsom over for allosamidin [11] | Ufølsom over for allosamidin | — |
En vigtig rolle i klassificeringen af kitinaser og kitinolytiske komplekser spilles af de såkaldte chitinbindende domæner (ChBD'er), som tilhører forskellige familier af kulhydratbindende moduler (CBM'er). Blandt de familier, der indeholder chitin -bindende domæner , kan 4 vigtigste skelnes: CBM12, CBM14, CBM18, CBM19 (se tabel 2).
CBM'er fungerer som et bindemiddel for forskellige polysaccharidsubstrater , som ofte er vanduopløselige. CBM-kodende sekvenser kan enten være i chitinasegenet eller have deres egen ORF , hvis produkt er det tilsvarende kulhydratbindende protein [12] .
| CBM familie | Antal aminosyrerester | Struktur | Breder sig | Noter |
|---|---|---|---|---|
| CBM1 | ~40 | cysteinknude | Klasse III chitinase Cht1 fra mikromyceten Hypocrea virens | |
| CBM2 | ~100 | β-sandwich | Indeholder bakterielle enzymer | |
| CBM5 | ~60 | Enestående | Indeholder bakterielle enzymer | |
| CBM12 | 40-60 | Enestående | Som en del af bakterielle enzymer. | De fleste af modulerne i familien tilhører kitin-binding |
| CBM14 | ~70 | Unik, indeholder en hevein-lignende sekvens | Hydroide polypper , nematoder , krebsdyr , arachnider , insekter , cephalochordater , benfisk , mus , mennesker | Familien indeholder talrige chitin-bindende domæner. Der blev fundet moduler, både knyttet til det katalytiske chitinasedomæne, og dem, der er en del af proteiner uden en katalytisk funktion, i en isoleret tilstand (1 CBM er et separat protein) eller som en del af flere gentagelser |
| CBM18 | ~40 | Hevein rækkefølge | Planter, svampe | De fleste af modulerne i familien tilhører de kitinbindende. Der blev fundet moduler, både knyttet til det katalytiske chitinasedomæne, og dem, der er en del af proteiner uden en katalytisk funktion, i en isoleret tilstand (1 CBM er et separat protein) eller som en del af flere gentagelser |
| CBM19 | 60-70 | — | Svampe (inklusive gær Saccharomyces cerevisiae ) | Familiens moduler er kun karakteriseret ved den kitinbindende funktion |
| CBM33 | — | — | Kitinbindende protein fra bakterien Serratia marcescens | |
| CBM37 | ~100 | — | Enzymer af bakterien Ruminococcus albus | Chitin-bindende funktion er ikke afgørende |
I processen med nedbrydning af kitin af bakterier er flere enzymer involveret , der danner et kitinolytisk kompleks. Depolymeraser nedbryder chitin til chitooligosaccharider, N-acetylglucosamin og chitobiose ; som et resultat af arbejdet med deacetylaser dannes chitosan . Chitooligosacchariderne transporteres derefter til det periplasmatiske rum , muligvis gennem specifikke ydre membranporiner , hvor de spaltes til N-acetylglucosamin af chitodextrinaser . Chitobiose , der trænger ind i det periplasmatiske rum gennem uspecifikke poriner , spaltes delvist til N-acetylglucosamin af periplasmatiske N-acetylglucosaminidaser, transporteres delvist til cellecytoplasmaet , hvor det spaltes af cytoplasmatiske N-acetylglucosaminidaser, hvilket danner en yderligere mængde N-acetylglucosaminidaser. Til gengæld bliver N-acetylglucosamin sekventielt overført til cytoplasmaet og involveret i cellemetabolisme [ 13] .
Tilstedeværelsen af chitinaser er blevet fundet i et stort antal levende organismer. Mange af disse, såsom insekter , krebsdyr eller svampe , indeholder kitin ; andre - bakterier , højere planter , hvirveldyr - indeholder ikke kitin .
Alle organismer, der indeholder kitin , producerer kitinaser, som de sandsynligvis har brug for til cellevægs- eller eksoskeletmorfogenese [3] . Mange bakteriearter af slægterne Bacillus , Pseudomonas og Streptomyces er i stand til at bruge kitin som den eneste kulstofkilde på grund af udskillelsen af chitinaser [4] [5] . Derudover er produktionen af kitinaser af mange organismer en vigtig beskyttende faktor mod eksponering for forskellige patogener .
