Western blotting (western blot, protein immunoblot, eng. Western blot ) er en analytisk metode, der bruges til at bestemme specifikke proteiner i en prøve . Det første trin anvender proteinelektroforese i en polyacrylamidgel til at adskille denaturerede polypeptider efter længde (sædvanligvis i nærvær af SDS ) eller tredimensionel struktur af proteinet (i den native tilstand). Derefter overføres proteinerne til en nitrocellulose- eller PVDF - membran, hvorefter de påvises ved hjælp af antistoffer , der er specifikke for et givet protein [1] [2] .
Der er mange kommercielle virksomheder, der specialiserer sig i produktion af antistoffer (både monoklonale og polyklonale ) mod titusindvis af forskellige proteiner [3] .
Western blotting bruges i molekylærbiologi , biokemi , genetik og andre naturvidenskabelige discipliner.
Andre lignende metoder bruger antistoffer til at detektere proteiner i væv og celler gennem immunfarvning og enzym-linked immunosorbent assay ( ELISA ) .
Western blotting blev udviklet i George Starks laboratorium i Stanford . Navnet Western Blot blev givet til teknikken af W. Neal Burnette [4] og er en leg med ord fra navnet Southern Blot , en DNA- detektionsteknik , der tidligere er udviklet af Edwin Southern . En lignende metode til bestemmelse af RNA kaldes northern blotting , påvisningen af post - translationelle proteinmodifikationer kaldes Eastern blotting .
Prøven kan tages fra helvæv eller fra cellekultur. I de fleste tilfælde males hårdt væv først ved hjælp af en blender (til prøver med store volumener), en homogenisator (mindre volumener) eller sonikering . Samtidig er bakterier, vira og andre miljøkomponenter også en kilde til proteiner.
Forskellige detergenter , salte og buffere kan bruges til at forbedre cellelyse og proteinopløsning . Protease- og fosfatasehæmmere tilsættes ofte for at forhindre prøver i at blive fordøjet af deres egne enzymer . Vævsforberedelse udføres ofte ved lave temperaturer for at undgå proteindenaturering .
Kombinationer af biokemiske og mekaniske fraktioneringsteknikker, herunder forskellige typer filtrering og centrifugering , bruges til at adskille forskellige cellulære rum og organeller .
Proteiner adskilles ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese. Adskillelse af proteiner kan udføres ved isoelektrisk punkt (pI), molekylvægt , elektrisk ladning eller en kombination af disse parametre.
Den mest almindelige metode til adskillelse af proteiner er elektroforese i polyacrylamidgel i nærværelse af natriumdodecylsulfat ( SDS ) ifølge Laemmli . [5] SDS forårsager denaturering af proteiner og holder dem i en denatureret tilstand; disulfidbindingsreducerende midler, såsom dithiothreitol og mercaptoethanol , bruges til at ødelægge de sekundære og tertiære strukturer af proteiner . Denaturerede polypeptider migrerer i det elektriske felt gennem akrylamidgelen til anoden , hvor mindre proteiner bevæger sig hurtigere og således adskilles i henhold til molekylvægten. Koncentrationen af akrylamid bestemmer opløsningen af gelen - jo højere koncentrationen af akrylamid, jo bedre opløsning af proteiner med lille molekylvægt. En lav koncentration af akrylamid forbedrer opløsningen for proteiner med høj molekylvægt. Det er også muligt at anvende todimensionel elektroforese (2-D) . I dette tilfælde udføres adskillelsen af proteiner i to retninger - i overensstemmelse med deres isoelektriske punkt i den første retning og i overensstemmelse med molekylvægten - i den anden.
Prøver på gelen påføres lommerne. Som regel efterlades et af "sporene" for molekylvægtsmarkører (blandinger af proteiner med kendte masser). Efter at spændingen er påført, bevæger proteinerne sig i det elektriske felt med forskellige hastigheder. Forskelle i fremskridtshastighed - elektroforetisk mobilitet - fører til adskillelse af proteiner i bånd ( engelsk bånd ).
For at gøre proteiner tilgængelige for antistoffer og yderligere påvisning overføres de sammen med en gelstrimmel til en membran lavet af nitrocellulose eller polyvinylidenfluorid ( PVDF ) . Membranen påføres over gelen, og en stak filterpapir lægges ovenpå. Hele stakken placeres i overførselsbufferen, som under påvirkning af kapillærvirkning bevæger sig op ad papiret og bærer proteinerne med sig. En anden metode til at overføre proteiner kaldes elektroblotting og bruger en elektrisk strøm til at overføre proteiner fra gelen til membranen. Proteiner bevæger sig fra gelen til membranen, mens de bevarer deres placering. Som et resultat af denne "blotting" (fra engelsk blotting ) proces tilbageholdes proteiner på et tyndt overfladelag af detektionsmembranen. Begge membranvarianter bruges på grund af deres ikke-specifikke proteinbindende egenskaber. Proteinbinding er baseret på både hydrofobe interaktioner og elektrostatiske interaktioner mellem membran og protein. Nitrocellulosemembran er billigere end PVDF, men er meget mere skør og mindre modstandsdygtig over for ommærkning.
