IRES ( Eng. Internal Ribosome Entry Site - stedet for den interne landing af ribosomet ) - det regulatoriske sted for mRNA'et fra eukaryoter og deres vira , som giver cap -uafhængig eller intern initiering af translation . Med denne initieringsmekanisme binder ribosomet sig til mRNA direkte i IRES-regionen, som oftest er placeret i den 5'-utranslaterede region (5'-UTR) nær translationsinitieringsstedet , og går uden om cap-genkendelses- og scanningsstadierne [1] .
I 2016 er over 80 cellulære (i gær , planter og andre højere eukaryoter ) og 56 virale IRES blevet beskrevet. IRES er blevet fundet i medlemmer af følgende familier af vira: picornavirus , flavivirus , dicystrovirus og lentivirus [2] . Derudover er muligheden for eukaryot virus IRES-afhængig translation i bakterieceller for nylig blevet vist [3] .
De interne ribosomindgangssteder blev opdaget i mRNA'et af poliovirus og encephalomyocarditis virus i 1988 af grupperne af henholdsvis N. Sonenberg [4] og E. Wimmer [5] . De fandt ud af, at der er steder i RNA-molekylet, som kan binde ribosomer og derved initiere translation. Det viste sig, at hvis IRES placeres mellem to reportergener i mRNA, så vil den anden (3'-terminale) cistron også blive udtrykt . Imidlertid kan brugen af denne metode (den såkaldte metode for bicistroniske konstruktioner) føre til en række artefakter forbundet med splejsning og potentiel promotoraktivitet af de interne ribosom-landingssteder [6] .
Alle IRES af picornavira er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et GRNA-motiv i det centrale domæne, som sikrer dannelsen af en fire-loop konformation , samt en lille pyrimidin -rig region, som er placeret 20-25 nukleotider opstrøms for AUG . kodon . IRES af flavivira indeholder 4 domæner, betegnet I-IV, og i IRES af hepatitis C virus (HCV), en typisk repræsentant for IRES af denne gruppe af vira, er de sekvenser, der er nødvendige for aktiviteten af IRES, placeret mellem domæner II, III og IV og indfanger de første 30 nukleotider af den åbne ramme-udlæsning startende med startkodonet AUG. Den sekundære struktur af HCV IRES er blevet grundigt undersøgt. Det blev især fundet, at domæne II er en 75 nukleotider lang hårnål med tre interne og en terminal løkke, og at domæne III har den mest komplekse sekundære struktur , som omfatter flere helixer og hårnåle. Den sekundære og tertiære struktur af IRES af dicystrovira er ret konserveret og inkluderer 3 forskellige domæner, der hver indeholder en pseudoknot . IRES er blevet identificeret i næsten alle medlemmer af lentivirusfamilien (inklusive det humane immundefektvirus ), og deres IRES er ikke kun lokaliseret i 5'-UTR, men også i den kodende region , hvor de er involveret i ekspressionen af nogle isoformer af det vigtigste strukturelle polyprotein Gag [2] .
Strukturerne af eukaryot IRES er meget forskelligartede, og ingen konserverede sekvenser eller motiver er blevet identificeret . I nogle tilfælde skal IRES være stabile strukturer i mRNA for at virke effektivt, mens i andre tværtimod hæmmer en for stiv IRES-struktur initiering af translation. Det er blevet foreslået, at IRES ikke er stift faste strukturer og er i stand til at omarrangere, der regulerer deres aktivitet. IRES kan også forårsage dannelsen af forskellige proteinisoformer og derved yderligere udvide antallet af mulige proteinprodukter afledt af et enkelt gen [7] .
IRES findes i de 5'-utranslaterede regioner af virale genomiske mRNA'er og tillader dem at blive translateret uafhængigt af cap. En række cellulære mRNA'er indeholder også IRES [8] .
