Tyndtlagskromatografi

Tyndtlagskromatografi er en kromatografisk metode, hvor et tyndt lag adsorbent anvendes som en stationær fase . Metoden er baseret på, at de stoffer, der skal adskilles, fordeler sig forskelligt mellem det sorberende lag og den eluent , der strømmer igennem det , hvilket medfører, at afstanden, hvormed disse stoffer forskydes langs laget på samme tid, varierer. Tyndtlagskromatografi giver store muligheder for analyse og adskillelse af stoffer, da både sorbenten og eluenten kan variere over et bredt område. Plader med forskellige sorbenter er kommercielt tilgængelige, hvilket gør det muligt at bruge metoden hurtigt og rutinemæssigt. En variation af tyndtlagskromatografi er mere pålidelig og reproducerbar.højtydende tyndtlagskromatografi , som bruger specielle plader og sofistikeret udstyr.

Tyndtlagskromatografi blev opdaget i 1889, udviklet betydeligt i midten af ​​det 20. århundrede og er stadig meget udbredt inden for det farmaceutiske, medicinske, fødevareområdet såvel som i akademisk og industriel videnskab.

Historie

Forudsætningen for skabelsen af ​​metoden var Schönbeins brug af papirkromatografi i 1861 [1] . Denne metode blev udviklet i værker af Goppelsreder, en elev af Schönbein, i 80'erne af det XIX århundrede [2] . Teknikken på det tidspunkt blev kaldt kapillæranalyse. Værket blev stort set glemt, og i 1944 blev cellulosekromatografi genopdaget af Consden et al. Tyndtlagskromatografimetoden, næsten i den form, den nu kendes i, blev første gang brugt af den hollandske biolog Martin Beijerinck i 1889. Mens han studerede diffusionen af ​​svovlsyre og saltsyre i gelatine , fandt Beyerink, at saltsyre bevægede sig hurtigere end svovlsyre. I sine eksperimenter påviste han saltsyrezonen ved at tilsætte en sølvchloridopløsning til laget , og svovlsyrezonen ved at tilføje en bariumchloridopløsning . I 1898 anvendte Wijsman en lignende metode til bestemmelse af enzymer i maltdiastase og var den første til at bruge fluorescerende detektion; metodens følsomhed på det tidspunkt gjorde det muligt at bestemme tilstedeværelsen af ​​et stof i mængden af ​​40 pg [3] . På trods af dette blev både søjlekromatografi, udviklet af M. S. Tsvet i begyndelsen af ​​det 20. århundrede, og tyndtlagskromatografi faktisk først brugt i 1930'erne [4] .

I 1938 rapporterede Izmailov og Schreiber om at udføre cirkulær kromatografi på et lag af aluminiumoxid aflejret på en glasplade. I dette tilfælde tog lagene af adskilte stoffer form af koncentriske cirkler. Forskere har påvist, at metoden kan bruges til at teste sorbenter og eluenter til søjlekromatografi [3] .

Betydelige fremskridt i udviklingen af ​​TLC-metoden blev opnået af J. Kirchner og kolleger, som i 1945-1954 arbejdede på isolering af lugtstoffer fra citrusfrugter ved kromatografiske metoder. Overbevist om papirkromatografiens uanvendelighed til deres formål udviklede de en metode, der kombinerede fordelene ved papir- og søjlekromatografi, men den tiltrak ikke megen opmærksomhed, før den blev annonceret af Desaga og Merck [3] .

Indtil midten af ​​1950'erne blev begreberne "strimmelkromatografi", "pladekromatografi", "tyndfilmskromatografi", "åben søjlekromatografi" brugt til at beskrive metoden, men udtrykket "tyndtlagskromatografi", som blev foreslået af E. Stahl i 1956 [5] viste sig at være så vellykket, at den fortrængte alle andre. Omtrent på samme tid udpegede det autoritative tidsskrift Chemical Abstracts publikationer om dette emne som et separat indeks, der anerkendte det som en uafhængig metode til analytisk kemi [3] .

