Korte åbne læserammer [1] ( engelsk opstrøms åbne læserammer, uORF ) er åbne læserammer ( engelsk åben læseramme, ORF ) placeret inde i den 5'-uoversatte region (5'-UTR) af eukaryote og nogle virale [2] mRNA . uORF'er er involveret i reguleringen af genekspression i eukaryoter og vira [3] [4] og undertrykker sædvanligvis translationen af hovedlæserammen (dvs. den kodende sekvens ), selvom deres virkning kan være ledsaget af forskellige effekter [ 5] .
Generelt er mRNA opdelt i en 5'-utranslateret region (5'-UTR), en åben læseramme (CDS), der starter ved et startkodon og slutter ved et stopkodon, og en 3-utranslateret region (3'- UTR). Korte åbne læserammer (uORF'er) er i 5'-UTR før hovedlæserammen. Imidlertid kan uORF overlappe med hovedkodende sekvens ( eng. kodende sekvens, CDS ), så er dens stopkodon placeret efter initiatorkodonet CDS [1] .
uORF'er er til stede i ca. 50% af 5'-UTR af humane mRNA'er og mindst 35% af mammale mRNA'er [1] , og deres tilstedeværelse forårsager et fald i genekspression, hvilket reducerer mængden af funktionelt mRNA med 30% og protein dannelse med 30-80%. Ribosomer, der binder til startkodonet af den korte åbne læseramme (uAUG), starter translation af uORF, hvilket kan påvirke effektiviteten af translationen af hovedlæserammen (dvs. den kodende region). Hvis der ikke er nogen effektiv binding af ribosomet til startkodonet i den kodende region (det vil sige initiering af translation), falder niveauet af proteindannelse, og dermed niveauet af ekspression af det tilsvarende gen, som et resultat. Den omvendte situation kan også opstå: translationen af uORF vil fortsætte til translationen af den kodende region, og som følge heraf dannes et protein, der er for langt, hvilket kan være skadeligt for kroppen.
Reduktionen i translationseffektivitet på grund af tilstedeværelsen af uORF i 5'-UTR er en velundersøgt effekt; et eksempel, der illustrerer det, er poly(A)-polymerase α ( poly( A )-polymerase α, PAPOLA ) genet , hvis mRNA indeholder to stærkt konserverede uORF'er i 5'-UTR. Mutation af den proksimale uAUG forårsager en stigning i effektiviteten af translation af dette mRNA, derfor reducerer uORF signifikant ekspressionen af dette gen. Et andet eksempel er thyreoideahormonreceptoren , som har en aktiverende eller undertrykkende effekt på transkriptionen af en række målgener: stærk undertrykkelse af dens translation udføres af en 15 nukleotid uORF inde i 5'-UTR af dens mRNA [6] .
Det er en udbredt opfattelse, at uORF'er reducerer effektiviteten af translation, fordi efter afslutningen af translation af uORF'en kan ribosomet ikke genstarte translation og translatere den kodende region. Det har vist sig, at uORF-længden for vellykket translationsreinitiering ikke bør overstige 20 kodoner, men der er stadig ingen tilfredsstillende forklaring på dette faktum [1] . I nogle tilfælde og under visse betingelser kan uORF- startkodonet ignoreres af scanningsribosomet. På samme tid kan den hæmmende effekt af uORF under påvirkning af nogle interne og eksterne faktorer forstærkes, og de vigtigste af disse begrænsende faktorer er tilgængeligheden af initieringskomplekset efter afslutning af uORF-translation [7] .
Nylige undersøgelser af mere end 500 gen- loci indeholdende 5'-UTR har imidlertid vist, at der ikke er nogen sikker sammenhæng mellem virkningen af uORF på ekspressionen af det næste gen og afstanden mellem uORF'en og den kodende sekvens. Samtidig foreslår forfatterne af undersøgelsen, at i gener, der indeholder en enkelt uORF, forekommer CDS-translation højst sandsynligt efter scanning af uORF ved ribosomet uden dets dissociation, og ikke gennem translationsgeninitiering. Denne antagelse er meget forskellig fra konklusionerne fra Kozak (1987) og generelt alle tidligere ideer om uORF (på det tidspunkt blev reglen anset for at være korrekt i alle tilfælde, ifølge hvilken ribosomet starter translation fra den første startkodon, der det støder på, når man bevæger sig fra 5'- til 3'-endens mRNA [8] ).