Ensartetheden og den samlede effektivitet af overførslen af proteiner fra gelen til membranen kan kontrolleres ved at farve membranen med Coomassie blue eller Ponceau S- farvninger . Coomassie er den mest almindelige af de to, mens Ponceau S er mere følsom og vandopløselig, hvilket gør den efterfølgende rengøring og mærkning af membranen lettere. [6]
Når først en membran er blevet udvalgt for dens evne til at binde proteiner, er antistoffer og målprotein udvalgt, skal man passe på at undgå interaktion mellem membranen og det antistof, der bruges til at påvise målproteinet (fordi antistoffet i sig selv er et protein). Blokering af ikke-specifik binding opnås ved at placere membranen i en fortyndet proteinopløsning - sædvanligvis bovint serumalbumin eller fedtfri tørmælk (begge billig), med en lille procentdel af et detergent såsom Tween 20 eller Triton X-100 . Proteinet fra den fortyndede opløsning er fastgjort til membranen alle steder, hvor målproteinet ikke har fæstnet sig. Derfor, når antistoffer tilsættes, er det eneste frie sted på membranen, hvor de kan binde, bindingsstederne på specifikke målproteiner. Denne baggrundsstøj i det sidste western-blot resulterer i rene resultater og eliminering af falske positiver.
Under påvisningsprocessen "mærkes" membranen med proteinet af interesse med et modificeret antistof, der er bundet til et reporterenzym, som holdes på en passende understøtning, hvilket fører til en kolorimetrisk reaktion og giver farve. Af forskellige årsager udføres detektion i to trin, selvom en et-trins detektionsmetode nu er tilgængelig for visse applikationer.
Antistoffer produceres ved at udsætte en værtsklasse eller en kultur af immunceller for et eller andet protein (eller en del af det). Dette er normalt en del af immunresponset, men her (i assayet) bruges de opsamlede antistoffer som et specifikt og følsomt detektionsværktøj, der binder direkte til proteinet.
Efter blokering inkuberes den fortyndede primære antistofopløsning (sædvanligvis mellem 0,5 og 5 µg/ml) med membranen og rystes forsigtigt. Normalt består opløsningen af en bufret saltopløsning med en lille procentdel vaskemiddel, nogle gange mælkepulver eller BSA. Antistofopløsningen og membranen kan lukkes sammen og inkuberes alt fra 30 minutter til natten over. De kan også inkuberes ved forskellige temperaturer; ved forhøjede temperaturer observeres bedre binding - både specifik (af målproteinet, "signal1") og ikke-specifik ("støj").
Efter skylning af membranen for at fjerne ubundne primære antistoffer, udsættes membranen for andre antistoffer, der binder direkte til de klassespecifikke regioner af de primære antistoffer. Disse er kendt som sekundære antistoffer, og i henhold til deres målegenskaber omtales de almindeligvis som "anti-mus", "anti-ged" og så videre. Antistoffer opnås fra en animalsk kilde (eller animalske kilder til hybridomakultur ); anti-mus sekundære antistoffer vil binde til de fleste mus-afledte primære antistoffer. Dette skaber nogle besparelser ved at tillade et individuelt laboratorium at bruge en enkelt kilde til masseproduktion af antistoffer og fører til meget mere reproducerbare resultater. Sekundære antistoffer er sædvanligvis bundet til biotin eller til et reporterenzym såsom alkalisk fosfatase eller peberrodsperoxidase . Det betyder, at flere sekundære antistoffer kan binde til en primær og forstærke signalet.
De mest almindelige peberrodsperoxidase- relaterede sekundære antistoffer bruges til at skære det kemiluminescerende middel, og reaktionsproduktet producerer selvlysende stråling i forhold til mængden af protein. Et ark af fotofølsom fotografisk film anbringes mod membranen og udsættes for reaktionsstråling, hvilket skaber et billede af antistofbåndene på blottet. En billigere, men mindre følsom tilgang med 4-chlornaphtholfarvning blandet med 1 % hydrogenperoxid ; reaktionen af peroxidradikalet med 4-chlornaphthol giver en mørkebrun farve, som optages uden brug af en speciel fotografisk film.