Stationær fase

Plader med et påført adsorptionslag kom til salg i 1961 og har nu praktisk talt fjernet hjemmelavede fra brug. Sorbenter med en partikelstørrelse på 10-20 µm påføres et substrat, normalt lavet af glas , plastik eller aluminium . Lagtykkelsen varierer fra 100-250 µm (til analytiske plader) til 2 mm (for præparative plader). Standard pladeformatet er 20x20 cm, men der findes også formaterne 10x20, 5x20 og 2,5x5 cm Du kan selv skære en plade i den ønskede størrelse. Plader fås også med kanaler for at lette prøvepåføring og forhindre prøveblanding. Plader med et præ-adsorptionslag er lavet af et materiale med en lavere adsorberende kapacitet ( cellulose , diatoméjord ). Sådanne lag tjener til at rense prøven såvel som til at danne en smal strimmel, før prøven når skillelaget [6] .

Plader til høj kapacitet TLC blev foreslået i 1975 og har også dimensioner på 10×20 og 10×10 cm med en adsorptionslagtykkelse på 200 µm. Sådanne plader har øget opløsning, lavere detektionsgrænse og kræver mindre opløsningsmiddel til eluering. I 1995 dukkede forbedrede højtydende sfæriske partikelplader op. I 2001 blev plader med et monolitisk lag tilbudt på markedet, som kun blev brugt i videnskabelig forskning [6] .

Adskillige materialer er historisk blevet brugt som adsorbenter: aluminiumoxid (surt, neutralt og basisk), kiselgur (oprenset diatoméjord), polyamider , kationbytterharpikser . Disse materialer nævnes stadig i lærebøger og videnskabelige artikler i dag, men de har mistet deres betydning, og deres produktion er stort set stoppet [6] .

Et bindemiddel kan bruges til at forstærke pladerne. Tidligere, til disse formål, for eksempel i plader med silicagel G, blev gips i vid udstrækning brugt i mængden af ​​13 masseprocent. Dagens kommercielt tilgængelige optegnelser bruger organiske bindemidler (f.eks. methacrylater). Anvendelsen af ​​stivelse og carboxymethylcellulose er også beskrevet i litteraturen . Faktisk er bindemidlet en bestanddel af den stationære fase, så brug af forskellige bindemidler kan føre til forskellige kromatografiske resultater [6] .

For at gøre bestemmelsen af ​​positionerne af stoffernes zoner mere bekvem, kan en fluorescerende indikator indføres i adsorptionslaget. Når et sådant lag bestråles med ultraviolet stråling med en bølgelængde på 254 nm, giver det en grøn (F 254 ) eller lyseblå (F 254 s ) glød. I dette tilfælde ser den zone af stoffet, der absorberer ultraviolet lys, mørk ud mod baggrunden af ​​det fluorescerende lag [6] .

Silicagel

Et af de vigtigste materialer i stationær fase er silicagel, som bruges i mere end 90 % af tyndtlagskromatografianvendelser. Silicagel opnås ved sur udfældning fra silicatopløsninger eller ved hydrolyse af siliciumderivater . Diameteren af ​​de resulterende partikler afhænger af betingelserne, for eksempel gør ændring af pH det muligt at opnå silicagel med et overfladeareal på 200 til 800 m²/g. Fra et kemisk synspunkt indeholder overfladen af ​​silicagel siloxan (Si-O-Si) og silanolgrupper (Si-OH). Silanolgrupper kan være frie, vicinale eller geminale. De kan også interagere med hinanden gennem dannelsen af ​​hydrogenbindinger [6] .

Silicagel er således karakteriseret ved mange variable parametre, hvis kontrol kan være forskellig for forskellige producenter. Ikke desto mindre er der udviklet metoder, der gør det muligt at opnå sfærisk silicagel med en given porestørrelse. Mange kvaliteter har en porestørrelse på 60 Å og omtales som "silicagel 60" [6] .

Silicagel har en meget høj affinitet til vand og etablerer hurtigt ligevægt med det, så resultatet opnået under TLC kan til en vis grad afhænge af luftfugtigheden i rummet [6] .

Aluminiumoxid

Aluminiumoxid er en polær uorganisk hydrofil sorbent. Det opnås ved termisk fjernelse af vand fra hydreret aluminiumhydroxid . Aluminiumoxid til kromatografi opvarmes normalt til en lav temperatur, hvilket giver et materiale med et specifikt overfladeareal på 50-250 m2/g. Det sorberede vand fjernes ved en temperatur på 250 °C [7] .

