Bioortogonale reaktioner er kemiske reaktioner , der kan forekomme i levende systemer uden at forstyrre naturlige biokemiske processer [1] [2] [3] . Funktionelle grupper involveret i bioortogonale reaktioner findes som regel ikke i biomolekyler, reagerer hurtigt og selektivt med hinanden under levende celleforhold og er inerte i forhold til andre forbindelser, der er til stede i kroppen. Udtrykket blev foreslået af Caroline Bertozzi i 2003 [4] . Navnet på reaktionerne er baseret på den figurative betydning af ordet " ortogonal ", det vil sige uafhængig af noget, og angiver den gensidige uafhængighed af strømmen af kunstige og naturlige processer.
På trods af det faktum, at der inden for organisk kemi er blevet opdaget, undersøgt og beskrevet et stort antal kemiske reaktioner, kan praktisk talt ingen af dem udføres i en celle eller organisme for kun at påvirke den forbindelse, der er af interesse for forskeren ( protein , DNA , metabolit osv.). Dette sker, fordi biomolekyler indeholder et stort antal funktionelle grupper, der er meget ens i reaktivitet (hovedsageligt nukleofile ), og reaktionen, hvori den undersøgte forbindelse indgår, vil uundgåeligt påvirke andre molekyler, der indeholder lignende funktionelle grupper, som måske ikke kun ikke opfylder målene i studere, men også forstyrre cellens naturlige arbejde, hvilket gør det umuligt at studere det [5] . Samtidig er udførelse af kemiske reaktioner inde i cellen et nyttigt forskningsværktøj, da det giver dig mulighed for at mærke de undersøgte biomolekyler med fluorescerende , affinitets- og massespektrometriske mærker, som senere vil tillade disse biomolekyler at blive observeret ved passende forskningsmetoder, for eksempel ved hjælp af et fluorescerende mikroskop . Bioortogonale reaktioner er designet til at udfylde dette hul, da de er helt fremmede for cellen, forekommer mellem kunstigt indførte funktionelle grupper og har ringe effekt på cellens funktion [3] .
Brugen af bioortogonal reaktion i praksis udføres normalt i to trin. For det første modificeres forbindelsen under undersøgelse med en bioortogonal funktionel gruppe i cellen. Derefter indføres et mærke med lav molekylvægt indeholdende en komplementær funktionel gruppe i systemet, og som et resultat af en bioortogonal reaktion sker der en selektiv modifikation (mærkning) af denne forbindelse [3] [5] . Efterfølgende giver den introducerede etiket dig mulighed for at overvåge det modificerede substrat.
Bioortogonale reaktioner har nu gjort det muligt at studere forskellige biomolekyler , såsom glycaner , proteiner [6] og lipider [7] i realtid i levende systemer i fravær af cytotoksicitet . Der er udviklet adskillige kemiske reaktioner, der opfylder kravene til bioortogonalitet, blandt dem 1,3-dipolær cycloaddition azider til cyclooctyner (også kaldet kobberfri klikreaktion ) [8] , nitroner til cyclooctyner [9 ] ] , dannelse af oximer eller hydrazoner fra carbonylforbindelser [10] , reaktion af tetraziner med cyclooctener [11] , klikreaktion af isonitriler og quadricyclan- ligering [13] .
Den første observation af selektiv kovalent modifikation ved hjælp af en kemisk reaktion under celleforhold dukkede op i arbejdet af R. Qian et al., der brugte fluorescein med to arsinfunktionelle grupper til selektivt at modificere et protein, hvori et tetracysteinfragment , som praktisk talt er fraværende i pattedyrsproteiner , blev tidligere introduceret [14] . Denne tilgang gjorde det muligt at indføre et lille fluorescerende mærke i proteinet, mens datidens standardmetode var at opnå hybrider med grønt fluorescerende protein eller dets analoger [15] , som er meget større og som følge heraf nogle gange interfererer med den normale funktion af det undersøgte protein.
