Systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse ( engelsk SELEX fra Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment ) er en kombinatorisk kemimetode, der bruges i molekylærbiologi til at opnå oligonukleotider ( korte enkeltstrengede RNA eller DNA - molekyler ), der specifikt binder til en specifik ligand ligander). Sådanne oligonukleotider kaldes aptamerer [1] [2] [3] . Oftest kaldes denne metode SELEX, men der er også forkortelser SAAB (fra engelske selected and amplified binding site - selected and amplified binding site ) og CASTing (fra engelsk. cyclic amplification and selection of targets - cyclic amplification and selection of mål) [4] [5] . SELEX blev udviklet i 1990. I 2015 viede Journal of Molecular Evolution et særligt nummer til denne metode i forbindelse med 25-årsdagen for dens opfindelse [6] .
Processen begynder med syntesen af et meget stort bibliotek af -oligonukleotider, bestående af tilfældige sekvenser med fast længde med konstante 5'- og 3'-regioner, der tjener som primer -annealingssteder (dvs. komplementær binding af primere til template). Yderligere interagerer oligonukleotiderne inkluderet i biblioteket med liganden af interesse for forskeren (oftest et protein eller en lille organisk forbindelse ). De oligonukleotider, der ikke kunne binde til liganden, fjernes ved hjælp af affinitetskromatografi eller magnetiske perler [7] . Oligonukleotider bundet til liganden elueres, amplificeres ved polymerasekædereaktion (PCR) og udsættes for efterfølgende selektionsrunder for at udvælge molekyler med den højeste affinitet for liganden [2] [3] .
SELEX-metoden er allerede med succes blevet brugt til at udvikle en række aptamerer til kliniske og forskningsmæssige formål [8] . SELEX er også blevet brugt til at generere aptamerer med nukleotider, der indeholder kemisk modificerede sukkerarter eller nitrogenholdige baser . Modificerede nukleotider kan give aptamerer yderligere bindingsevner og også øge deres stabilitet [9] .
Det første trin i SELEX er skabelsen af et stort bibliotek af oligonukleotider med en fast længde, men helt eller delvist tilfældige sekvenser. Imidlertid skal regioner med en variabel sekvens flankeres af regioner med en fast sekvens for at blive amplificeret ved PCR. Oligonukleotider fremstilles indledningsvis ved kemisk syntese og amplificeres derefter ved PCR, således at hver tilfældig sekvens er til stede i flere kopier i biblioteket. I tilfælde af RNA-aptamerer udføres in vitro - transkription af tilfældige sekvenser. Det høje kopiantal af hver tilfældig sekvens reducerer sandsynligheden for, at et potentielt bindingssted vil gå tabt på grund af stokastiske årsager. For at oligonukleotider skal kunne erhverve en nativ rumlig struktur, omdannes de til en enkeltstrenget form og først derefter inkuberes de med målliganden [2] [3] [10] .
Umiddelbart før tilsætning af oligonukleotiderne til liganden opvarmes biblioteket af enkeltstrengede oligonukleotider og afkøles langsomt, så de får en termodynamisk stabil sekundær og tertiær struktur [3] [7] . Det tilfældige sekvensbibliotek (randomiseret bibliotek) inkuberes derefter med den immobiliserede målligand for at tillade aptamererne at binde til den. Protokollerne til inkubering af et bibliotek med en ligand kan variere, især forskellige fremgangsmåder til immobilisering af ligander, adskillelse af ubundne oligonukleotider, forskellige inkubationstider og temperaturer , inkubationsbuffere og koncentrationsforhold af oligonukleotider og ligander kan anvendes. Ligander immobiliseres på affinitetskromatografisøjler [3] , nitrocellulosefiltre [ 2] eller magnetiske perler [7] . Der er også udviklet en variant af SELEX, der bruger hele cellen som ligand . I dette tilfælde sker inkubationen af oligonukleotidbiblioteket direkte i kulturskålene, hvori cellerne vokser [11] . Sammensætningen af bufferen, hvori inkubationen finder sted, afhænger af ligandens egenskaber og kravene til vellykket udvalgte aptamerer. For eksempel, hvis liganden er et negativt ladet lille molekyle eller protein, anvendes højsaltbuffere til at fremme binding af aptameren til liganden. Hvis det er nødvendigt at opnå en aptamer, der binder til et protein in vivo eller til en hel celle, som er planlagt til at blive brugt til diagnostiske eller terapeutiske formål, så bruges buffere til inkubation, som er tæt på blodplasma i saltkoncentrationer , og selve processen udføres ved fysiologiske temperaturer for at de udvalgte aptamerer med størst sandsynlighed ville binde til liganden præcist in vivo . Inkubationsbuffere kan også indeholde ikke-specifikke konkurrenter. Hvis der er stor sandsynlighed for, at oligonukleotider, der ikke binder til liganden, alligevel vil forblive i reaktionsblandingen på grund af uspecifik binding til skabelonen, så vil ikke-specifikke konkurrenter (små molekyler eller polymerer, der i egenskaber ligner biblioteksoligonukleotider) forhindre uspecifik tilbageholdelse af uegnede aptamerer i reaktionsblandingen [11] . Egenskaberne af udvalgte aptamerer kan også afhænge af forholdet mellem ligand- og oligonukleotidkoncentrationer. Hvis forskeren ikke står over for opgaven med at opnå aptamerer med en meget stærk affinitet for liganden, så er det værd at bruge et overskud af liganden for at øge sandsynligheden for, at i det mindste nogle oligonukleotider vil være i stand til at binde sig til den. Men hvis der tværtimod kræves en meget specifik aptamer, der binder stærkt til liganden, bør oligonukleotider tages i overskud. Dette vil skabe konkurrence mellem aptamerer og betingelser for udvælgelsen af de bedst egnede af dem [2] .