Ændrede stationære faser

Silicagel kan modificeres ved tre typer reaktioner: esterificering , reaktion med chlorsilan indeholdende den ønskede organiske substituent eller chlorering efterfulgt af behandling med en organolithiumforbindelse . Denne modifikation fører til dannelsen af ​​stationære faser med specielle egenskaber, der afhænger af arten af ​​substituenterne og metoden til deres tilsætning til silicagel [6] .

De  mest almindelige er omvendte faser ( RP ), hvor substituenten indført i silicagel er en alkylkæde med en længde på 2 til 18 carbonatomer. C2-faserne har fortrængt teknikkerne til imprægnering af silicagel med paraffin eller silikoneolie til efterfølgende brug i omvendt fase-kromatografi. Komplet omvendte faser indeholder C8- eller C18-kæder. Hydrofile faser indeholder aminogrupper , diolgrupper , nitrilgrupper på overfladen og kan bruges i både omvendt fase og normal fase kromatografi. I normalfasetilstand har de en lavere holdekapacitet og er ufølsomme over for fugt. Sådanne faser har ofte en særlig selektivitet på grund af aminogruppernes basicitet eller surhedsgraden af ​​hydroxylgrupperne, hvilket gør det muligt at ændre rækkefølgen af ​​output af komponenterne i den analyserede blanding [6] .

Cellulose

Den første form for anvendelse af cellulose i tyndtlagskromatografi var papirkromatografi . Tilgængelige plader til TLC og high-throughput TLC tillader separation af blandinger af polære stoffer, mens mindst ternære blandinger af vand, et organisk opløsningsmiddel, der ikke er blandet med det, og et vandopløseligt opløsningsmiddel, der fremmer dannelsen af ​​en fase, anvendes som eluent [6] .

Betegnelser i navnene på kommercielt tilgængelige TLC-plader [8]
Reduktion Betyder
CHIR Chiralt lag til at adskille enantiomerer
CN Hydrofilt lag med cyanogrupper
DIOL Hydrofilt lag med diol modifikation
F Indeholder en fluorescerende indikator
F 254+366 Fluorescerende indikator excitationsbølgelængder
F 254s Syrefast fluorescerende indikator
G Gips
H Indeholder ingen modifikationer
NH2 _ Hydrofilt lag med aminogrupper
P Til forberedende arbejde
R Specielt renset
RP omvendt fase
RP-8, RP-18 Omvendt fase med 8- eller 18-carbondel
Silaniseret, RP-2 Omvendt fase med dimethylsilyl modifikation
W Befugtet lag
40, 60,... Gennemsnitlig porestørrelse i ångstrøm

Mobil fase

Den mobile fase er ansvarlig for at flytte prøven gennem kromatografisystemet, og det er vigtigt at vælge den rigtige for optimale resultater. Som en mobil fase tillader TLC brugen af ​​både et individuelt opløsningsmiddel og komplekse blandinger. Silicagelkromatografi bruger normalt blandinger af organiske opløsningsmidler. Omvendt fase kromatografi bruger en blanding af vand og et organisk opløsningsmiddel. I begge tilfælde kan den mobile fase karakteriseres af to parametre: styrken af ​​opløsningsmidlet, som bestemmer graden af ​​mobilitet af prøvekomponenterne i forhold til sorbenten, og selektiviteten, som påvirker rækkefølgen af ​​stoffernes zoner. Minimumskravet til den mobile fase er i det mindste delvis opløselighed af prøven i den.

Styrken af ​​opløsningsmidlet

Styrken af ​​opløsningsmidlet er en parameter, der bestemmer den mobile fases evne til at flytte stoffer gennem sorbenten. Så et svagt opløsningsmiddel er ikke i stand til at flytte stoffets zone fra påføringsstedet, og et stærkt, tværtimod, forskyder stoffets zone praktisk talt med frontlinjen [9] . En passende eluent vil flytte materialet omkring 1/3 af den samlede afstand tilbagelagt af eluenten. I tilfælde af silicagel er polære opløsningsmidler stærkere, og ikke-polære er svagere (denne afhængighed er forskellig for forskellige sorbenter) [10] .

