Real-time polymerase kædereaktion

Real-time polymerase-kædereaktion (eller kvantitativ PCR, qPCR, PCR-RT, eng.  Real-time PCR, qPCR ) er en laboratoriemetode baseret på polymerase-kædereaktionsmetoden , der giver dig mulighed for ikke kun at bestemme tilstedeværelsen af ​​målnukleotidet rækkefølge i prøven, men mål også antallet af kopier. Mængden af ​​amplificeret DNA måles efter hver amplifikationscyklus ved hjælp af fluorescerende mærker: prober eller interkalatorer. Vurderingen kan være kvantitativ (måling af antallet af kopier af skabelonen) og relativ (måling i forhold til det indførte DNA eller yderligere kalibreringsgener ) [ 1] .

En modificeret kvantitativ PCR-metode kaldes semi-kvantitativ PCR (semi-kvantitativ PCR). Det bruges ofte til at sammenligne ekspressionen af ​​flere gener. I dette tilfælde måles mængden af ​​akkumuleret produkt kun på et tidspunkt - efter at reaktionen er stoppet. [2]

Real-time PCR kombineres ofte med andre metoder: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR osv. [3]

Beskrivelse af metoden

qPCR-proceduren ligner den klassiske PCR -procedure , det vil sige, at alle trin af reaktionen er til stede - smeltende dobbeltstrenget DNA ved en temperatur på 95˚C, annealing af primere (annealingstemperatur afhænger af de anvendte primere) og forlængelse ved en temperatur på 72˚C, hvis der anvendes Taq-polymerase . Mængden af ​​PCR-produkt måles i hver PCR-cyklus under anvendelse af fluorescerende mærker. Således indikerer styrken af ​​signalet den indledende mængde af molekylet af interesse [4] .

Amplifikationsplot _

Den nomenklatur, der almindeligvis anvendes til qPCR, er:

  1. Baseline er PCR-cyklusser, hvor det fluorescerende signal er under den værdi, som instrumentet kan detektere.
  2. ΔRn er stigningen af ​​det fluorescerende signal på hvert tidspunkt.
  3. Tærskellinjen er et vilkårligt niveau af fluorescens valgt baseret på basislinjen. Et signal, der detekteres over tærsklen, betragtes som et rigtigt signal, som kan bruges til at bestemme tærskelcyklussen (Ct) for prøven. Tærsklen kan justeres for hvert eksperiment til at være i den eksponentielle region på alle plots.
  4. Tærskelantallet af cyklusser (Ct) er antallet af PCR-cyklusser, hvor fluorescensen overstiger tærskelværdien.

Grafen består af en basislinje, en eksponentiel fase og et plateau [5] .

I de indledende faser er fluorescens svag, da der er lidt produkt, så det er svært at skelne det fra baggrunden. Efterhånden som produktet akkumuleres, vokser signalet eksponentielt i starten og når derefter et plateau. Plateauet skyldes manglen på en eller anden komponent i reaktionen - primere , nukleotidtriphosphater , en fluorescerende markør kan løbe ud. Hvis der er akkumuleret for meget reaktionsprodukt, kan polymerase blive en begrænsende faktor , og så vil afhængigheden af ​​mængden af ​​produkt på cyklussen blive lineær . Det er værd at bemærke, at i en standard real-time PCR-reaktion vil alle prøver plateau og nå omtrent det samme signalniveau. Slutpunktet vil således ikke sige noget om den indledende mængde af testprøven. På den anden side kan man i den eksponentielle fase spore forskelle i væksthastigheden af ​​mængden af ​​produkt. Forskelle i det oprindelige antal molekyler påvirker antallet af cyklusser, der kræves for at hæve fluorescensniveauet over støjniveauet [5] .

Ct er et tal, der kan bruges til at bedømme mængden af ​​mål-DNA i opløsning, men Ct-værdien kan afhænge af mange tilfældige faktorer, såsom detektorfølsomhed , filterkvalitet osv. Derfor er den nøjagtige startmængde af produktet af interesse kan ikke måles. Der er normaliseringsmetoder til at løse dette problem . Mål forholdet mellem mængderne af to molekyler i prøven. De normaliseres normalt til produkterne af husholdningsgener  - gener, hvis antal i en celle altid er omtrent det samme (et eksempel er infA-genet, der koder for translationsinitieringsfaktoren i bakterier ) . Forholdet bestemmes af følgende formel:

hvor og  er startmængderne af de to prøver, Ct B og Ct A  er de tilsvarende Ct-værdier, og  er PCR-effektiviteten, som ofte er lig med eller [5] .

