Triplex DNA , H-DNA eller triplex-DNA er en form for DNA , hvor tre oligonukleotider vikler sig om hinanden for at danne en tredobbelt helix. I trestrenget DNA binder den tredje DNA-streng til den dobbeltstrengede B-form af DNA dannet af Watson-Crick- interaktioner, Hoogsteen - interaktioner eller omvendte Hoogsteen - hydrogenbindinger . Tri-strenget DNA kan interferere med normal replikation og øge hyppigheden af mutationer i dannelsesregionen.
Tripleksdannende oligonukleotider (TFO'er) er 15-25 nukleotider lange oligonukleotider , der binder til hovedrillen af dobbeltstrenget DNA for at danne intermolekylært tripleks-DNA. TFO'er kan undertrykke transkription ved at binde til DNA-dobbelthelixen, da bindingsstederne for transkriptionsfaktorer i dette tilfælde er utilgængelige. Introduktionen af TFO i en celle kan bruges til at kontrollere genekspression, stedstyret mutagenese og kan i fremtiden blive en af genterapistrategierne .
Thymin (T) kan interagere med Watson - Crick - parret T - A via en Hoogsteen-hydrogenbinding. Thymin danner hydrogenbindinger med adenin i det oprindelige T-A-par for at danne en T-A*T-triplet [1] . I et surt miljø kan protoneret cytosin (C+) også interagere med C - G -parret via Hoogsteen-interaktioner, hvilket danner C-G*C+-tripletten. T-A*T og C-G*C+ tripletterne er de mest stabile mulige tripletter, mens T-A*G og C-G*G tripletterne er de mindst stabile [2] .
Der er to klasser af trestrenget DNA: intramolekylært og intermolekylært. I tilfælde af intermolekylær tripleks-DNA dannes en binding mellem DNA-dupleksen og en anden ekstern DNA-streng, som enten kan være fra et homologt kromosom eller være et tripleksdannende oligonukleotid (TFO ) . Intramolekylært trestrenget DNA dannes ud fra en duplex med homopurin- og homopyrimidinregioner med gentagen spejlsymmetri [3] . Mængden af dannet intramolekylært trestrenget DNA påvirkes af graden af DNA-supercoiling [4] . Der er to typer af intramolekylær triplex-DNA: H-DNA og H*-DNA. H-DNA dannes i et surt miljø i nærvær af divalente kationer , såsom Mg2 + . I denne konformation vendes homopyrimidinkæden i duplexen tilbage for at binde parallelt med purinkæden. Denne konformation stabiliseres af basistriaderne T—A*T og C—G*A+. Ved den sidste triade skal cytosin protoneres, hvorfor et surt miljø er nødvendigt for dannelsen af H-DNA [5] . H*-DNA dannes ved neutrale pH-værdier i nærværelse af divalente kationer. I tilfælde af H*-DNA binder homopyrimidin- og purinkæderne til hinanden på en antiparallel måde. H*-DNA stabiliseres af triaderne T—A*A og C—G*G [3] [5] .
Tripleksdannende oligonukleotider (TFO'er) er 15-25 nukleotider lange oligonukleotider , der binder til hovedrillen af dobbeltstrenget DNA for at danne intermolekylært tripleks-DNA. Der er opnået en række beviser for, at disse oligonukleotider in vivo kan tage del i reguleringen af genekspression [ 6] .
TFO'er har en tendens til at binde til homopurin- eller homopyrimidin-steder, som oftest findes i området for promotorer og introner i gener [7] . TFO'er kan undertrykke transkription ved at binde til DNA-dobbelthelixen, da bindingsstederne for transkriptionsfaktorer i dette tilfælde er utilgængelige. Introduktionen af TFO i en celle ved transfektion eller andre metoder kan bruges til at kontrollere genekspression [8] , site-directed mutagenese , og kan i fremtiden blive en af genterapistrategierne . For eksempel blev der i 2004 skabt TFO, som specifikt binder promotoren af genet, der koder for transkriptionsfaktoren ETS2 , hvis overekspression ofte observeres ved prostatacancer [9] . TFO er blevet udviklet, der specifikt interagerer med promotoren af bcl-2- genet, som koder for et apoptose -repressorprotein [10] .
Undertrykkelse af transkription som følge af dannelsen af trestrenget DNA kan ligge til grund for menneskelige sygdomme og patologiske tilstande. I Friedreichs ataksi blokerer dannelsen af H-DNA således ekspressionen af intron 1 af FXN -genet [11] . I sidste ende fører dette til lanceringen af neurodegenerative processer i nervesystemet og bevægelsesforstyrrelser i lemmerne [12] . Dannelsen af triplex-DNA kan genkendes af nukleotidudskæringsreparationssystemet , som reparerer den dobbeltstrengede DNA-struktur [13] .