Desuden viste eksperimenter med celler, der mangler Rent1 (en faktor involveret i processen med dirigeret ødelæggelse af defekte mRNA'er - nonsens - medieret henfald, NMD ) at i fravær af NMD blev transkripter indeholdende uORF oversat med succes. Dette viser, at NMD også spiller en vigtig rolle i reguleringen af disse transkripters funktion. Mest sandsynligt er der flere muligheder for udvikling af hændelser efter interaktionen mellem uORF og ribosomet: fortsættelse af oversættelse, fortsættelse af scanning eller genstart af oversættelse af kodningsregionen, og hvilken af dem der vil forekomme afhænger af en række faktorer.
GCN4Således indeholder mRNA'et fra gær -GCN4-genet , som koder for en transkriptionsaktivator, 4 uORF'er i 5'-UTR'en, og kun én af dem tillader ribosomet at begynde translation af den kodende region. Effektiv reinitiering lettes af to cis - forstærkere placeret på hver side af uORF. Yderligere undersøgelser viste, at den 5'-cis-aktiverende sekvens (enhancer) interagerer med det N-terminale domæne af eIF3A /TIF32 underenheden af eIF3 initieringsfaktoren, som et resultat af hvilket 40S ribosom underenheden forbliver på mRNA'et efter translation af uORF1 og fortsætter scanningen. Det har også vist sig, at reinitiering lettes af specifik foldning af mRNA'et under ribosomscanning, og denne foldning tillader forstærkeren at interagere med en anden mRNA-sekvens. Dette er blot et eksempel på uORF-gen-knockout, men efterhånden er det klart, at knockout-mekanismen er meget mere kompleks, end scanningsmodellen antyder. Yderligere forskning er nødvendig for at belyse denne mekanisme eller mekanismer i detaljer [9] .
Proteinkinase CEt andet eksempel, der illustrerer kompleksiteten af uORF-medierede gennedlukningsmekanismer, er proteinkinase C ( PKC ) . PKC er et medlem af serin/threonin-proteinkinase- involveret i reguleringen af cellevækst og -differentiering . Dens nye isoform , PKCη, er vævsspecifik og udtrykkes hovedsageligt i hurtigt skiftende celler, såsom epitelceller . For nylig har denne isoform vist sig at spille en specifik rolle i reaktionen på stress , og dens udtryk korrelerer med resistens mod kræftlægemidler i en række kræftformer . 5'-UTR af den humane PKCη er en lang (659 nukleotider), GC -rig sekvens og indeholder 2 små konserverede uORF'er. Mutationer i hver af disse uORF'er forårsager en lille stigning (med 1,5 og 2,2 gange) i ekspressionen af den primære ORF, og mutationer i begge forårsager en tre gange stigning. Tilsyneladende finder mekanismen for undertrykkelse af PKCη-translation sted under normale forhold. Under stressforhold (mangel på glucose eller hypoxi ) er to uORF'er også involveret i ekspression, da de giver en svag scanning af 5'-UTR og øger translationen af den kodende sekvens. Variation i antallet af ribosomer bundet til transkriptet og translation af hver uORF kan også give cellespecifik "tuning" af genekspression [10] .
Ornithin decarboxylaseDet blev fundet, at ud over AUG kan kodoner, der adskiller sig fra AUG med ét nukleotid, også anvendes som transkriptionsstartstedet, og initieringseffektiviteten vil i hvert tilfælde blive bestemt af miljøet for det ikke-standardiserede startkodon. Således moduleres ekspressionen af ornithin-decarboxylase ( eng. ornithin-decarboxylase, ODC ), som er involveret i biosyntesen af polyaminer , af uORF med AUU-startkodonet. Effektiviteten af initiering i dette tilfælde varierer afhængigt af den intracellulære koncentration af polyaminer, mens effektiviteten af initiering til AUU er stærkt reduceret i celler udtømt i polyaminer: det er 18% af effektiviteten af translation af hoved-ORF og i celler mættede med polyaminer er det 54%. Således opretholdes reduceret ODC-ekspression i nærvær af polyaminer. Dette eksempel viser, at der sandsynligvis vil være et meget større antal uORF'er end tidligere antaget [10] .