En kvantitativ beskrivelse af opløsningsmidlets styrke er givet af parameteren E° , der kan defineres som opløsningsmidlets adsorptionsenergi pr. enhed standardsorbent. I praksis kan den tilbagelagte afstand af et stof ikke beregnes ud fra denne parameter, men et relativt estimat er muligt: ​​Med en større værdi af E° for eluenten tilbagelægger stoffet en længere afstand, og omvendt. For omvendte faser er situationen den modsatte. Stofzonens migrationsafstand er også relateret til dens polaritet: flere polære stoffer interagerer stærkere med silicagel og bevæger sig langsommere, mens ikke-polære stoffer udviser svagere interaktioner og migrerer videre [10] .

En egnet eluent bestemmes eksperimentelt. For eksempel kan en prøve kromatograferes i ethylacetat . Hvis styrken af ​​ethylacetat er for høj, skal man skifte til et mindre polært opløsningsmiddel eller bruge en blanding af ethylacetat med et mindre polært opløsningsmiddel (såsom hexan ). Hvis styrken af ​​opløsningsmidlet er for lav, så kan du eksperimentere med et mere polært opløsningsmiddel eller øge styrken af ​​ethylacetat ved at tilsætte methanol [10] .

Opløsningsmiddelstyrkeparameter E° for forskellige opløsningsmidler på aluminiumoxid [10]
Opløsningsmiddel E ° , AI2O3 _ Opløsningsmiddel E ° , AI2O3 _ Opløsningsmiddel E ° , AI2O3 _ Opløsningsmiddel E ° , AI2O3 _ Opløsningsmiddel E ° , AI2O3 _
Fluoroalkaner -0,25 Butylchlorid 0,26 Diethylsulfid 0,38 ethylacetat 0,58 ethanol 0,88
n- Pentan 0,00 xylen 0,26 Chloroform 0,40 Methylacetat 0,60 methanol 0,95
Hexan 0,00 Diisopropylether 0,28 dichlormethan 0,42 Amyl alkohol 0,61 ethylenglycol 1.11
Isooctan 0,01 2-chlorpropan 0,29 Methylisobutylketon 0,43 Dimethylsulfoxid 0,62 Eddikesyre stor
Cyclohexan 0,04 Toluen 0,29 Tetrahydrofuran 0,45 Anilin 0,62 Vand stor
Cyclopentan 0,05 1-Chlorpropan 0,30 Dichlorethan 0,49 diethylamin 0,63 Salte og buffere meget stor
Diisobutylen 0,06 Klorbenzen 0,30 Methylethylketon 0,51 Nitromethan 0,64
Penten-1 0,08 Benzen 0,32 1-nitropropan 0,53 Acetonitril 0,65
kulstofdisulfid 0,15 Bromethan 0,37 Acetone 0,56 pyridin 0,71
Carbontetrachlorid 0,18 diethylether 0,38 dioxan 0,56 propylalkoholer 0,82

Opløsningsmiddelkvalitet

Ved tyndtlagskromatografi kan kvaliteten af ​​de anvendte opløsningsmidler spille en væsentlig rolle. Det anbefales at bruge opløsningsmidler af mindst analytisk kvalitet, da urenheder indeholdt i eluenten kan interagere med sorbenten eller det opløste stof. Nogle opløsningsmidler undergår autooxidation under opbevaring. Opløsningsmidler kan nedbrydes eller på anden måde reagere, når de opbevares i metalbeholdere. Reproducerbarheden er væsentligt påvirket af vandindholdet i opløsningsmidlet, hvis mængde kan ændre sig over tid, hvilket fører til en ændring i styrken af ​​eluenten. For eksempel indeholder chloroform udover andre urenheder ofte ethanol som stabilisator, hvoraf selv små mængder kan påvirke resultatet af kromatografi væsentligt [10] .