Smeltekurveanalyse

Real-time PCR tillader identifikation af specifikke amplificerede DNA-fragmenter ved hjælp af en analyse af deres smelte- (denaturerings-) temperatur, også omtalt som Tm-værdien. Metoden bruger interkalerende farvestoffer, normalt SYBR Green . Smeltepunktet for DNA'et er specifikt for det amplificerede fragment. Resultaterne af denne metode blev opnået ved at sammenligne dissociationskurverne for de analyserede DNA-prøver. To smeltekurver er plottet til analyse. Den første er fluorescensens afhængighed til tiden, den anden er fluorescensfaldet til tiden. Toppen afspejler et specifikt DNA-mønster [5] .

Klassificering af brugte fluoroforer

Ikke-specifik definition: kvantitativ PCR med dobbeltstrengede DNA - bindende farvestoffer som reportere

I dette tilfælde er mærket en kemisk forbindelse, der er i stand til at inkorporere i DNA -dobbelthelixen . En sådan probe ændrer sin konformation ved interaktion med PCR-produkter og bliver en fluorofor . Produktbestemmelse kan udføres i slutningen af ​​hver cyklus før denatureringstrinnet . Et eksempel på en sådan maling er den meget brugte SYBR Green. Imidlertid vil dobbeltstrengede DNA (dsDNA) farvestoffer binde til alt dsDNA, inklusive ikke-specifikke PCR-produkter (såsom primer - dimeren ). Dette kan potentielt interferere med nøjagtigheden af ​​målsekvensovervågning [6] .

Specifik definition fluorescerende reporterprobe rediger

Fluorescerende prober detekterer kun den DNA-holdige sekvens, der er komplementær til proben; derfor øger brugen af ​​en reporterprobe i høj grad specificiteten og muliggør mere nøjagtig måling i nærvær af andet dsDNA . Fluorescerende reporterprober forhindrer dog ikke den hæmmende virkning af primerdimere, som kan undertrykke akkumuleringen af ​​målreaktionsprodukter [7] .

Det er også muligt at bruge flere prober, hvis fluoroforer har forskellige emissionsspektre . I dette tilfælde bliver det muligt at registrere et signal fra forskellige DNA-molekyler i ét rør. Metoden kaldes multiple PCR (eng. multiplex PCR ) [8] .

Metoden er baseret på introduktionen af ​​en DNA-probe komplementær til amplifikationsproduktet med en fluorescerende reporter i den ene ende af proben og en fluorescensquencher i den modsatte ende. Når quencheren er i umiddelbar nærhed af reporteren, absorberer den signalet, og reporteren fluorescerer ikke . Under amplifikation brydes probens integritet, og reporteren kan detekteres ved fluorescens efter laserexcitation. En forøgelse af mængden af ​​produkt, som reporterproben binder til i hver PCR-cyklus, forårsager derfor en proportional stigning i fluorescens . Mærker kan fluorescere i forlængelsesfasen eller i PCR-annealingsfasen [4] .

En fluorofor og dens quencher sys på sonden fra 5'- og 3'-enderne . Hvis probesekvensen ikke er særlig lang, vil de selv i den DNA-bundne tilstand interagere med hinanden, og der vil ikke blive udsendt fluorescens. Under forlængelse adskiller DNA-polymerase , som har 5'-3'-exonukleaseaktivitet (ofte anvendt Taq-polymerase ), proben fra mål-DNA'et et nukleotid ad gangen. Som et resultat af denne proces vil både fluoroforen og dens quencher komme ind i opløsningen, hvor sandsynligheden for at finde disse stoffer i nærheden vil være lille, og fluorescensen vil blive genoprettet [4] .

