ADP-ribosylering ( ADP-ribosylering ) er en kemisk reaktion ved at tilføje en eller flere ADP-riboserester til et protein [1] [2] . Det er en reversibel post-translationel modifikation , der spiller en vigtig rolle i mange cellulære processer såsom signaltransduktion , DNA-reparation , regulering af genekspression og apoptose [3] [4] . Forkert ADP-ribosylering er blevet observeret i nogle former for cancer [5] . Mange bakterielle toksiner , såsom koleratoksin og difteritoksin , påvirker ADP-ribosylering [6] .
De første antagelser om eksistensen af en sådan post-translationel modifikation af proteiner som ADP-ribosylering dukkede op i 1960'erne. I løbet af denne tid opdagede Pierre Chambon og samarbejdspartnere, at ATP blev optaget af ekstraktet af kyllingekerner [ 7] . Efterfølgende undersøgelser viste, at ADP-ribose, et derivat af NAD + , gik ind i reaktionen . Et par år senere blev et enzym identificeret , der binder ADP-ribose til proteiner, det blev kaldt poly (ADP-ribose) polymerase . Først mente man poly-(ADP-ribose) at være en lineær kæde af ADP-ribose-rester forbundet med glykosidbindinger . Senere blev det vist, at for hver 20.-30. rest kan kæden forgrene sig [8] .
Mono-ADP-ribosylering blev beskrevet et par år senere, da det blev fundet, at NAD + var påkrævet for at difteritoksin var aktivt . Toksinet aktiveres, når en rest af ADP-ribose bindes til det af enzymet mono-ADP-ribosyltransferase. Oprindeligt mente man, at poly-ADP-ribosylering kun var involveret i reguleringen af genekspression. Efterhånden som nye enzymer, der udfører ADP-ribosylering, blev fundet, blev den alsidige funktionelle betydning af denne modifikation imidlertid tydelig. Selvom det første kendte pattedyrsenzym, der er i stand til at udføre poly-ADP-ribosylering, blev opdaget i slutningen af 1980'erne, blev de næste pattedyrsproteiner med en sådan aktivitet først beskrevet 15 år senere [9] . I slutningen af 1980'erne blev enzymerne ADP-ribosylcyclase også opdaget, som katalyserer tilsætningen af cyklisk ADP-ribose til proteiner. Det viste sig, at proteiner af sirtuin -familien , som kan katalysere NAD + -afhængig deacetylering , også har mono-ADP-ribosyltransferaseaktivitet [10] [11] .
Som regel tjener NAD + som en kilde til ADP-riboserester . I denne overførselsreaktion brydes den N-glykosidbinding i NAD + , der binder ADP-ribose til nikotinamidgruppen , hvorefter sidegruppen af den modificerede aminosyre udfører et nukleofilt angreb. ADP-ribosyltransferaser katalyserer to typer reaktioner: mono-ADP-ribosylering og poly-ADP-ribosylering.
Mono-ADP-ribosyltransferaser katalyserer oftest tilføjelsen af en enkelt ADP-riboserest til argininsidekæden via et specifikt motiv (RS-EXE). Først brydes bindingen mellem ADP-ribose og nikotinamid med dannelsen af en oxoniumion . Det modificerede proteins argininsidekæde fungerer derefter som en nukleofil og angriber det elektrofile carbonatom ved siden af oxoniumionen . Forud for nukleofilt angreb deprotoneres arginin enzymet glutamatrest . En anden konservativ glutamatrest danner en hydrogenbinding med en af ribose - hydroxylgrupperne , hvilket letter det nukleofile angreb. Som et resultat af brud på bindingen frigives nikotinamid. Modifikationen kan fjernes med ADP-ribosylhydrolase-enzymer, som bryder N-glykosidbindingen mellem arginin og ribose, hvorved ADP-ribose og umodificeret protein frigives. NAD + dannes dog ikke i den omvendte reaktion [12] .