Syntetiske peptidonukleinsyrer (PNA) kan også interagere med dupleks-DNA , hvor sukker-phosphat-rygraden er erstattet af en pseudo -peptid- rygrad. Når peptidonukleinsyre binder til dupleks-DNA, forskydes en af DNA-strengene, og der dannes en P-løkke. Peptidonukleinsyrer er resistente over for proteaser og kan bruges til at udløse reparation på mållocuset på grund af H-DNA-dannelse. PNA'er kan binde til den komplementære DNA-streng med høj affinitet og specificitet via Watson-Crick-interaktioner. Under dannelsen af tripleks-DNA interagerer PNA med dupleksen gennem Hoogsteen-interaktioner [14] . I modsætning til ægte triplex-DNA er hybriden af PNA og dobbeltstrenget DNA stabil, da PNA ikke indeholder en negativt ladet sukker-phosphat-rygrad, men en neutral pseudopeptid-rygrad [15] . I modsætning til TFO'er, som binder til dupleks-DNA i regionen af hovedrillen, interagerer PNA'er med DNA-dobbelthelixen på forskellige måder [14] .
En dupleks DNA-sekvens af blandet sammensætning kan genkendes af et par pseudo-komplementære PNA'er, der kan dobbeltinvadere DNA-helixen på grund af den samtidige dannelse af diaminopurin (D) og thiouracil ( U S ), som erstatte henholdsvis adenin og thymin [16] . Pseudo-komplementære PNA'er danner helixer af PNA:DNA-sammensætningen med hver af dupleksstrengene på grund af dannelsen af D-T, U S -A, G-C og C-G-par. En anden form for dupleksinvasion kan udføres af homopurin PNA på grund af komplementær interaktion med den antiparallelle DNA-streng [17] [15] .
Endelig kan PNA'er danne en "klemme" på målstedet som et resultat af kemisk modifikation. En type "klemme" inkluderer en struktur af to PNA'er forbundet med en fleksibel linker - 8-amino-3,6-dioxaoctansyre [18] . Denne struktur danner en PNA:DNA:PNA-tripleks på målstedet, hvor en af PNA'erne interagerer med den antiparallelle DNA-streng ved hjælp af Watson-Crick-par, mens den anden streng danner Hoogsteen-par med den anden streng, den anden streng skal nødvendigvis indeholde et homopurin- eller homopyrimidinsted, som PNA interagerer med [17] . En anden form for 'klemme' er kendt som en ' haleklemme ' . Den består af en PNA:DNA:PNA-klemme og en yderligere DNA:PNA-dupleks, der danner en 5-10 bp hale . I dette tilfælde er der ikke behov for et homopurin- eller homopyrimidinsted i den originale DNA-duplex [15] .
Dannelsen af en sådan ustabil struktur som H-DNA kan forårsage genomisk ustabilitet på stedet for dets fremkomst [19] . For eksempel er der ved siden af P1-promotoren af c-MYC-genet polypurin -regioner , der er i stand til at danne triplex-DNA, og dets dannelse fører til en stigning i ustabilitet nær c-MYC . Eksperimenter på transgene mus viste, at introduktionen af humane sekvenser, der er tilbøjelige til at overgå til triplekstilstanden, sammen med sekvenser, der kan passere ind i Z-DNA , til områder af genomet, for hvilke tilfælde af genetisk ustabilitet ikke er kendt, fører til til udseendet af ustabilitet i dem [20] . Derudover er det kendt, at dannelsen af H-DNA kan fremme translokationer mellem kromosom 14 og 18 , som ligger til grund for mange kræftformer , såsom follikulært lymfom . Forskere har vist, at reduktion af sandsynligheden for H-DNA-dannelse også reducerer sandsynligheden for translokationer [20] [21] .
Trestrenget DNA kan interferere med normal replikation og, ligesom andre ikke-kanoniske DNA-strukturer, øge hyppigheden af mutationer i dannelsesregionen [22] . Som nævnt ovenfor kan H-DNA udgøre en fysisk barriere for transkription. Som eksperimenter med T7 RNA-polymerase viste , kunne transkriptionsapparatet ikke overvinde Watson-Crick- og Hoogsteen-interaktionerne, der binder triplex-kæderne, hvilket førte til transkriptionsstop [23] . Transkriptionelt standsning ved kollision af transkriptionelt maskineri med H-DNA aktiverer transkriptionskoblet reparation, på grund af hvilken H-DNA udskæres, hvilket fører til deletioner [24] .