Denne tilgang fik kemikere til at lede efter kemiske reaktioner og funktionelle grupper, der er helt fremmede for naturlige forbindelser, og biologer til at opfinde måder at introducere bioortogonale funktioner i biomolekyler. Det første skridt var erkendelsen af, at biomolekyler hovedsageligt indeholder nukleofile grupper, mens elektrofile grupper er meget mindre almindelige i dem. For eksempel forekommer ketoner og aldehyder ikke i proteiner, mens de samtidig udviser reaktivitet over for hydrazid- og hydroxyamingrupper, som heller ikke forekommer i biomolekyler. På grund af dette blev modifikationen af glycaner og proteiner gennem metabolisk indførte ketonholdige sukkerarter og aminosyrer mulig i cellen i slutningen af 1990'erne. Ketoner og aldehyder var imidlertid til stede i lavmolekylære metabolitter (sukker, pyruvat , pyridoxalfosfat osv.), det vil sige, at de ikke var fuldstændig bioortogonale [16] .
Efterfølgende søgte kemikere efter bioortogonale reaktioner, der opstod mellem helt unaturlige funktionelle grupper. Staudinger-reaktionen var den første kemiske reaktion, der var tilpasset til at udføre modifikationer inde i cellen. Azidgruppen, der indgår i denne reaktion, tilhører de bløde elektrofiler, som ikke er i stand til at reagere med de hårde nukleofiler, der er mest almindelige i naturen. Partneren for azid var phosphin, en blød nukleofil foreslået af G. Staudinger i 1919 [17] . I 2000 blev Staudinger-reaktionen modificeret af C. Bertozzi og anvendt som bioorthogonal Staudinger-ligering til mærkning af en lang række biomolekyler både i levende celler og hele organismer [18] .
Samtidig begyndte klikkemi at udvikle sig - et kemisk koncept, der beskriver fremstillingen af biblioteker af organiske forbindelser ved hjælp af hurtige og pålidelige reaktioner, der gør det muligt at samle molekyler fra små byggesten [19] . Blandt flere reaktioner, der opfylder dette koncept, har den kobberkatalyserede azid-alkyn-cycloaddition fundet den bredeste anvendelse til in vitro -modifikation af biomolekyler [20] . På grund af kobberkatalysatorens toksicitet kunne en sådan reaktion imidlertid ikke anvendes i levende celler eller organismer. C. Bertozzis gruppe skabte en ikke-katalytisk variant af denne reaktion, kendt som stress-faciliteret azid-alkyn cycloaddition (SPAAC), som er en lovende bioortogonal reaktion [8] .
I øjeblikket fortsætter søgningen efter nye bioortogonale reaktioner for at kunne udføre parallel modifikation af substrater i det samme biologiske system.
I det ideelle tilfælde bør den bioortogonale reaktion opfylde følgende særlige betingelser [3] [4] :
Denne reaktion blev udviklet af C. Bertozzis gruppe i 2000 på basis af den klassiske Staudinger-reaktion mellem azider og triarylfosfiner [18] . Denne reaktion blev forfaderen til området for bioortogonal kemi, da grupperne, der reagerer i det (azider, fosfiner) ikke er til stede i biomolekyler, men nu bruges det ikke så bredt. Staudinger ligering er blevet brugt til at modificere biomolekyler i både levende celler og mus [4] .
I Staudinger-reaktionen fungerer azidgruppen som en blød elektrofil , der reagerer med bløde nukleofiler såsom fosfiner . De fleste biologiske nukleofiler er derimod stive nukleofiler, der ikke reagerer med azider. Derudover forløber Staudinger-ligering i et vandigt medium med dannelsen af et stabilt produkt [18] .
Fosfiner er fraværende i naturlige biomolekyler [21] og genopretter ikke disulfidbindinger .
Ved at bruge eksemplet med lægemidler ( azidothymidin ) har azider vist sig at være biokompatible . Den lille størrelse af azidgruppen gør det nemt at introducere det i biomolekyler via metaboliske veje [8] .