Poly(ADP-ribose)polymeraser ( Eng. Poly-(ADP-ribose) polymeraser, PARP ) findes overvejende i eukaryoter og katalyserer tilføjelsen af adskillige ADP-riboserester til et protein. Som med mono-ADP-ribosylering er kilden til ADP-ribose NAD + . PARP'er bruger den katalytiske His - Tyr -Glu- triade til at øge bindingen til NAD + og binde den samlede poly-ADP-ribosekæde til proteinet. Glutamatresten letter dannelsen af en O-glykosidbinding mellem to riboserester [13] . Der er flere andre enzymer, der genkender poly-ADP-ribosekæder, hydrolyserer dem eller danner forgreninger. Motiver, der kan binde til poly-ADP-ribose med varierende styrke, er fundet i mere end 800 proteiner. Derfor ændrer poly-ADP-ribosylering ikke kun strukturen og konformationen af proteinet, men kan også tiltrække andre proteiner til det [14] .
Sidekæder af mange aminosyrer kan fungere som acceptorer for ADP-ribosegruppen. Fra et kemisk synspunkt er poly-ADP-ribosylering en glycosylering : det nukleofile angreb, der er nødvendigt for at danne en binding med ribose i ADP-ribose, kan udføres af oxygen- , nitrogen- eller svovlatomerne i aminosyrernes sidekæder [15] . Oprindeligt blev det antaget, at målene for ADP-glycosylering var glutamat- og aspartatrester . Senere blev det dog vist, at serin [16] [17] , arginin [18] , cystein [19] , lysin [20] , diphtamid [21] , phosphoserin [22] og asparaginrester også kan gennemgår ADP-ribosylering [23] .
PARP'er aktiveres under DNA- skade eller cellulær stress, hvilket øger mængden af poly-ADP-ribose og mindsker mængden af NAD + [24] . I mere end 10 år blev det antaget, at den eneste poly-ADP-polymerase i pattedyrsceller er PARP1 , derfor er dette enzym det bedst undersøgte af alle poly-ADP-polymeraser. Under apoptose skærer aktiverede caspaser PARP1 i to fragmenter, hvilket inaktiverer enzymet fuldstændigt og begrænser derved dannelsen af poly-ADP-ribose. Et af de resulterende fragmenter bevæger sig fra kernen til cytoplasmaet og bliver, som det almindeligvis antages, et selvantigen . I en anden form for programmeret celledød , parthanatosis , er der en ophobning af poly-ADP-ribose forårsaget af aktivering af PARP eller inaktivering af poly(ADP-ribose) glycohydrolase - et enzym, der hydrolyserer poly- ADP-ribose med dannelse af frie ADP-riboser. Under apoptose får poly-ADP-ribose proteiner til at bevæge sig ind i kernen, hvilket udløser DNA-fragmentering . Hyperaktivering af PARP fører til nekrotisk celledød reguleret af tumornekrosefaktor . Ved en endnu uklar mekanisme påvirker PARP-hæmmere nekroptose 25] .
ADP-ribosylering kan påvirke genekspression ved næsten hvert trin, herunder gennem kromatinorganisation , transkriptionsfaktorbinding og mRNA - behandling . PARP1 kan påvirke kromatinstrukturen ved at introducere post-translationelle modifikationer til histonhaler . PARP'er kan også påvirke strukturen af transkriptionsfaktorer og deres interaktioner med hinanden og med promotorer . For eksempel påvirker mono-ADP-ribosyltransferase PARP14 binding til promotoren af transkriptionsfaktoren STAT . Andre ADP-ribosyltransferaser modificerer proteiner, der interagerer med mRNA, hvilket kan føre til silencing af de tilsvarende gener [26] .