Udførelse af et eksperiment

Prøveforberedelse

For korrekt prøveforberedelse skal en repræsentativ del af materialet udvælges. Dette kræver normalt fuldstændig opløsning af det i et passende opløsningsmiddel. Nogle gange er det ikke muligt at opløse hele prøven: i dette tilfælde er det nødvendigt at sikre sig, at i det mindste de nødvendige stoffer er opløst. Tilstedeværelsen af ​​en stor mængde urenheder eller en matrix i et stof kan forringe resultaterne af en analyse eller adskillelse, så et prøveoprensningstrin ved ekstraktionsmetoder kan anvendes på forhånd . Dette trin implementeres ved hjælp af plader med et præadsorptionslag, der fanger de polære komponenter i matrixen [11] .

Sammenlignet med søjlekromatografi er tyndtlagskromatografi mindre krævende for urenheder, da søjler skal vaskes før påføring af nye prøver, og TLC-plader kun bruges én gang [11] .

Record forberedelse

Nogle gange udsættes plader for yderligere forberedelsestrin, før TLC udføres [12] .

Anvendelse af prøven

Påføringen af ​​prøven på pladen påvirker kvaliteten af ​​resultatet væsentligt. Således afhænger adskillelsen af ​​komponenterne i en blanding af størrelsen af ​​den påførte zone i retning af kromatografi, og det er kun muligt at sammenligne prøver ved deres mobilitet, hvis zonerne er nøjagtigt påført pladen. Når der udføres en kvantitativ analyse, er det nødvendigt at anvende nøjagtigt målte volumener af opløsninger af stoffer [11] .

Der er to måder at anvende prøven på: manuel og automatisk. Ved manuel påføring markeres punkter på pladen med en blyant, der ligger på et segment parallelt med pladens nederste kant og med en sådan afstand fra denne, at spidserne ikke synker ned i eluenten. Antallet af point skal svare til antallet af analyserede prøver. Derefter påføres ved hjælp af mikrokapillærer en opløsning af den analyserede prøve på de markerede punkter, hvis volumen normalt er begrænset til 5 μl i tilfælde af TLC og 1 μl i tilfælde af high-throughput TLC. Store mængder opløsninger påføres med flere berøringer og tørrer opløsningsmiddelpladen mellem dem. I dette tilfælde bør opløsningsmidlet, som prøven er placeret i, have så lidt polaritet som muligt, da cirkulær kromatografi forekommer under påføring, hvilket kan føre til spredning og adskillelse af prøvekomponenterne [11] .

Automatiske og semi-automatiske prøvepåføringssystemer anvender sprøjteprincippet. Opløsningen trækkes ind i sprøjtens nål, nålen placeres derefter nøjagtigt over pladens overflade, og stemplet presser et givet volumen af ​​opløsningen ud. Opløsningsmidlet fjernes ved at blæse med trykluft eller nitrogen. Teknologien giver dig mulighed for at skabe smalle zoner af stoffer, hvilket bidrager til maksimal opløsning. Påføring af stoffer er også mulig i form af spidser eller rektangulære zoner, og de påførte volumener kan variere fra nogle få nanoliter til high-throughput TLC til hundredvis af mikroliter til præparativ TLC. I sidstnævnte tilfælde gør teknikken det muligt at skabe en ensartet langstrakt zone langs hele pladen [11] .

Eluering

Efter påføring af opløsningen af ​​den undersøgte blanding af stoffer anbringes pladen i en beholder, hvori et lag eluent hældes i bunden. Når den nederste kant af pladen er nedsænket i væske, begynder eluenten at stige op i det kromatografiske lag under påvirkning af kapillarkræfter . For at undgå fordampning af den flygtige eluent fra overfladen af ​​pladen under kromatografi, forsegles beholderen. Efter at frontlinjen har nået en højde, der er tilstrækkelig til analyse, fjernes pladen og tørres. Afstanden tilbagelagt af frontlinjen tælles normalt fra startlinjen. Det er valgt tilstrækkeligt til den efterfølgende identifikation af de adskilte stoffer på pladens overflade. Adskillelsen af ​​blandingskomponenterne forbedres med at øge denne afstand, men der er en optimal værdi, som for konventionelle plader er 12-15 cm.Det skyldes, at kapillærkræfterne virker på de fugtende frontlinjer, og den mobile fase er mindre og mindre påvirket, efterhånden som den bevæger sig gennem det kromatografiske lag, kapillære kræfter på grund af deres balancerende tyngdekraft.