Grundlaget for Staudinger-reaktionen er det nukleofile angreb af phosphin på det terminale nitrogenatom i azidgruppen til dannelse af phosphazid 1 . Derefter omdannes phosphazid 1 til iminophosphoran 3 ledsaget af nitrogenfrigivelse, hvorefter hydrolysen af iminophosphoran sker med dannelse af amin og phosphinoxid. Til anvendelser inden for biokonjugation blev reaktionen modificeret ved at indføre en estergruppe i ortho - stillingen af en af phosphinens arylsubstituenter. Som et resultat af angrebet af den resulterende iminophosphoran 3 på denne gruppe, dannes et bicyklisk produkt 4 , hvis hydrolyse fører til dannelsen af en stabil amidbinding mellem substratet og det indførte mærke. Det hastighedsbegrænsende trin i reaktionen er angrebet af azidgruppen af phosphinmolekylet [22] .
Den største ulempe ved denne reaktion er, at fosfiner langsomt oxideres af oxygen i levende systemer. Derudover metaboliseres de sandsynligvis af cytochrome P450 [4] . Ligering ifølge Staudinger forløber ret langsomt, ifølge andenordens kinetik, med en hastighedskonstant på omkring 0,0020 M −1 s −1 [4] . Forsøg på at accelerere det nukleofile angreb ved at indføre elektrondonerende grupper i arylsubstituenter accelererer reaktionen, men phosphinoxidationshastigheden øges også.
Den langsomme reaktionshastighed kræver en stigning i koncentrationen af anvendt phosphin, hvilket øger baggrundssignalet produceret af det overskydende mærke. Der blev gjort en indsats for at overvinde dette problem: Der blev syntetiseret fluorogene fosfiner baseret på fluorescein [23] og cumarin [24] , hvis virkning er baseret på fluorescensopbygningen først efter inkorporering i biomolekylet, hvilket gjorde det muligt at opnå en større spring i strålingsintensiteten som følge af reaktionen. På nuværende tidspunkt forbliver reaktionens kinetik en alvorlig hindring for dens udbredte anvendelse.
Kobberfri azid-alkyn cycloaddition er en bioortogonal reaktion udviklet af C. Bertozzi som en aktiveret version af Huisgen-reaktionen . I modsætning til kobber-katalyseret azid-alkyn-cycloaddition ( CuAAC , Cu-katalyseret azid-alkyn-cycloaddition) forløber denne variant af reaktionen med en højere hastighed på grund af fjernelse af vinkelspændingen i cyclooctyn-molekylet under dannelsen af additionsproduktet. Derfor blev denne reaktion kendt som strain-promoted azid-alkyne cycloaddition ( SPAC ). Denne modifikation gør det muligt at undgå brugen af en giftig kobberkatalysator og anvende en kobberfri reaktion i levende celler og organismer.
Den klassiske kobberkatalyserede azid-alkyn-cycloaddition er en meget hurtig og effektiv biokonjugationsreaktion , men den kan ikke bruges i levende celler på grund af toksiciteten af Cu + -ioner . Toksiciteten tilskrives dannelsen af reaktive oxygenarter genereret af kobberkatalysatorer.
Ligander er blevet optimeret til at forhindre skadelige effekter på biomolekyler, dog har det vist sig, at forskellige ligandmiljøer i komplekser også påvirker stofskiftet, da de introducerer uønskede ændringer i cellulære processer [25] .
Azidgruppen er bioortogonal, da den er ret lille (den har ringe effekt på molekylets indtrængning i cellen), metabolisk stabil og forekommer ikke i native biomolekyler. Selvom azider ikke er de mest reaktive forbindelser i 1,3-dipolær addition, foretrækkes de på grund af fraværet af sidereaktioner under modifikationsbetingelserne [26] . Cyclooctyne-fragmentet er større, men det har den ortogonalitet og stabilitet, der kræves til in vivo- modifikation . Cyklooktiner er de mindste stabile cykliske alkyner . Den beregnede vinkelspænding i deres cyklusser er 19,9 kcal/mol [27] .
Reaktionen forløber som en standard 1,3-dipolær cycloaddition med et matchet pericyklisk elektronskift. Den ambivalente natur af 1,3-dipolen gør det umuligt at bestemme det elektrofile og nukleofile centrum i azidet, så billedet af elektronovergangsretningen er meningsløst. Beregninger viser dog, at det indre nitrogenatom bærer den største negative ladning [28] .