  1. En fluorogen hårnål  er et lille enkeltstrenget DNA-molekyle, der i sin frie tilstand er i stand til at danne en speciel rumlig struktur af DNA - en hårnål . En fluorofor er syet til den ene ende af kæden, og et stof, der slukker den, sys til den anden. Probesekvensen er komplementær til mål-DNA'et. I dette tilfælde vil de probemolekyler, der flyder i opløsningen, ikke give et fluorescerende signal, og dem, der er bundet til DNA- molekylerne, vil undergå konformationelle ændringer, hvilket vil resultere i den rumlige adskillelse af fluoroforen og dens quencher og genoprettelse af fluorescens. Registrering tilrådes at udføre efter denaturering [4] .
  2. Et mærke baseret på FRET -metoden . Grundlaget for denne metode er tilstedeværelsen af ​​to prober, der binder til mål-DNA'et i kort afstand fra hinanden. En fluorophordonor og en fluoroforacceptor sys til henholdsvis 5'-enden af ​​en probe og 3'-enden af ​​den anden probe . Når de er tæt på hinanden, absorberer donorfluoroforen lys af en bestemt bølgelængde og udsender en glød i et længere bølgelængdespektrum . Denne bølge absorberes igen af ​​acceptorfluoroforen og udsender det registrerede lys. [4] .

Ansøgning

Real-time PCR er meget brugt til mange forskningsapplikationer i laboratorier. Derudover har denne metode fundet anvendelse i medicin (til diagnosticering af sygdomme) og inden for bioteknologi (til bestemmelse af indholdet af mikroorganismer i fødevarer og plantematerialer; til påvisning af GMO'er ). qPCR bruges også til genotypebestemmelse og kvantificering af vira og andre humane patogener .

Videnskabelig forskning

Kvantificering af genekspression

qPCR bruges som en af ​​metoderne til kvantitative målinger af gentranskription . Denne metode bruges i vid udstrækning til at vurdere ændringer i ekspressionen af ​​et bestemt gen over tid , for eksempel som reaktion på administration af et lægemiddel eller ændringer i miljøforhold. Kvantificering af genekspression ved hjælp af traditionelle DNA-detektionsmetoder er upålidelig. Påvisning af mRNA ved Northern blot , gel-PCR-produkter eller Southern blot tillader ikke nøjagtig kvantificering. For eksempel, inden for 20-40 cyklusser af en typisk PCR, når mængden af ​​DNA-produkt et plateau, der ikke er direkte relateret til mængden af ​​mål -DNA i den indledende PCR [9] .

Real-time PCR kan bruges til at kvantificere nukleinsyrer ved to almindelige metoder: relativ kvantificering og absolut kvantificering [10] . Absolut kvantificering giver det nøjagtige antal mål-DNA-molekyler ved hjælp af en standardkurve . Derfor er det vigtigt, at PCR'en for prøven og standarden har samme amplifikationseffektivitet . Relativ scoring er baseret på interne referencegener ( husholdningsgener ) for at bestemme foldforskelle i målgenekspression. Kvantificeringen udtrykkes som en ændring i ekspressionsniveauer af mRNA fortolket som komplementært DNA ( cDNA , genereret af mRNA revers transkription ). Relativ kvantificering er lettere at udføre, fordi den ikke kræver en kalibreringskurve, da mængden af ​​genet, der undersøges, sammenlignes med mængden af ​​kontrolgenet [11] .

qPCR til at bestemme mængden af ​​lille nuklear RNA (snRNA)

Små nukleare RNA'er (snRNA'er) adskiller sig i egenskaber fra mRNA'er med en meget kort længde (ca. 22 nukleotider ), har ikke en konservativ sekvens i enderne, mens snRNA'er fra en population kan afvige med et eller flere nukleotider . For at løse disse problemer anvendes tilgange baseret på tilføjelse af et lille stykke DNA (linker) til cDNA i en omvendt transkriptionsreaktion . Derefter udføres real-time PCR ved standardmetoder ved anvendelse af primere, (biologi)|komplementære til linkeren [12] .

Genomiske undersøgelser ved hjælp af ChIP-qPCR

Chromatin immunopræcipitation (ChIP) i kombination med RT-qPCR anses for at være den grundlæggende metode i genomisk forskning, dens kommercielle tilgængelighed og høje nøjagtighed tillader hurtig og nem analyse af protein-DNA-interaktioner. ChIP-qPCR bruges til at undersøge specifikke gener og potentielle regulatoriske regioner såsom promotorer . Denne metode bruges i øjeblikket i forskellige undersøgelser, herunder celledifferentiering , suppressorgen- silencing og virkningen af ​​histonmodifikationer på genekspression [13] .