Når der udføres kromatografi, tager det fra 45 til 150 minutter at føre fronten frem til den optimale længde, afhængigt af elueringsmidlets viskositet. I high-throughput TLC er partikelpakningen af ​​det kromatografiske lag tættere, den optimale afstand er ca. 6 cm, og elueringen tager fra 15 til 50 minutter [13] .

Der er forskellige måder at eluere prøver på plader. Den lodrette plade og den stigende eluentmetode er den mest almindelige og giver acceptable resultater til de fleste formål. Der er også kar, der gør det muligt at rette den mobile fase vandret. Resultaterne i dette tilfælde er sammenlignelige med standard, men fordelen er, at eluenten kan tilføres samtidigt i to modsatte retninger, hvilket gør det muligt at fordoble antallet af prøver (72 prøver kan adskilles samtidigt på en højtydende 20×10 cm tallerken). Cirkulær og anticirkulær kromatografi, hvor eluentens bevægelse sker fra centrum til periferien eller omvendt, anvendes meget begrænset, for eksempel ved valg af opløsningsmiddel til kromatografi [13] .

Multipel eluering anvendes, når en enkelt eluering ikke effektivt adskiller komponenterne i blandingen. Ved gentagen eluering i samme opløsningsmiddelsystem sker optimering på grund af koncentrationen af ​​forkert påførte zoner af stoffer. Det er også muligt at præ-eluere i et meget polært opløsningsmiddel i kort tid, hvilket vil gøre det muligt for stofferne at blive koncentreret på laget. Foreløbig eluering i et ikke-polært opløsningsmiddel giver dig mulighed for at fjerne den ikke-polære matrix fra objektet [13] .

En todimensionel eluering indeholder to successive elueringer i vinkelrette retninger. Efter den første eluering fjernes pladen, tørres, og linjen, hvorpå de adskilte komponenter er placeret, bliver startlinjen i den anden eluering. I dette tilfælde kan man bruge to eluenter af forskellig styrke, samt samme eluent, hvilket er nyttigt til at vurdere stabiliteten af ​​et stof i et kromatografisk eksperiment [13] .

Visualisering

Efter eluering er de adskilte stoffer i blandingen placeret på overfladen af ​​pladen i visse positioner. En række metoder er blevet foreslået til at bestemme deres positioner på pladen. Hvis stoffet er farvet, bestemmes stedet af stedet visuelt, ingen yderligere behandling med reagenser eller visualisering med andre metoder er påkrævet. De fleste organiske forbindelser er dog farveløse. Hvis et stof absorberes i det ultraviolette område, så visualiseres det på en plade med en fluorescerende indikator F 254 under ultraviolet stråling (pletter af sådanne stoffer på pladen ser enten mørke eller fluorescerende ud) [14] .

Mere eller mindre selektive kemiske billeddannelsesmetoder anvendes i vid udstrækning. For eksempel er den enkleste metode at behandle med joddamp , mens de sorberede stoffer bliver mørkebrune, og baggrunden forbliver lys. Universelle metoder er baseret på brug af opløsninger af forskellige syrer eller oxidationsmidler , når de opvarmes med hvilke stoffer danner brune eller sorte pletter. Selektive reagenser, såsom ninhydrin , gør det muligt at visualisere forbindelser af en bestemt klasse - aminer og aminosyrer [14] .

Kromatografiske tyndtlagsplader kan også bruges i biologiske test til at påvise stoffer med biologisk aktivitet mod mikroorganismer ved at udså kulturer af mikroorganismer i et næringsmedium på plader [14] .

Evaluering af resultater

En visuel sammenligning af mobiliteten og arten af ​​visualisering (farve, fluorescens) af prøven og visse standarder giver information om analyttens beskaffenhed, og intensiteten af ​​zonen karakteriserer dens mængde. Stoffer kan også vaskes af det kromatografiske lag til yderligere analyse ved andre metoder. Kvantificering i højtydende TLC udføres på digitale billeder efter forsøget i henhold til standardiserede metoder. Scanning densitometri giver information om de spektrale egenskaber af stofferne på pladen. For at forbedre analysens nøjagtighed anvendes sammenligning af spektre med databaseregistreringer samt massespektrometri af adskilte stoffer. Kvantificering udføres også ved hjælp af et scanningsdensitometer [15] .