I celler er IRES ansvarlige for at lande ribosomer på både capped og non-capped transkripter i tilfælde, hvor cap-afhængig translationsinitiering hæmmes (under stress , på et bestemt stadie af cellecyklussen eller under apoptose ), og dermed sikre den kontinuerlige syntese af de nødvendige proteiner . En række gener, hvis mRNA'er indeholder IRES - c-Myc , APAF1 , Bcl-2 - udtrykkes kun lidt under normale forhold, men i visse situationer kan deres ekspression øges betydeligt på grund af IRES-afhængig translation. Det antages, at IRES også kan være involveret i at opretholde et lavt niveau af translation af et antal mRNA'er under normale betingelser ved at binde ribosomer og forhindre dem i at binde sig til de vigtigste initieringssteder. Denne mekanisme for intern initiering er i øjeblikket dårligt forstået, men det er klart, at effektiviteten af IRES er meget afhængig af trans-regulatoriske proteinfaktorer, der giver finregulering af IRES-afhængig translation på niveauet af individuelle celler [1] .
Strukturer i 5'-UTR kan påvirke aktiviteten af IRES, og denne indflydelse kan medieres af interaktioner både med forskellige trans-regulatoriske faktorer og direkte med ribosomer. Eksempler på gener, hvis IRES er under kontrol af trans-regulatoriske proteiner, er Myc proto-onkogener involveret i reguleringen af celleproliferation [ 9] . IRES-afhængig translation af disse mRNA'er kræver specielle translationsfaktorer ITAF ( IRES trans-acting factors ), som fungerer som RNA- chaperoner , hvilket tvinger det til at vedtage den korrekte konformation, der er egnet til binding til 40S-underenheden af ribosomet [10] .
Tilstedeværelsen af IRES mellem AUG og andre startkodoner (andre end AUG) antyder en mulig rolle for IRES i translationsinitiering fra svage ikke-standard startkodoner. IRES kan også interagere med korte læserammer ( uORF ). For at bevise eksistensen af IRES i RNA-strukturen er det ikke nok at analysere dets sekvens - alle antagelser skal bekræftes af eksperimentelle data [7] .
X-linked inhibitor of apoptosis ( X-linked inhibitor of apoptosis, XIAP ) spiller en vigtig rolle i reguleringen af apoptose , så dens syntese skal kontrolleres præcist. 5'-UTR af XIAP mRNAer 1700 nukleotider lang og indeholder en IRES, der letter XIAP syntese under stress. Ud over det beskrevne XIAP- mRNA producerer alternativ splejsning et mRNA med en kortere 5'-UTR på 323 nukleotider og ingen IRES. Mængden af XIAP mRNAmed en kort 5'-UTR i celler er 10 gange større end med en lang. Det er blevet fastslået, at mRNA med en kort 5'-UTR er ansvarlig for XIAP-syntese under normale forhold og oversættes af en cap-afhængig mekanisme, mens mRNA med en lang 5'-UTR giver XIAP-syntese under stressforhold. Kombinationen af alternative 5'-UTR'er og translationsinitieringsmekanismer sikrer således konstant ekspression af XIAP under alle forhold [7] .
Et andet eksempel på kontrol af genekspression gennem forskellige elementer af 5'-UTR er genet for human fibroblast vækstfaktor 2 ( fibroblast vækstfaktor 2, FGF-2 ) . FGF-2 udtrykkes i 5 forskellige isoformer som følge af anvendelsen af alternative startkodoner i 5'-UTR, og translation af dets mRNA kan ikke kun forløbe cap-afhængigt, men også IRES-afhængigt. Interessant nok medieres translation fra fire af de fem startkodoner af IRES. Det foreslås, at IRES letter translation fra hver af disse fire kodoner via modulering af mRNA-strukturen ved hjælp af transaktiverende faktorer [7] .
I mange RNA- vira sker translationsinitiering af en cap-uafhængig mekanisme med deltagelse af IRES lokaliseret i 5'-UTR [11] . Dette sker for eksempel ved HIV, hepatitis A og C virus [12] . Denne mekanisme for translationsinitiering er praktisk, fordi der i dets tilfælde ikke er behov for at samle et præinitiatorproteinkompleks, og viruset kan formere sig hurtigt [13] .
Nogle virale mRNA'er har et kovalent bundet protein ( VPg ) i 5'-enden , så brugen af cap-afhængig initiering er udelukket for dem. HCV IRES danner et kompleks med 40S-underenheden af ribosomet og rekrutterer værtscelletranslationsfaktoren eIF3 [7] . IRES fra mange picornavirus binder ikke 40S direkte, men gør det gennem initieringsfaktoren eIF4G, hvis højaffinitetsbindingssted er placeret i IRES [14] . For mange vira (for eksempel picornavirus) er kanoniske translationsinitieringsfaktorer alene ikke nok til IRES-afhængig initiering: de kræver også specielle faktorer kaldet ITAF'er [15] . Afhængigt af egenskaberne af den sekundære struktur og behovet for visse translationsfaktorer, er IRES opdelt i forskellige klasser inden for individuelle familier af vira [16] . For eksempel er IRES for picornavirus opdelt i 4 klasser (I-IV) [17] .