ChIP-analyse fanger kun en brøkdel af de mulige mål, der er til stede i hele genomet på grund af variabilitet i tværbindingseffektivitet og sterisk begrænsning af antistoftilgængelighed [13] .

For at udføre ChIP-qPCR er det nødvendigt at tilføje masterblandingen (en blanding af enzymer og nukleotider ), primere og template-DNA. I dette tilfælde er det nødvendigt nøjagtigt at vælge koncentrationen af ​​primere for effektiv amplifikation af mål-DNA'et. Enten tjener ChIP-DNA som en skabelon eller, i tilfælde af en negativ kontrol, tomme perler uden DNA. Derefter er det nødvendigt at vælge tid og temperatur for udglødningscyklusserne og starte PCR. Resultaterne analyseres på samme måde som qPCR-resultaterne ved at sammenligne tærskelantallet af cyklusser (Ct) for inputskabelonen og ChIP DNA-skabelonen [3] .

Medicinsk diagnostik

Kvantitativ PCR bruges til hurtigt at identificere gener eller DNA-fragmenter, der er markører for infektionssygdomme , genetiske abnormiteter osv. Introduktionen af ​​denne metode i kliniske laboratorier har væsentligt forbedret kvaliteten af ​​diagnosticering af infektionssygdomme [14] . Derudover bruges qPCR som et værktøj til påvisning af nyligt opståede sygdomme. For eksempel nye stammer af influenza [15] .

Brugen af ​​qPCR tillader også kvantitative målinger og genotypebestemmelse (karakterisering af stammer) af vira , såsom hepatitis B-virus [16] . Graden af ​​infektion , som måles som antallet af kopier af det virale genom pr. patientens vævsenhed , er af stor betydning. For eksempel afhænger sandsynligheden for reaktivering af herpes simplex virus type 1 af antallet af inficerede ganglier [17] .

Hos patienter med mistanke om coronavirus-infektion tages en halspodning, RNA ekstraheres og analyseres med RT-qPCR . Målgenerne er den åbne læseramme 1ab (ORF1ab) og nukleocapsidproteinet (N). En cyklustærskel (Ct-værdi) på mindre end 37 er defineret som et positivt testresultat, og en Ct-værdi på 40 eller mere er defineret som et negativt testresultat. Disse diagnostiske kriterier er baseret på anbefalingerne fra National Institute for Control and Prevention of Viral Diseases [18] .

Følsomheden af ​​RT-qPCR- testen er 83,3 %, denne test er tilbøjelig til falsk negative resultater . Computertomografi bruges også til at diagnosticere coronavirus , hvis følsomhed er meget højere og beløber sig til 97,2% [19] .

Kvantitativ PCR er også meget brugt til at påvise tumorceller i solide tumorer [20] [21] og endda i nogle former for leukæmi [22] [23] .

qPCR hjælper med påvisningen af ​​cirkulerende tumorceller . For eksempel er brystkræft stadig den hyppigste dødsårsag blandt kræftpatienter. Desuden er døden ofte forårsaget af metastaser , der er opstået . Metastaser opstår som et resultat af, at celler, der er i stand til at formere sig , adskilles fra tumoren , kommer ind i blodbanen og sætter sig igen i en del af kroppen. Disse celler kaldes cirkulerende stamceller (CSC'er). Tilstedeværelsen af ​​sådanne celler i blodet hos patienter med brystkræft er som regel forbundet med en dårlig prognose for resultatet af terapi og overlevelse generelt, derfor er det en meget vigtig diagnostisk parameter.  Men på grund af det meget lave antal er det en vanskelig opgave at identificere CVT .

Og qPCR som en meget følsom metode kan bruges til at løse dette problem. CST'er er af epiteloprindelse og udtrykker derfor et bestemt sæt gener , der adskiller sig fra de blodceller, der omgiver dem , som er af mesenkymal oprindelse. For at anvende denne metode er det nødvendigt at bestemme sættet af CST-markørgener og evaluere deres ekspressionsniveau [24] .

I mikrobiologi

Real-time PCR bruges også til mikrobiologisk arbejde inden for fødevaresikkerhed, til vurdering af kvaliteten af ​​vand (drikke- og spildevand) og inden for folkesundhed [25] . Derudover bruges denne metode til at identificere tarmmikrofloraen [26] .

