Secretomics er en sektion af proteomics , der studerer alle udskilte proteiner i en celle , væv eller organisme [1] . Udskilte proteiner er ikke kun involveret i mange forskellige fysiologiske processer, herunder cellulær signaltransduktion og ekstracellulær matrix remodellering , men er også en integreret del af invasionen og metastasen af maligne celler [2] . Sekretomik er derfor vigtig for at identificere cancerbiomarkører .
I 2000 opfandt Tjalsma et al. udtrykket secreto i deres arbejde med bakterien Bacillus subtilis . Sekretomet blev defineret som helheden af alle udskilte proteiner og en bakteries sekretoriske apparat. Ved hjælp af en database med proteinsekvenser fra B. subtilis og en algoritme, der kontrollerer hydrolysesteder, der er karakteristiske for udskilte proteiner og N-terminale signalpeptider , var de i stand til at forudsige, hvor meget af proteomet , der udskilles af cellen [3] . I 2001 satte det samme laboratorium standarden for sekretomik: forudsigelser baseret på kun én aminosyresekvens er ikke tilstrækkelige til at definere et sekretom. De brugte 2D elektroforese og massespektrometri til at identificere 82 B. subtilis udskilte proteiner, hvoraf kun 48 blev forudsagt baseret på aminosyresekvens ved metoden beskrevet i deres tidligere arbejde [4] .
Forståelsen af, at der er mange ikke-traditionelle sekretionsveje, og at mange ikke-udskilte proteiner er en del af den traditionelle sekretoriske vej, har skabt et behov for en dybere definition af sekretomet. I 2010 foreslog Agrawal og kolleger at definere en hemmelighed som "en global gruppe af proteiner udskilt i det ekstracellulære rum af en celle, væv, organ eller organisme på et vilkårligt tidspunkt og under vilkårlige forhold gennem kendte og ukendte sekretoriske mekanismer, herunder uregulerede og regulerede sekretoriske organeller » [5] .
Originaltekst (engelsk)[ Visskjule] vi foreslår en revideret sekretomdefinition som ''den globale gruppe af udskilte proteiner i ECS'et af en celle, væv, organ eller organisme på ethvert givet tidspunkt og betingelser gennem kendte og ukendte sekretoriske mekanismer, der involverer konstitutive og regulerede sekretoriske organeller''.Urenheder er altid til stede i cellekulturer . Bovint serum fra dyrkningsmediet og cellerester forurener et sæt udskilte proteiner, der bruges til analyse. Kontaminerende komponenter i bovint serum er af særlig bekymring, da mange af dem har lignende proteinsekvenser som humane (f.eks. fibronectin og fibulin-1 ) [1] . For at fjerne kontaminanter skal celler vaskes med natriumphosphatbuffer (PBS) eller serumfrit medium (SFM) før inkubation i SFM og opsamling af udskilte proteiner. Alle manipulationer til frigivelse af intracellulære proteiner skal udføres omhyggeligt for at undgå celleskade [1] . Derudover kan inkubationstiden og -betingelserne optimeres, så metabolisk stress forårsaget af mangel på næringsstoffer i dyrkningsmediet ikke vil påvirke sekretomanalysen [6] .
Nogle proteiner produceres i lave koncentrationer og fortyndes derefter i dyrkningsmedier eller kropsvæsker. Sådanne proteiner er svære at påvise. Teknikker til påvisning af små mængder, såsom udfældning af proteiner med trichloreddikesyre , kan bruges sammen med meget følsomme metoder såsom brug af antistofmikroarrays , som kan påvise selv enkelte proteinmolekyler [7] .
Mange sekretomundersøgelser udføres in vitro ved anvendelse af cellekulturteknikker. Men det er stadig uklart, om de samme proteiner udskilles under in vivo-betingelser . Et stigende antal undersøgelser, især dem, der analyserer tumorsekretomer, bruger in vivo -metoder til at bekræfte konsistensen af resultater opnået i laboratoriet. For eksempel opsamles proksimale kropsvæsker nær tumoren til sekretomanalyse [1] .