Det virale RNA- genom kan indeholde mere end én IRES. For eksempel har cricket paralysis virus , som er medlem af dicystrovirus familien , et RNA-genom med to IRES, hvoraf den ene er lokaliseret i 5'-UTR og den anden i den intergene region . Det viste sig, at funktionen af disse elementer er anderledes: IRES placeret i 5'-UTR initierer translation på alle stadier af virusinfektion , mens IRES lokaliseret i den intergene region undertrykkes det meste af tiden og aktiveres kun 2– 3 timer efter infektion. Temporal afkobling af to IRES'er er en effektiv viral strategi til ekspression af visse proteiner under en veldefineret fase af infektion [18] .
Da IRES spiller en afgørende rolle i reguleringen af en række gener, fører mutationer , der påvirker IRES, til udvikling af visse sygdomme. Især omfatter sådanne sygdomme hos mennesker X - bundet Charcot-Marie-Tooth sygdom , myelomatose og fragilt X-syndrom [19] .
Virale IRES'er kan målrettes af mange antivirale lægemidler . I øjeblikket udvikles lægemidler, der direkte ødelægger strukturen af IRES eller interfererer med IRES's interaktion med ribosom- eller proteinfaktorerne, såsom translationsinitieringsfaktorer. Især IRES af hepatitis C-virus, på grund af dets konservatisme blandt prøverne fundet i klinikken, kan være målet for lægemidler, der blokerer oversættelsen af denne virus [20] . Antisense - oligonukleotider , peptido - nukleinsyrer (RNA), lukkede nukleinsyrer (LNA), morpholin-oligonukleotider , korte hårnåle-RNA'er , RNA- aptamerer , ribozymer , deoxyribozymer , peptider og små molekyler [21] . Det er blevet vist, at Janus kinase 2 - hæmmeren AZD1480 er i stand til at undertrykke reproduktionen af hepatitis A-virussen ved at blokere dens IRES-afhængige translation [22] . Apigenin , et lægemiddel, der anvendes til behandling af mund- og klovsyge, undertrykker udviklingen af en virusinfektion ved at forstyrre den IRES-afhængige oversættelse af mund- og klovsygevirus [23] . Livscyklussen for enterovirus hæmmes effektivt af anticancerlægemidlet idarubicin , som binder til IRES [24] .
Af særlig interesse er onkolytiske vira , hvis livscyklus afhænger af IRES, i forbindelse med deres mulige anvendelse i anticancerterapi [25] .
IRES har fundet bred anvendelse i design af vektorer til genterapi . Ved at lokalisere IRES'et i 5'-UTR mRNA'et af de nødvendige gener kan deres koordinerede ekspression opnås. I sådanne tilfælde er encephalomyocarditis virus IRES [26] mest almindeligt anvendt .
For at teste om en given RNA-sekvens har IRES-egenskaber, kan følgende metode bruges. Der skabes et bicistronisk eukaryotisk mRNA, hvori den undersøgte sekvens er placeret mellem to reporter- åbne læserammer . En åben ramme placeret før sekvensen under undersøgelse vil blive oversat til et protein ved hjælp af en cap-afhængig mekanisme. Hvis den undersøgte sekvens har egenskaberne af IRES, så vil proteinet svarende til den anden åbne ramme også akkumuleres i cellen [6] .
Webservere er blevet udviklet til at forudsige tilstedeværelsen af IRES i virale RNA'er (VIPS) eller i virale og cellulære RNA'er (IRESPred) [27] .
I 2016 blev RNAiFold2T-algoritmen foreslået til udvikling af specifikke RNA-termometre indeholdende IRES. Den hætteuafhængige translation af sådanne termo-IRES-elementer er omkring 50 % mere intens ved 42°C end ved 30°C. Imidlertid er deres translationseffektivitet stadig mindre end vildtype IRES, som ikke afhænger af temperaturen [28] .