Ornithin decarboxylaseSelvom de fleste uORF'er negativt påvirker genekspression, øger tilstedeværelsen af uORF'er nogle gange translation. Et eksempel er det bicistroniske vpu-env- mRNA fra HIV -1 -virussen , som indeholder en konserveret meget lille uORF. Denne uORF er kun placeret 5 nukleotider før AUG vpu og slutter snart med en stopkodon, der overlapper med AUG vpu . Denne uORF har vist sig at have en betydelig gavnlig effekt på env -oversættelse uden at forstyrre vpu- oversættelsen . Mutanter blev opnået, hvor afstanden mellem uORF og hoved-AUG blev forøget med 5 nukleotider, og det blev vist, at uORF ikke er involveret i vpu -initiering . Baseret på dette foreslog forfatterne af undersøgelsen, at denne lille uORF kan tjene som et ribosomretardationssted, hvor ribosomet interagerer med RNA- strukturer, der letter dets fremme, det vil sige, at det fysisk overvinder 5'-UTR-delen for at nå hovedstartkodon [11] .
RNase HI løbet af det sidste årti har det vist sig, at reguleringen af genekspression ved uORF er en kompleks proces. Et godt eksempel på en så kompleks regulering er følgende mekanisme. RNase H1 er til stede i kernerne og mitokondrierne i pattedyrsceller og udtrykkes forskelligt i forskellige celletyper. Ekspressionen af isoformer af dette enzym er under kontrol af to intraramme-startkodoner AUG, såvel som uORF, lokaliseret i 5'-UTR. RNase H1-translation i mitokondrier starter ved den første AUG-kodon og er sædvanligvis begrænset til uORF, hvilket resulterer i, at mængden af den mitokondrielle isoform er omkring 10% af den af den nukleare isoform. Translation af den nukleare isoform starter fra den anden AUG og afhænger ikke af uORF, da ribosomet er i stand til effektivt at genstarte translation fra den anden AUG, som om man springer uORF over. Denne reguleringsmekanisme gør det muligt at kontrollere ekspressionen af RNase H1 i mitokondrier, hvor dets overskud kan føre til celledød uden at påvirke det normale ekspressionsniveau af den nukleare isoform. Det blev også fundet, at en ændring i nukleotidmiljøet af AUG forårsagede transkriptakkumulering, hvilket indikerer involvering af andre faktorer i denne mekanisme. Dette eksempel illustrerer et meget specifikt genekspressionsreguleringssystem, hvor uORF og andre faktorer er involveret [12] .
Endelig giver alternative promotorer og splejsning , såvel som det faktum, at ribosomet nogle gange kan interagere med out-of-frame codons og bruge ikke-standard startkodoner , yderligere muligheder for at regulere genekspression med deltagelse af uORF. En nylig undersøgelse i en human monocytcellelinje , der blev behandlet med puromycin til for tidlig translationsterminering, og translationsinitieringssteder blev bestemt, viste 2994 nye uORF'er i 5'-UTR alene, selvom det er sikkert, at mange uORF'er også overlapper med den kodende region og 3'-UTR [13] .
Den faktiske nukleotidsekvens af uORF'er påvirker normalt ikke deres virkning; kun længden, antallet og afstandene mellem uORF'er [7] er vigtige . Men i nogle tilfælde afhænger effekten af uORF stadig af dets nukleotidsekvens, især af aminosyresekvensen af det peptid , det koder for [14] . Selvom betydningen af uORF'er som regulatoriske elementer involveret i reguleringen af ribosombinding og translation er velkendt, er funktionen og endda skæbnen for uORF-kodede peptider ofte ukendt, muligvis på grund af vanskeligheder med at analysere niveauet af ekspression og lokalisering af peptider . Bevis for, at uORF-translaterede peptider er til stede i celler, blev opnået i 2004, hvor 54 peptider, der var mindre end 100 aminosyrerester lange, blev identificeret. Disse peptider blev produceret i humane kroniske myeloid leukæmi celler , som hver blev fundet at indeholde uORF. Selvom disse peptider er blevet identificeret, er det ukendt for tusinder af uORF'er i disse celler at producere proteiner, der kan identificeres eksperimentelt. Dette kan indikere, at for det første kan proteiner translateret fra uORF selektivt udsættes for proteolyse ; for det andet udtrykkes nogle uORF'er, men ikke i celler af denne type; for det tredje giver mange uORF'er ikke anledning til proteiner. Det er dog indlysende, at nogle uORF'er stadig oversættes til peptider, der akkumuleres i celler og derfor tilsyneladende bærer en funktionel belastning, selvom det for mange endnu ikke er blevet etableret [12] .