Mange udskilte proteiner har en N-terminal peptidsekvens, der er ansvarlig for translokation af det translaterede protein ind i det endoplasmatiske reticulum (ER) . Proteinbehandling finder sted i ER , hvilket i sidste ende vil føre til sekretion. Tilstedeværelsen af disse signalpeptider kan bruges til at forudsige cellens sekretom. Programmer som SignalP kan identificere signalsekvenser (og deres hydrolysesteder) for at forudsige proteiner, der skal udskilles. Da transmembranproteiner også behandles i ER, men ikke udskilles, bruges programmer som TMHMM-serveren til at forudsige transmembrane domæner og dermed eliminere falske positiver . Nogle udskilte proteiner har ikke klassiske signalpeptidsekvenser. Disse proteiner, der mangler en N-terminal sekretorisk leder, vil blive savnet af SignalP. SecretomeP er et program, der er specielt designet til at forsøge at forudsige ikke-klassiske sekretoriske proteiner ud fra deres sekvenser [5] . Genomomfattende sekretomer er blevet forudsagt for en lang række organismer, herunder mennesker , mus , zebrafisk og hundredvis af bakterier [5] .
Helgenomforudsigelsesmetoder har mange problemer. Der er stor sandsynlighed for falsk positive og falsk negative resultater. Derudover er genekspression meget afhængig af miljøforhold, hvilket betyder, at sekretomet forudsagt fra genomiske eller cDNA-biblioteker er usandsynligt, at det fuldstændigt falder sammen med det sande sekretom. For at bekræfte de således opnåede data er proteomiske tilgange nødvendige [5] .
Adskillige genomomfattende sekretom- og vidensbaser er tilgængelige baseret på kuration og computerforudsigelser. Disse databaser inkluderer: Fungal Secretome Database (FSD), Fungal Secretome Knowledge Base (FunSecKB), Fungal Secretome and Intracellular Proteome Knowledge Base (FunSecKB2), Plantesekretom og Intracellular Proteome Knowledge Base (PlantSecKB) og mælkesyre B. Sekretomdatabase . _ Metazoa Secretome and Intracellular Proteome Database (MetazSecKB) og Protist Secretome and Intracellular Proteome Database (ProtSecKB) er for nylig blevet frigivet . Selvom der er nogle unøjagtigheder i computerforudsigelser, giver disse databaser nyttige ressourcer til yderligere at karakterisere placeringen af proteiner i en celle.
Massespektrometrisk analyse er en integreret del af sekretomi. Serum eller supernatant , der indeholder de udskilte proteiner, fordøjes af en protease , og proteinerne adskilles ved todimensionel gelelektroforese eller kromatografiteknikker . Hvert individuelt protein analyseres derefter ved massespektrometri, og det resulterende peptidmassespektrum kan ses i en database for at identificere proteinet [1] .
Brug af den aminosyrebaserede ikke-radioaktive isotopmærkning (SILAC) metode i cellekultur kan hjælpe med at skelne mellem udskilt protein og urenheder fra bovint serum i cellekultur. Supernatanten fra celler dyrket i normale medier og celler fra medier mærket med aminosyrer blandes i et en-til-en-forhold og analyseres derefter ved massespektrometri . Proteinkontaminanter i serum vil kun vise én top, da de ikke har en mærket ækvivalent [1] . Et eksempel er den vellykkede brug af SILAC til at skelne mellem proteiner udskilt af humane chondrocytter og urenheder fra serum [8] .