Den kobberløse azid-alkyn-cycloaddition er blevet tilpasset til at bruge nitroner i stedet for azider . I dette tilfælde dannes N -substituerede isoxazoliner som reaktionsprodukter . Reaktionshastigheden stiger i et vandigt medium og adlyder andenordens kinetik med en konstant fra 12 til 32 M – 1 s – 1 afhængigt af substituenterne i nitronen. På trods af den høje reaktionshastighed er dens ulempe vanskeligheden ved at indføre nitronen i biomolekylet ved metabolisk mærkning. Reaktionen blev brugt til modelpeptidmodifikation og proteinpegylering [ 9 ] .
I 2009 blev der udviklet en dipolær cycloadditionsreaktion af nitriloxider til norbornen . Det er især blevet anvendt til den postsyntetiske modifikation af oligonukleotider . Norbornen blev valgt som dipolarofil på grund af balancen mellem stressfremmet reaktivitet og stabilitet. Ulemperne ved denne reaktion er den høje elektrofilicitet af nitriloxid, som fører til sidereaktioner, samt den lave reaktionshastighed [29] .
Cycloadditionsreaktionen af oxanorbornadien med azider fortsætter med efterfølgende eliminering af furan ved retro-Diels-Alder-reaktionen. Ringstammen og elektronudtømningen af oxanorbornadien øger dens reaktivitet i det begrænsende trin af cycloaddition. Furanspaltning sker hurtigt med dannelsen af stabil 1,2,3- triazol [30] . Foreløbige undersøgelser har vist nytten af denne reaktion i modifikationen af peptider , og den er også blevet brugt til at skabe billeddannende forbindelser i SPECT [31] .
Cycloadditionen af s - tetraziner og ( E )-cyclooctener forløber som en Diels-Alder-reaktion , efterfulgt af en retro-Diels-Alder-reaktion med frigivelse af nitrogen. Reaktionen forløber meget hurtigt med en andenordens hastighedskonstant på 2000 M – 1 s– 1 (9:1 i methanol - vand -systemet ), hvilket gør det muligt at modificere biomolekyler i meget lave koncentrationer.
Beregningen viste, at spændingsenergien i ( Z )-cyclooctener er 7,0 kcal/mol, hvilket er mindre end i cyclooctan (12,4 kcal/mol), på grund af tab af to transannulære interaktioner. Tværtimod øger ( E )-konfigurationen af dobbeltbindingen ringspændingen (17,9 kcal/mol), hvilket har en positiv effekt på reaktionshastigheden [32] . Som dienofil anvendes 3,6-diaryl- s - tetrazin, som indeholder substituenter til at undertrykke interaktion med vand. Frigivelsen af nitrogen i andet trin gør reaktionen irreversibel [33] .
Vand har vist sig at accelerere reaktionen mellem tetraziner og cyclooctener. Norbornener blev også brugt som dienofiler, men reaktionen forløb meget langsommere (1 M – 1 s – 1 i et vandigt medium). Reaktionen af tetraziner med ( E )-cycloocten blev brugt til at mærke levende celler med et fluorescerende mærke [34] og til at kombinere polymerer [35] .
Klikreaktionen af isonitriler er en [4+1]-cycloaddition efterfulgt af en retro-Diels-Alder-reaktion for at frigive N 2 . Af denne grund er reaktionen irreversibel. Produktet er stabilt, hvis der anvendes tertiær isonitril. Ved primære og sekundære isonitriler dannes en imin, som derefter hurtigt hydrolyseres (vist med rødt i diagrammet).
Isonitril er en god bioortogonal gruppe på grund af dens lille størrelse, stabilitet, ikke-toksicitet og fravær fra biologiske systemer. [4+1]-cycloadditionsreaktionen forløber dog langsomt med en andenordens hastighedskonstant på 10–2 M – 1 s– 1 .
Tetrazol kan gennemgå en fotoinduceret cykloelimineringsreaktion med nitrogenfrigivelse. I dette tilfælde dannes en kortvarig 1,3 - dipol , som indgår i en 1,3-dipolær cycloaddition med alkener , hvilket fører til pyrazolinaddukter [36] .