Trestrenget DNA kan genkendes af forskellige nukleaser . For eksempel skærer nukleaserne ERCC1-XPF og ERCC1-XPG, involveret i nukleotidudskæringsreparation, H-DNA i området af løkken dannet af strenge, der interagerer via Hoogsteen-par og 5'-enden af strengen, der danner Watson -Crick-par [25] . Dette hul kan føre til store deletioner, der fører til genomisk ustabilitet. FEN1 nukleasen forhindrer tværtimod genomisk ustabilitet. Den introducerer ligesom ERCC1-XPG et brud i H-DNA i 5'-enden af kæden, som ikke er involveret i Hoogsteen-interaktioner. I HeLa-celler, der mangler FEN1 , er antallet af deletioner nær H-DNA større end i celler med FEN1, og den mutagene virkning af H-DNA i celler, der mangler FEN1, var mest udtalt under DNA-replikation. FEN1 hæmmer således H-DNA-induceret mutagenese på en replikationsafhængig måde [22] [25] .
Som nævnt ovenfor kunne TFO være et genterapiværktøj. Den største vanskelighed ved den medicinske anvendelse af TFO og peptidonukleinsyrer er deres levering til celler [26] . I 2013, som en del af en undersøgelse med det formål at ændre genekspression i hæmatopoietiske celler , blev det foreslået at tværbinde peptidonukleinsyremolekyler med cellepenetrerende peptid (CPP'er såvel som nanopartikler fra poly ( mælke-ko-glycinsyre) [27] . Ved hjælp af denne tilgang lykkedes det forfatterne af arbejdet at modificere 6 basepar i CCR5 -genet , hvor mutationer er forbundet med HIV -resistens [28] . CCP'er tillader små "laster", såsom små biomolekyler , at blive frit leveret inde i celler . Poly(mælke-co-glykosyre) er en bionedbrydelig polymer , der kan indkapsle peptidonukleinsyremolekyler i partikler. Levering af peptidonukleinsyrer i sammensætningen af nanopartikler til målceller blev brugt i en anden undersøgelse om behandling af cystisk fibrose . Peptidonukleinsyrer blev sammen med et DNA- donormolekyle pakket ind i nanopartikler og leveret til bronkiale epitelceller for at redigere mutationen i CFTR -genet [29] .
I 1950'erne, da den nøjagtige struktur af DNA var ukendt, blev den trestrengede helix betragtet som en af de mulige modeller for organiseringen af DNA i cellen. Den trestrengede struktur af DNA blev betragtet som den mest sandsynlige af Linus Pauling og Robert Corey [ , som præsenterede den trestrengede DNA-model i 1953 [ 30] [31] . Watson og Crick, som senere modtog Nobelprisen i kemi for at bestemme strukturen af DNA, hældede også i starten til trestrengsmodellen, men de så en række problemer i den, som ikke stemte overens med de eksperimentelle data, der var tilgængelige på det tidspunkt. . Især negativt ladede fosfater , der vender mod helixens akse, ville frastøde hinanden af elektrostatiske årsager, hvilket gør det umuligt for en stabil tredobbelt helix at eksistere. I Pauling og Koreys trestrengede model var nogle van der Waals afstande for små. R. Fraser foreslog også sin model af en tredobbelt helix, hvor fosfater var placeret på overfladen af helixen, og nitrogenholdige baser blev vendt indad, men den blev ikke understøttet af eksperimentelle data [32] .
En alternativ trestrenget DNA-struktur blev foreslået i 1957 [33] . J. Fensenfeld, D. R. Davis og A. Rich forudsagde, at stabilt trestrenget DNA kunne dannes, hvis en streng kun bestod af purin-nukleotider, og de to andre bestod kun af pyrimidiner [6] [33] . Det blev antaget, at en sådan struktur in vivo kun dannes som et mellemprodukt af virkningen af RecA -proteinet i løbet af rekombination i bakterien Escherichia coli . Trestrengede DNA-modeller foreslået i 1960'erne forudsagde dannelsen af ikke Watson-Crick, men Hoogsteen-par i DNA-hovedrillen [6] . Nogen tid senere blev en trestrenget DNA-model foreslået, bestående af en pyrimidin- og to purinkæder [6] . Opdagelsen af trestrenget DNA i levende celler i slutningen af 1980'erne som en del af supercoiled plasmider viste, at dannelsen af H-DNA i princippet er mulig i levende celler [34] . Derudover blev det hurtigt vist, at homopyrimidin og nogle purinrige oligonukleotider kan binde til specifikke sekvenser i dupleks-DNA, hvilket fører til dannelsen af trestrenget DNA [35] .