Teori om tyndtlagskromatografi

Opløsningsmiddel flow

Strømningen af ​​den mobile fase gennem laget i tyndtlagskromatografi er forårsaget af virkningen af ​​kapillærkræfter. Væskefrontens bevægelse kan beskrives ved en kvadratisk afhængighed:

hvor z f  er afstanden fra faldlinjen til frontlinjen, t  er elueringstiden, og ϰ er flowkonstanten eller hastighedsfaktoren. Dette forhold blev etableret i 1856 af ingeniøren Henri Darcy , som undersøgte hastigheden for indtrængning af jordvand gennem en porøs overflade. Ligningen viser, at den forreste migrationshastighed falder hyperbolsk med stigende migrationsvej. Så for eksempel, ved en given værdi på ϰ = 3,3 cm²/s, tager den forreste migration med 10 cm 30 minutter, og med 15 cm tager det 68 minutter [16] . Strømningskonstanten ϰ bestemmes af diameteren af ​​sorbentpartiklerne, samt forholdet mellem eluentens overfladespænding og dets viskositet [17] . Vandet sorberet på laget binder sig ofte stærkere til laget end komponenterne i eluenten. I dette tilfælde reducerer vand, der kommer ind i laget, lagets porøsitet og øger eluentstrømningshastigheden. Hvis styrken af ​​eluenten og vandet er sammenlignelig, så fortrænger eluenten vand fra laget [18] .

Sorptionsisoterm

Enhver kromatografisk proces er baseret på omfordelingen af ​​et stof mellem den mobile og stationære fase. Denne ligevægt er relateret til temperaturen, og efterhånden som den stiger, stiger andelen af ​​stoffet i den mobile fase normalt. For en numerisk beskrivelse af ligevægten introduceres omfordelingskoefficienter:

hvor C s og C m  er koncentrationerne af stoffet i henholdsvis den sorberende og ikke-sorberende fase. Omfordelingskoefficienten bestemmer hældningen af ​​sorptionsisotermen  - en lineær graf over forholdet mellem C s og C m ved en konstant temperatur. Af interesse er tilfældet med en buet sorptionsisoterm: i dette tilfælde afhænger kurvens hældning af koncentrationen, og pletterne på kromatogrammet er slørede. For en konkav sorptionsisoterm (hvor K falder med stigende stofkoncentration), dannes en "hale" nær stedet. Med en konveks sorptionsisoterm observeres den modsatte situation: den forreste del af pletten er sløret [19] . Sådanne effekter forklares af kinetiske processer (den såkaldte modstand mod masseoverførsel) eller den ikke-lineære karakter af sorptionsisotermen ("overbelastning"). I komplekse blandinger kan komponenter påvirke hinanden og skabe gensidige overbelastningsforhold. I dette tilfælde falder K [ 19] . Som regel i analytiske applikationer er ikke-lineariteten af ​​sorptionsisotermer uønsket, da det fører til udtværing af zoner og ændringer i pletmobiliteter. Udretning af isotermer kan opnås ved at deaktivere sorbenten (for eksempel ved at tilsætte vand eller ved at øge opløsningsmidlets elueringsstyrke). I dette tilfælde er de mest aktive sorptionscentre optaget af deaktiverende additiver, og det sorberende lag bliver mere homogent [19] .