Hos leddyr deltager chitinaser i processerne med smeltning og fordøjelse . Chitinhydrolyseprodukter er som regel involveret i syntesen af en ny neglebånd [14] . Svampecellevægsvækstmodellen foreslået af Bartnicki-Garcia (1973) [15] antyder en rolle for lytiske enzymer i at opretholde balancen mellem cellevægssyntese og lysis under apikal mycelial vækst . Beviser for det fælles arbejde af kitinaser og kitinsyntaser blev opnået som et resultat af opdagelsen af aktiviteten af disse enzymer i processerne med sporespiring i Mucor mucedo [ 16] , eksponentiel vækst i Mucor rouxii [17] og Candida albicans [18 ] ] , såvel som opdagelsen af både kitinase- og chitinsyntaseaktivitet i den samme fraktion isoleret fra cellevæggen af M. mucedo [19] . Sahai et al. (1993) [20] viste, at kitinaser er til stede under hævelse og spiring af sporer , sporangiumdannelse , såvel som under mekanisk skade i Choanephora cucurbitarum og andre zygomyceter .
Takket være aktiviteten af chitinaser udføres autolyseprocessen i de modne frugtlegemer af Corpinus lagopus . Chitinolytiske enzymer påvises kort efter begyndelsen af sporefrigivelsen . Sammen med andre lytiske enzymer findes chitinaser i vakuoler ; deres funktion i intracellulær fordøjelse er ikke klar. Enzymaktivitet viser sig kort før starten af autolyse af hymeniale plader [21] . Når metabolisk aktivitet bremses i ældende celler, trænger kitinase passivt ind i cellevæggen . Det er blevet vist, at mange enzymer involveret i autolyseprocessen , inklusive chitinaser, binder sig til de subapikale vægge af Neurospora crassa og Aspergillus nidulans [22] . Disse data tyder på, at chitinaser er involveret i processen med hyferforgrening . Svampekitinaser spiller således en vigtig rolle i processer som apikal vækst, sporehævelse og spiring , sporefrigivelse , celledeling og mycelialforgrening [23] .
Af betydelig interesse er udsigten til at bruge disse enzymer som beskyttelsesmidler mod kitinholdige patogene organismer såsom svampe og insekter . Modstand mod patogener kan opnås gennem nedbrydning af deres vitale strukturer, såsom den peritrofiske membran eller insektkutikula , svampecellevæg eller gennem frigivelse af stoffer, der forårsager en beskyttende reaktion noget senere [24] .
De første undersøgelser af bakterielle kitinolytiske enzymer som en mulig antagonismefaktor går tilbage til begyndelsen af 1960'erne, hvor adskillige værker blev publiceret om den antifungale aktivitet af jordkitinolytiske bakterier af slægterne Bacillus og Pseudomonas [25] [26] . Det har vist sig, at svampecellevæggen , som indeholder kitin som den vigtigste strukturelle komponent, kan ødelægges af bakterielle chitinaser. Efterfølgende eksperimenter med oprensede chitinaser, chitinase-negative mutanter og chitinase-positive transformanter viste klart involveringen af kitinaser i mykolyse [27] [28] [29] [30] . Til dato har det vist sig, at endestykkerne af svampehyfer er særligt følsomme over for virkningen af bakterielle kitinaser , da det er i disse dele af myceliet, at kitinfibre syntetiseres [31] .
Den faktiske rolle af bakterielle chitinaser i den mykolytiske proces er dog ikke helt klar. Det blev bemærket, at den mekanisme, hvorved inhiberingen af svampevækst af kitinaser udføres, på ingen måde altid udføres på grund af deres kitinolytiske aktivitet. I denne henseende er det bemærkelsesværdigt, at bakterielle chitinaser, der tilhører familie 18, ikke har nogen antifungal aktivitet. Desuden er det ikke helt klart, om forskellen i struktur eller enzymaktivitet af chitinaser er relateret til deres potentielle svampedræbende aktivitet. Mange undersøgelser, der anvender induceret mutagenese , designet til at etablere de generelle egenskaber af chitinase-antifungal aktivitet, afslørede ikke noget klart mønster. Klasse I mutant chitinaser fra kastanjefrø, som ikke udviste chitinolytisk aktivitet, udviste således større antifungal aktivitet end vildtype chitinaser [32] . Den antifungale aktivitet af tobaksklasse I-chitinaser var tre gange højere i nærvær af det chitinbindende domæne [8] . Disse resultater viste, at en stor rolle i den antifungale aktivitet hører til den chitinbindende aktivitet og ikke til chitinaseaktiviteten. Omvendt udviste det chitinbindende domæne af rugklasse I-chitinase ingen antifungal aktivitet, mens tilstedeværelsen af det katalytiske domæne af den samme chitinase førte til væksthæmning af kontrolsvampepatogenet [33] . I undersøgelserne af Andersen et al. (1997) [34] brugte mutant byg klasse II kitinase uden kitinolytisk aktivitet og viste, at den antifungale aktivitet faldt med 85 % sammenlignet med vildtypen. Chitinaser med et chitinbindende domæne (klasse I og II) har en antifungal mekanisme, der er forskellig fra chitinaser, der mangler dette domæne. I nærvær af et intakt chitin-bindende domæne udføres antifungal aktivitet hovedsageligt på grund af bindingen af chitin af enzymet [3] .