Fotoinduktion fortsætter med kortvarig eksponering for lys (bølgelængde afhænger af tetrazol). Eksponeringstiden vælges således, at skaden forårsaget af lys på cellerne reduceres. Reaktionen accelererer i et vandigt medium og giver en enkelt regioisomer . Fordelene ved denne tilgang ligger i muligheden for rumlig og tidsmæssig kontrol over reaktionen. Brugen af reaktionen forenkles også ved, at alkener eller tetrazoler kan indføres i biomolekyler ved hjælp af simple biologiske metoder. Derudover er der skabt en fluorogen tetrazol, som gør det muligt at overvåge graden af reaktionen i tide [37] .
Under quadricyclan-ligering går den anstrengte quadricyclan ind i [2+2+2]-cycloaddition med π-systemer. Quadricyclan forekommer ikke i native biomolekyler, reagerer ikke med dem (på grund af mætning af molekylet), har en relativt lille størrelse og stærk spænding (≈ 80 kcal/mol). Det er dog meget stabilt ved stuetemperatur og i vandmiljøer ved fysiologisk pH. Det er i stand til at reagere selektivt med elektronmangelfulde π-systemer, men ikke med simple alkener , alkyner eller cyclooktyner [13] .
Bis(dithiobenzyl)nikkel(II) blev valgt som det andet reagens som et resultat af screening for reaktivitet. For at forhindre fotoinduceret inversion til norbornadien tilsættes diethyldithiocarbamat til reaktionen, som chelaterer nikkelen i det resulterende produkt. Reaktionen forløber med en andenordens hastighedskonstant på 0,25 M −1 s −1 (i et vandigt medium).
Med brugen af denne reaktion, såvel som kobberfri azid-alkyn-cycloaddition og reaktionen af oximdannelse , blev der skabt en metode til samtidig mærkning af tre substrater uden gensidig indblanding af disse tre reaktioner [13] .
Adskillige bioortogonale reaktioner, hovedsageligt Staudinger-ligationen og den kobberfrie azid-alkyn-cycloaddition, er meget udbredt inden for biokonjugation og kemisk biologi .
Cellulære proteinsyntesesystemer såvel som enzymer kan introducere ikke-naturlige aminosyrer i proteinstrukturer og forveksle dem med naturlige. Det viste sig især, at udskiftningen af methionin i bakteriers næringsmedium med homopropargylglycin (Hpg ) eller azidohomoalanin ( Aha ) gjorde det muligt at integrere disse syntetiske aminosyrer i proteiner syntetiseret af cellen. Sådanne proteiner indeholdt bioortogonale funktionelle grupper, azid eller alkyn, og introduktionen af biotin og fluorescerende farvestoffer udstyret med en komplementær funktionel gruppe (phosphin, cyclooctyne eller azid) i cellen gjorde det muligt at selektivt mærke og studere disse proteiner. Derudover er azidohomoalanin og homopropargylglycin blevet brugt samtidigt til at modificere to forskellige typer proteiner parallelt [38] .
Bioortogonal kemi har også fundet anvendelse i aktivitetsprofilering af proteiner studere proteiner, der har en affinitet til en bestemt ligand . For at gøre dette mærkes liganden med en bioortogonal funktionel gruppe og indføres i cellen. Efter at bindingen af proteiner til liganden er sket, ødelægges cellen, og alle proteiner indføres i reaktionen med et mærke, der indeholder en komplementær reaktiv gruppe. I dette tilfælde indføres mærket kun i liganden og gør det muligt kun at skelne og isolere de proteiner, der er forbundet med denne ligand [39] .
Glykaner kodes ikke direkte genetisk og har ikke den specifikke aktivitet af proteiner; derfor er metoder til genetisk eller affinitetsmærkning ikke anvendelige på dem. Glykaner kan dog modificeres metabolisk med modificerede syntetiske kulhydrater ( sialinsyre , N -acetylgalactosamin, N -acetylglucosamin osv.) indeholdende azidgrupper. Glykaner med indlejrede azidgrupper blev indført i Staudinger-ligering med et biotinreagens og undersøgt ved flowcytometri [18] .