Placeringen af ​​zonerne på pladen

Den sædvanlige og enkleste parameter, der beskriver positionen af ​​en stofzone på en plade, er retentionsfaktoren:

hvor z x  er afstanden tilbagelagt af zonen, og z f  – z 0  er afstanden fra startlinjen til opløsningsmiddelfronten. Denne parameter er let at måle, men den indeholder ikke information om betingelserne for den kromatografiske proces. Af denne grund er andre definitioner af denne parameter Rf ' blevet foreslået som den relative opholdstid for et stof i den mobile fase eller fraktionen af ​​sorbatmolekyler i den mobile fase osv. [ 20] Den beregnede værdi af retentionsfaktoren er altid fhR mindre end enhed, derfor er parameteren [21] :

Som regel måles den afstand, stoffet tilbagelægger, fra startpunktet til midten af ​​stofzonen. Denne metode er velegnet til små områder, men i farmaceutiske renhedsassays, hvor belastningen af ​​et stof når 1000 µg pr. punkt, udvides pletterne ofte, så hR f -værdien svinger i området omkring 18 enheder. Desuden, hvis en prøve med en meget lavere koncentration elueres nær et sådant punkt, er det usandsynligt, at midten af ​​det resulterende lille punkt falder nøjagtigt sammen med midten af ​​den udvidede zone. Derfor er værdien af ​​hR f nogle gange angivet som et interval, der dækker værdier fra bunden af ​​zonen til dens top [21] . En fundamentalt anderledes parameter er værdien af ​​Rst , beregnet som kvotienten for at dividere den vej, stoffet tilbagelægger, med den vej, som et referencestof tilbagelægger. På nuværende tidspunkt har denne parameter praktisk taget mistet sin værdi [21] .

Split muligheder

For klart at beskrive graden af ​​adskillelse af to stoffer introducerer tyndtlagskromatografi opløsningsparameteren Rs , defineret som kvotienten af ​​afstanden mellem centrene af to pletter z x2  - z x1 divideret med bredden af ​​den kromatografiske top:

Det kan ses af ligningen, at jo større afstanden er mellem pletternes centre, jo bedre adskillelse, og jo bredere pletterne (henholdsvis jo større parameter σ er standardafvigelsen ), jo dårligere er stofferne adskilt. Ved R s = 0,5 er afstanden mellem pletterne σ 1 + σ 2 ≈ 2σ, det vil sige, i dette tilfælde forekommer "adskillelse med 2σ", og 20% ​​af arealet af de to zoner overlapper hinanden. Når de divideres med 4σ, er kun 3 % af arealet dækket [22] .

Ansøgning

Der er tre hovedområder for anvendelse af tyndtlagskromatografi [23] .

  1. Demonstration af grundlæggende kromatografi, hurtige indledende eksperimenter for at optimere præparative kromatografiske separationer.
  2. Forskningsværktøjer inden for akademisk og anvendt industriel videnskab, der bruges til at studere et stort antal prøver; kombination af plan adskillelse med biologisk, spektroskopisk og massespektrometrisk detektion (erstatter metoden til søjlekromatografi).
  3. Identifikation af medicinske og fødevareplantekomponenter ved validerede metoder med øgede krav til nøjagtighed, reproducerbarhed og følsomhed.

Noter

  1. ↑ Schoenbein C. F. Verhl. Naturforsh. Ges. Basel, 3, 249 (1861)
  2. ↑ Kirchner, bind 1, 1981 , s. femten.
  3. ↑ 1 2 3 4 Kirchner, bind 1, 1981 , s. 17-20.
  4. ↑ Kirchner, bind 1, 1981 , s. tyve.
  5. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , s. en.
  6. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Ullmann, 2012 , s. 2-5.
  7. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 375-377.
  8. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , s. 19.
  9. ↑ Se afsnittet Eluering
  10. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , s. 5-7.
  11. ↑ 1 2 3 4 5 Ullmann, 2012 , s. 7-9.
  12. ↑ Hahn-Deinstrop, 2007 , s. 41-49.
  13. ↑ 1 2 3 4 Ullmann, 2012 , s. 9-12.
  14. ↑ 1 2 3 Ullmann, 2012 , s. 12-14.
  15. ↑ Ullmann, 2012 , s. 14-16.
  16. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 39-42.
  17. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 45-52.
  18. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 61.
  19. ↑ 1 2 3 Geiss, bind 1, 1988 , s. 146-151.
  20. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 152-153.
  21. ↑ 1 2 3 Hahn-Deinstrop, 2007 , s. 4-6.
  22. ↑ Geiss, bind 1, 1988 , s. 203-205.
  23. ↑ Ullmann, 2012 , s. 2.

Litteratur

Bøger

Anmeldelser