PARP'er kan være involveret i reparationen af enkelt- og dobbeltstrengede brud i DNA. For eksempel binder PARP1 til DNA på stedet for et enkeltstrengsbrud og begynder at syntetisere poly-ADP-ribose, som interagerer med XRCC1 -proteinet . Det rekrutterer til brudstedet andre proteiner, der er involveret i reparation: polynukleotidkinase , som behandler DNA-ender under baseudskæringsreparation , og aprataxin , som er involveret i reparation af enkeltstrengede brud og ikke-homolog endesammenføjning [27] .
PARP1 er også involveret i reparation af dobbeltstrengsbrud, for eksempel ved ikke-homolog endesamling. Det bremser sandsynligvis også replikationsgaffelens bevægelse efter DNA-skade og fremmer homolog rekombination . Muligvis er PARP1 involveret i reparationen af dobbeltstrengsbrud sammen med PARP3 . Der er to hypoteser om arten af deres fælles handling. For det første kan de funktionelt erstatte hinanden, når den anden poly-ADP-ribosyltransferase går tabt. Ifølge en anden hypotese udfører PARP3 mono-ADP-ribosylering eller syntetiserer korte kæder fra poly-ADP-riboserester og aktiverer også PARP1, som fuldender dem til lange kæder [28] .
Den vigtigste molekylære mekanisme for intracellulær ødelæggelse af defekte proteiner er ubiquitin , proteasomsystemet . ADP-ribosyltransferase tankyrase (TNKS) interagerer med proteasomregulatoren PI31 . Som det er blevet vist i Drosophila og humane celler , letter ankyrindomænet af TNKS interaktion med det N-terminale bindingsmotiv og det C-terminale HbYX-domæne af PI31-proteinet. Denne interaktion fremmer ADP-ribosylering af PI31 PARP- domænet af tankyrase. Derudover forstyrrer behandling af Drosophila-celler med TNKS -hæmmeren kendt som XAV939 funktionen af 26S -underenheden af proteasomet. Desuden kan poly-ADP-ribosyleret PI31 ikke længere hæmme aktiviteten af a-underenhederne af 20S-proteasomunderenheden. Således påvirker poly-ADP-ribosylering af PI31, medieret af tankyrase, proteasomets funktion [29] .
Som diskuteret ovenfor er PARP1 involveret i reparationen af enkelt- og dobbeltstrengede DNA-brud og regulerer også apoptose. Af denne grund er celler med reduceret PARP1-aktivitet tilbøjelige til malignitet . Mange andre PARP'er forstyrrer også dannelsen af kræftceller. PARP2 er involveret i DNA-reparation, PARP3 regulerer centrosomduplikation , og tankyrase er involveret i reguleringen af telomerlængden . På samme tid er fuldstændig hæmning af PARP en af de aktuelt anvendte tilgange til behandling af cancer , da celler, der er frataget mindst én af PARP, hurtigt dør. For eksempel forårsager hæmning af PARP1 i kræftceller deres død på grund af flere DNA-skader. PARP14 er sandsynligvis relateret til graden af aggressivitet af B-celle lymfomer [5] .
Bakterielle ADP-ribosylerende exotoksiner udfører kovalent binding af ADP-ribose-resten med NAD + til proteinet i den inficerede eukaryote organisme. For eksempel ribosylerer koleratoksin og et af enterotoksinerne ADP α-underenheden af heterotrimere G-proteiner . I den ADP-ribosylerede tilstand er α-underenheden konstant aktiv og forbundet med GTP , derfor syntetiseres cAMP konstant i cellen , hvilket stimulerer frigivelsen af vand og ioner fra cellerne i tarmepitelet . Clostridium botulinum C3-toksin ADP-ribosylerer GTP-bindende proteiner Rho og Ras , pertussis-toksin udfører også ADP-ribosylering af G-proteiner . Ved difteri er translationsforlængelsen EF -2 ADP-ribosyleret , hvilket interfererer med proteinsyntesen [6] . Ud over disse bakterier udskilles ADP-ribosylerende toksiner af Pseudomonas aeruginosa -celler ( exotoxin A ) [30] .