Efter at biblioteket af oligonukleotider er blevet inkuberet med liganden i tilstrækkelig tid, vaskes de ubundne oligonukleotider væk, mens de bundne forbliver bundet til den immobiliserede ligand [3] . Når de ubundne sekvenser fjernes, er det nødvendigt at eluere de bundne aptamerer ved at bryde dens binding med den immobiliserede ligand. Til eluering skabes denaturerende forhold, hvorunder aptamererne mister deres rumlige struktur, mister deres bindinger med liganden og vaskes ud med deioniseret vand [3] . Denaturerende betingelser skabes af opløsninger indeholdende urinstof eller EDTA [11] [12] såvel som ved høj temperatur eller fysisk påvirkning. Efter eluering udsættes de frigivne oligonukleotider for omvendt transkription , hvis de er RNA, eller hvis der skal indføres modificerede nukleotider [2] [3] [11] , og DNA-nukleotiderne samles ganske enkelt til yderligere amplifikation [13] . De opnåede DNA-fragmenter amplificeres yderligere ved PCR og omdannes til enkeltstrenget DNA (ssDNA), RNA eller base-modificeret oligonukleotid, som vil blive brugt til næste selektionsrunde [2] [3] .
Det næste trin i SELEX er at opnå ssDNA, som vil blive brugt til yderligere amplifikation ved PCR. En af de enkleste måder at opnå ssDNA på er at bruge biotinylerede reverse primere til PCR, på grund af hvilke de syntetiserede komplementære DNA-strenge vil bære biotin. Ved hjælp af biotin kan de fastgøres til harpiksen, og den anden streng af dupleksen kan elueres med en alkaliopløsning . En anden metode til at opnå ssDNA er asymmetrisk PCR , hvor den fremadrettede primer tages i overskud, og den omvendte primer tages i en meget lille mængde, på grund af hvilken flere enkeltstrengede fragmenter syntetiseres. En ulempe ved asymmetrisk PCR er, at efter PCR skal det enkeltstrengede produkt renses for dobbeltstrenget DNA og andre uvedkommende fragmenter. Unødvendige kæder kan ødelægges enzymatisk , efter at have markeret dem på forhånd, så det genkendes for eksempel af lambda exonuclease . Enzymer vil ødelægge den unødvendige streng, og mål-ssDNA'et vil forblive intakt [2] [3] .
For at øge specificiteten af aptamerer udvalgt ved hjælp af SELEX, kan et yderligere trin, negativ selektion, indføres umiddelbart før eller umiddelbart efter inkubation. Dette trin er nødvendigt for at fjerne sekvenser fra blandingen, der ikke binder til liganden, men til matrixen, hvorpå den er immobiliseret [12] [14] [13] . Negativ selektion består i at tilføje ligandanaloger, ikke-specifikke proteiner og andre molekyler til blandingen, som opsamler alle ikke-specifikke oligonukleotider [11] [13] [15] .
For at overvåge udviklingen af SELEX kan man sammenligne antallet af ligandmolekyler, der interagerer med aptamererne, hvilket er relateret til antallet af eluerede oligonukleotider, med det totale antal oligonukleotider, der teoretisk elueres i hvert trin. Antallet af eluerede oligonukleotider estimeres ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 260 nm eller ved at anvende fluorescensmærkede oligonukleotider. Når SELEX-processen slutter, når andelen af oligonukleotider, der binder til aptameren, 100 %, og antallet af eluerede oligonukleotider bliver lig med (eller lidt mindre end) størrelsen af det bibliotek, der blev brugt i inkubationen [3] [16 ] ] .
I øjeblikket bruger SELEX kemisk modificerede nukleotider. Tilstedeværelsen af kemisk modificerede nukleotider i oligonukleotider kan give potentielle aptamerer yderligere fordele, såsom at øge deres stabilitet og resistens over for nukleaser , øge bindingen til specifikke mål, ændre fysiske egenskaber (for eksempel øge hydrofobiciteten ) og øge antallet af mulige rumlige strukturer for et givet oligonukleotid. Nukleotider med unaturlige nitrogenholdige baser er allerede blevet brugt i SELEX, og i nogle tilfælde var det, takket være deres anvendelse, muligt at opnå DNA-aptamerer med høj affinitet for målet [8] [9] [17] .
SELEX blev designet til gennem styret evolution at producere aptamerer med meget høj affinitet for specifikke ligander, herunder små molekyler såsom ATP [18] og adenosin [10] [19] såvel som proteiner (f.eks. prioner [20] og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) [21] ). SELEX bruges til at generere højaffinitetsaptamerer til mere komplekse strukturer såsom tumorceller [22] . Aptamerer udvikles, som specifikt binder tumormarkører [23] , grønt fluorescerende protein og relaterede fluoroforer [24] . FDA har allerede godkendt en VEGF-bindende aptamer kendt som pegaptanib til behandling af makuladegeneration [21] [25] . SELEX er blevet brugt til at producere meget specifikt katalytisk DNA (DNA-zymer). Der kendes adskillige metalspecifikke DNA-vintre [26] , herunder DNA-vintre, der er specifikke for kobber [27] , uran [28] og natrium [29] . Biosensorer baseret på aptamerer er under udvikling [30] ; derudover er de planlagt brugt til fluorescerende mærkning af proteiner [31] og celler [32] samt selektiv hæmning af enzymer [33] .