For nylig er brugen af antistofmikroarrays, en ekstremt følsom og high-throughput proteindetektionsmetode, blevet en del af sekretomanalyse. Antistoffer eller andre bindemiddelmolekyler er fikseret til et fast underlag. Derefter tilsættes en blanding af fluorescensmærket protein. Intensiteten af signalet bruges til at identificere proteiner. Antistofmikroarrays er ekstremt alsidige: de kan bruges til at analysere mængden af protein i en blanding, til at analysere andre proteinisoformer , post-translationelle modifikationer og til at analysere proteiners biokemiske aktivitet. Derudover er disse mikroarrays meget følsomme: de kan detektere enkelte proteinmolekyler. Antistofmikroarrays bruges i øjeblikket mere til analyse af humane plasmaprøver , men kan også bruges til dyrkede celler og sekretomanalyse af biologiske væsker , hvilket giver en enkel måde at påvise flere proteiner samtidigt [7] .
Ud over deres vigtige rolle i normale fysiologiske processer spiller udskilte proteiner også en vigtig rolle i carcinogenese , idet de er involveret i cellevækst, migration og invasion og angiogenese . Disse aspekter gør sektomi til en fremragende metode til påvisning af cancerbiomarkører [9] . Brugen af den proteomiske metode til at påvise cancerbiomarkører i biologiske væsker eller serum kan i høj grad kompliceres af, at kropsvæsker er meget komplekse og heterogene. Sekretomanalyse af cancercellelinjer i syge væv repræsenterer et enklere og mere præcist alternativ til biomarkørdetektion [6] .
Til sekretomanalyse af cancer anvendes to hovedtyper af materialer: supernatanter af cancercellelinjer og biologiske væsker (proksimale og væsker i kontakt med tumoren ). Supernatanten af cancercellelinjer er den foretrukne kilde til udskilte proteiner. Der er mange dyrkede linjer tilgængelige, og det er lettere at analysere supernatanten end den proksimale kropsvæske. Men det er stadig uklart, om cellelinjens hemmelighed er en god repræsentation af den virkelige tumor i dens specifikke mikromiljø. Derudover viser dyrkede cellelinjer ikke heterogeniteten af en ægte tumor [9] . Proksimal væskeanalyse kan give en bedre forståelse af en persons tumorsekretom, men denne metode har også sine ulemper. Proximale væskeopsamlingsprocedurer bør standardiseres, og godartede kontroller skal være nødvendige. Derudover kan erhvervede og genetiske forskelle mellem patienter komplicere analysen [9] .
Sekretomanalyse har afsløret nye potentielle biomarkører for mange typer kræft, herunder lungekræft , leverkræft , bugspytkirtelkræft , tyktarmskræft , prostatacancer og brystkræft . Prostataspecifikt antigen (PSA) , den nuværende standardbiomarkør for prostatacancer , har lav diagnostisk specificitet: PSA-niveauer kan ikke altid skelnes mellem ondartede og godartede kræftformer, så en mere specifik biomarkør er nødvendig. Anvendelsen af sekretomanalyse af prostatacellelinjer i en undersøgelse afslørede adskillige proteiner til stede i større mængder i serum hos cancerpatienter end hos raske mennesker [6] .
Der er også et stort behov for biomarkører til at opdage brystkræft: på nuværende tidspunkt er der kun biomarkører til at overvåge de fremskredne stadier af denne type kræft [2] . Sekretomanalyse af brystkræftcellelinjer førte til opdagelsen af leukocytcelleadhæsionsaktiverende protein (ALCAM) , en ny biomarkør med lovende diagnostisk potentiale [6] .
Analyse af humane embryonale sekretomer kan være nyttige i søgningen efter ikke-invasive metoder til bestemmelse af embryoners levedygtighed . IVF evalueres efter morfologiske kriterier for at finde embryoner med et højt potentiale for implantation . Søgning ved hjælp af en kvantitativ evalueringsmetode kan hjælpe med at reducere antallet af embryoner, der bruges til IVF, og derved reducere sandsynligheden for flerfoldsgraviditet . For eksempel kan du i en undersøgelse få hemmelige fingeraftryk for mange blastocyster og finde 9 proteiner, der kan være forskellige mellem blastocyster med normale og unormale kromosomtal . Denne metode vil erstatte præimplantationsgenetisk diagnose (PGD) , som involverer biopsi af embryonale celler og kan være skadelig for fosterets udvikling [10] .