I nogle tilfælde er virkningsmekanismen af uORF-kodede peptider imidlertid kendt. Et sådant peptid fungerer som et cis - regulerende element og forbliver forbundet med det translaterende ribosom. Tilsyneladende er mekanismen for dets virkning forbundet med den specifikke interaktion mellem peptidet og ribosomet, hvilket resulterer i en forsinkelse i termineringen og umuligheden af yderligere bevægelse af ribosomet langs mRNA'et. Eksempler på mRNA'er, hvis uORF'er koder for hæmmende peptider, er pattedyr S- adenosylmethionindecarboxylase mRNA, gær CPA1 mRNA, der koder for enzymet arginin biosyntese ; gp48 mRNA af humant cytomegalovirus . Længden af disse peptider varierer fra 6 til 25 aminosyrerester, og det er blevet bevist, at det er deres aminosyresekvens, der bestemmer den hæmmende effekt [15] .
Inhibering af translation af den kodende sekvens på grund af uORF kan reguleres af en række transfaktorer og miljøforhold. For eksempel hæmmes translation af det allerede nævnte S-adenosylmethionindecarboxylase-mRNA af uORF i hvilende T-celler , men translation er vellykket i stimulerede T-celler og T-linjeceller; i deres tilfælde ser uORF ud til at blive ignoreret ved at scanne ribosomer. Et andet eksempel er det allerede nævnte gær CPA1 mRNA. I hendes tilfælde blokerer uORF kun translation af hovedlæserammen i nærværelse af arginin. Den nøjagtige mekanisme for denne regulering er ikke blevet fastlagt, men hæmning af peptidyltransferasefunktionen som reaktion på tilføjelsen af arginin stopper ribosomer ved uORF-stopkodonet. Det antages, at arginin enten direkte hæmmer peptidyltransferaseaktivitet eller reducerer tilgængeligheden af ribosomets A-sted [16] .
Et interessant fænomen observeres under translationen af polycistronisk RNA af blomkålsmosaikvirus ( blomkålsmosaikvirus, CaMV ) . Dens 5'-UTR indeholder uORF'er, der som forventet har en undertrykkende effekt på translationen af den kodende sekvens. Desuden passer næsten hele 5'-UTR ind i en hårnål med en udviklet sekundær og tertiær struktur , hvilket skaber en hindring for ribosomets bevægelse. Dette er, hvad der sker i planteceller, der ikke er værter for virussen, og i cellefrie systemer fremstillet ud fra deres ekstrakter. I planteværter af viruset sker translation, tilsyneladende på grund af tilstedeværelsen af en speciel cellulær faktor og de første uORF'er. En detaljeret undersøgelse afslørede, at når CaMV RNA er translationelt aktivt, springer ribosomer over den centrale del af hårnålen med en rumlig struktur, som om de hopper over den. Med andre ord, i dette tilfælde finder shunting sted , hvor ribosomet aflæser de første 3 uORF'er, mens hårnålens bund afvikles, og ribosomet kommer ind i en zone med en sådan struktur, at det kan hoppe fra stedet umiddelbart efter tredje uORF til stedet inde i den syvende uORF; derefter bevæger ribosomet sig længere mod 3'-enden og begynder at translatere den kodende region [17] .
Mutationer, der påvirker uORF, er generelt skadelige, fordi de forstyrrer genekspressionsreguleringssystemet, hvilket direkte kan føre til sygdom. For eksempel fører mutationer, der ødelægger uORF i 5'-UTR af genet, der koder for HR-proteinet ( engelsk human hairless homolog ), til autosomal dominerende form for alopeci . Ikke mindre skadelige er mutationer, der skaber nye uORF'er, da de også forstyrrer den normale regulering af genekspression. Det er blevet foreslået, at en mutation i et tumorsuppressorgen kan føre til reduceret ekspression af beskyttende proteiner og udvikling af cancer. Mutationer i CDKN2A genet, der koder for en inhibitor af proteinkinaser kan være forudsætninger for udviklingen af melanom . Det er blevet fastslået, at mutationer i uORF også kan føre til udvikling af sygdomme som arvelig trombocytæmi , Alzheimers sygdom , bipolar affektiv lidelse , kardiomyopati , arytmogen højre ventrikulær dysplasi [18] . Alle disse eksempler beviser endnu en gang den usædvanlige betydning af uORF i den fine regulering af genekspression og vedligeholdelse af homeostase , og variabilitet i uORF-regionen kan bestemme en individuel fænotype eller disposition for sygdomme [19] .