Derudover kræver bakterier andre faktorer til lysis af svampemycelium [ 26] . Som et resultat af talrige in vitro forsøg [35] [36] blev det vist, at jordbakterier adskiller sig væsentligt i deres mykolytiske egenskaber. De Boer et al. (1998) [35] foreslog, at en så bred vifte af forskelle kunne forklares ved involvering af antibiotika i mykolyse . Bakterier producerer normalt flere typer endo- og exochitinaser. Roberts og Selitrennikov (1988) [37] fandt, at endochitinaser har en stærkere effekt på mycelievækst end exochitinaser. Den maksimale svampedræbende effekt blev imidlertid opnået under virkningen af et kompleks, der omfattede både endo- og exochitinaser.
Opdagelsen af fænomenet mykolyse udført af kitinolytiske bakterier foranledigede yderligere forskning i denne proces med henblik på mulig anvendelse af sådanne stammer til plantebeskyttelse . Rhizosfæriske bakterier er kommet ind i synsfeltet for sådanne undersøgelser, da de er bedre tilpasset miljøforhold, hvor fytopatogene svampe inficerer planterødder .
Forskellige forskere har vist, at stammer med svampedræbende aktivitet etableret in vitro reducerer symptomerne på plantesygdomme under drivhusforhold [31] [38] [39] . Imidlertid viste brugen af sådanne stammer i marken sig at være meget mindre vellykket [40] . For at løse dette problem er der behov for yderligere information om den økologiske funktion af kitinase-producerende bakterier og den rolle, deres mykolytiske aktivitet spiller under naturlige forhold.
Selv ved intensiv brug af fungicider når udbyttetab af dyrkede planter forårsaget af fytopatogene svampe 15 % [23] . Derfor er enhver løsning, der fører til en reduktion af konsekvenserne af dette problem, værd at overveje; samtidig vil det reducere den nuværende udbredte brug af pesticider . Biokontrollen af mange plantesygdomme forårsaget af svampe korrelerer med produktionen af kitinaser. Bakterier, der producerer kitinaser og (eller) glucanaser udviser således in vitro antagonisme mod svampe [41] [42] , mens plantekitinaser og streptomycete chitinaser sammen med β-(1,3)-glucanaser hæmmer væksten af svampe og ødelægger deres cellevæg [43] . Betydningen af chitinaseaktivitet er også blevet påvist under anvendelse af bakteriestammer , der mangler evnen til at producere chitinaser på grund af mutationer. For eksempel er Enterobacter agglomerans Tn 5-mutant , der mangler kitinolytisk aktivitet, ude af stand til at fungere som en antagoniststamme til bomuldsbeskyttelse, og ekspression af chiA -genet forårsager produktionen af endochitinaser i den transformerede stamme af E. coli (Migula), hvilket tillader denne stamme for at hæmme væksten af Rhizoctonia solani på bomuldsfrø. En lignende teknologi, der anvender Tn5-indsættelse under transposonmutagenese, demonstrerede rollen af Stenotrophomonas maltophila W81 ekstracellulære proteaser i at beskytte sukkerroer mod Pythium ultimum . Produktionen af potentielle biokontrolmidler kan opnås ved brug af genteknologier. En rekombinant E. coli -stamme , der udtrykte chiA -genet fra S. marcescens , modvirkede effektivt sygdomme forårsaget af Sclerotium rolfsii og R. solani [44] [45] . Sundheim [27] [46] og Sitrit et al. (1993) [47] viste, at chitinasegenet fra S. marcescens blev udtrykt i Pseudomonas sp. og i plantesymbionten Rhizobium meliloti . Den modificerede stamme af Pseudomonas viste antagonistisk aktivitet mod patogener såsom F. oxysporum og Gauemannomyces graminis . Den antifungale aktivitet af den transgene Rhizobium- stamme , som er i symbiose med rødderne af lucerne , bekræftes af lysisen af spidserne af R. solani hyphae , udført af knudeekstrakten.
En lovende retning er brugen af mycoparasitter til biokontrol. De mest undersøgte mycoparasitter er forskellige arter af Trichoderma såvel som Gliocladium virens . Ampelomyces quisqualis , Coniothyrium minitans , Laetisaria arvalis , Pythium nunn , Talaromyces flavus og Sporidesmium sclerotivorum er også blevet beskrevet som potentielle antagonister [48] [49] [50] .
| Hydrolaser ( EC 3): glycosylhydrolaser ( EC 3.2.1) | |
|---|---|
| |