Som med ELISPOT og ELISA kan enzymet forsynes med et substratmolekyle, der omdannes af enzymet til et farvet reaktionsprodukt, der vil være synligt på membranen (se blåbåndet figur nedenfor).
En anden sekundær antistofdetektionsmetode bruger antistoffer med en bundet fluorofor, der udsender i det nære infrarøde (NIR). Lyset, der udsendes af det fluorescerende farvestof, er konstant og gør fluorescensdetektion til en mere nøjagtig og følsom måde at måle forskellen i signal produceret af proteiner mærket med antistoffer på et Western blot. Proteiner kan kvantificeres, da signalet beregnes som forskellen (stråling) i forhold til alle proteiner på membranen, målt i hvile, til (strålingen) af kemiluminescens, som måles dynamisk. [7]
En tredje alternativ metode anvender et radioaktivt mærke i stedet for et enzym bundet til et sekundært antistof, såsom mærket Staphylococcus Protein A type antistof-bindende protein med en radioaktiv isotop af iod. Andre metoder er sikrere, hurtigere og billigere, så radioaktiv detektion bruges sjældent.
Historisk set er mærkningsprocessen blevet udført i to trin, fordi det er relativt nemmere at producere primære og sekundære antistoffer i separate processer. Dette giver forskere og virksomheder en enorm fordel med hensyn til fleksibilitet og tilføjer et forstærkningstrin til detektionsprocessen. I betragtning af fremkomsten af high throughput protein-assays og lave detektionstærskler er der stadig interesse i at udvikle et et-trins mærkningssystem, der tillader processen at køre hurtigere og til lavere omkostninger. Det (et et-trins system) kræver antistof-tags, der vil genkende proteinet under undersøgelse og samtidig bære en markør til detektion - de tags, der er mest tilgængelige for de kendte "proteinhaler". Først inkuberes etiketterne med en to-trins membran med primære antistoffer, og derefter er de klar til direkte påvisning efter en række vaske.
Efter afvaskning af ubundne mærker er Western blot klar til at detektere prober bundet til målproteinet. I praksis viser ikke alle westerns proteiner med kun et bånd på membranen. Omtrentlig størrelse beregnes ved at sammenligne de farvede bånd med molekylvægtsmarkører tilføjet ved elektroforese. Processen vil blive gentaget med strukturelle proteiner såsom actin eller tubulin , der ikke ændrer sig mellem forsøgene. Mængden af målprotein afhænger af mængden af kontrolstrukturelt protein mellem grupperne. Denne teknik giver en korrektion af mængden af totalt protein på membranen i tilfælde af en fejl eller ufuldstændig overførsel.
Den kolorimetriske detektionsmetode er baseret på inkubation af et Western blot med et substrat, der reagerer med et reporterenzym (såsom peberrodsperoxidase ) , "sidder" på et sekundært antistof . Det opløselige farvestof ændrer sig til en uopløselig form af en anden farve, udfælder ved siden af enzymet og farver membranen. Pletvækst begrænses ved at vaske det opløselige farvestof af. Niveauet af protein vurderes densitometrisk ved farvningsintensitet eller spektrofotometrisk .
Den kemiluminescerende detektionsmetode er baseret på inkubation af en nitrocellulosemembran med et substrat, der luminescerer efter interaktion med en sekundær antistofreporter. Lyset optages af en fotografisk film eller CCD - kamera, som digitalt fanger en Western-klat. Billedet analyseres densitometrisk , estimerer den relative mængde af farvet protein og giver et kvantitativt resultat i enheder af optisk tæthed. Den nye software tillader yderligere dataanalyse, såsom molekylvægtsbestemmelse, hvis en passende standard er blevet brugt.
Radioaktive mærker kræver ikke enzymsubstrater, men gør det muligt at placere medicinsk radiografisk film foran en Western blot, hvilket gør det muligt for den (filmen) at interagere med mærkerne og skabe mørke områder, der svarer til båndene af det undersøgte protein (i billedet til højre). Efterspørgslen efter radioaktive detektionsmetoder er faldende på grund af deres høje omkostninger, høje sundheds- og sikkerhedsrisici og alternativer leveret af ECL.
Fluorescerende etiketter exciteres af lys og udsender lys med længere bølgelængde, som detekteres af fotosensorer såsom et CCD -kamera udstyret med passende emissionsfiltre. Kameraet tager et digitalt billede af western blot, hvilket muliggør yderligere analyse af de opnåede data, såsom molekylvægtsanalyse og kvantitativ western blot-analyse.