Påvisning af phytopatogener

Agroindustrien producerer patogenfri frø og frøplanter for at forhindre økonomiske tab og øge produkternes holdbarhed. Derfor er der udviklet systemer til at påvise små mængder phytophthora ( Phytophthora ramorum ), oomycete og nogle andre patogener , der dræber egetræer og andre plantearter blandet med værtsplante-DNA. Evnen til at skelne mellem patogenets og værtsplantens DNA er baseret på amplifikationen af ​​ITS ( intern transkriberet spacer) sekvenser , interne transskriberede regioner placeret i den kodende region af det ribosomale RNA -gen , som er karakteristiske for hver taxon [27 ] .

Identifikation af genetisk modificerede organismer

qPCR (ved hjælp af omvendt transkription ) kan bruges til at påvise genetisk modificerede organismer , da det er mere følsomt end mange andre metoder. I dette tilfælde anvendes specifikke primere til at amplificere promotoren, terminatoren eller mellemsekvenserne, der anvendes i vektorskabelsesprocessen . Da processen med at skabe en transgen plante normalt resulterer i indsættelse af mere end én kopi af transgenet , estimeres dens mængde også normalt ved hjælp af qPCR. I dette tilfælde bruges en plante, der indeholder dette gen i en enkelt kopi, som kontrol [28] [29] .

Noter

  1. ↑ VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM Femogtyve års kvantitativ PCR til  genekspressionsanalyse //  Biotechniques : journal. - 2008. - Bd. 44 . - s. 619-626 . - doi : 10.2144/000112776 . — PMID 18474036 .
  2. ↑ Selma Gouvêa-Barros, Maria do Carmo Bittencourt-Oliveira. Semi-kvantitativ PCR til kvantificering af hepatotoksiske cyanobakterier  // Journal of Environmental Protection. - 2012. - T. 03 , no. 05 . — S. 426–430 . — ISSN 2152-2219 2152-2197, 2152-2219 . - doi : 10.4236/jep.2012.35053 .
  3. ↑ 1 2 Tae Hoon Kim, Job Dekker. ChIP–Quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR)  (engelsk)  // Cold Spring Harbor Protocols. – 2018-05. — Bd. 2018 , iss. 5 . - P.pdb.prot082628 . - ISSN 1559-6095 1940-3402, 1559-6095 . - doi : 10.1101/pdb.prot082628 .
  4. ↑ 1 2 3 4 5 Provenzano M. , Mocellin S. Komplementære teknikker: validering af genekspressionsdata ved kvantitativ realtids-PCR.  (engelsk)  // Fremskridt inden for eksperimentel medicin og biologi. - 2007. - Bd. 593 . - S. 66-73 . - doi : 10.1007/978-0-387-39978-2_7 . — PMID 17265717 .
  5. ↑ 1 2 3 4 Kubista M. , Andrade JM , Bengtsson M. , Forootan A. , Jonák J. , Lind K. , Sindelka R. , Sjöback R. , Sjögreen B. , Strömbom L. , Ståhlberg A. , Zoric N. Real - time polymerase kædereaktion.  (engelsk)  // Molecular Aspects Of Medicine. - 2006. - April ( bind 27 , nr. 2-3 ). - S. 95-125 . - doi : 10.1016/j.mam.2005.12.007 . — PMID 16460794 .
  6. ↑ Xiujuan Peng, Alex Nguyen, Debadyuti Ghosh. Kvantificering af M13 og T7 bakteriofager ved TaqMan og SYBR green qPCR  (engelsk)  // Journal of Virological Methods. – 2018-02. — Bd. 252 . — S. 100–107 . — ISSN 0166-0934 . - doi : 10.1016/j.jviromet.2017.11.012 .
  7. ↑ E. Navarro, G. Serrano-Heras, M.J. Castaño, J. Solera. Real-time PCR detektionskemi  (engelsk)  // Clinica Chimica Acta. — 2015-01. — Bd. 439 . — S. 231–250 . - doi : 10.1016/j.cca.2014.10.017 . Arkiveret 1. maj 2020.
  8. ↑ Steve F. C. Hawkins, Paul C. Gæst. Multipleksanalyser ved brug af realtids kvantitativ PCR  //  Multipleks biomarkørteknikker. — New York, NY: Springer New York, 2016-11-29. — S. 125–133 . - ISBN 978-1-4939-6729-2 , 978-1-4939-6730-8 .
  9. ↑ L. Overbergh, A. Giulietti, D. Valckx, R. Decallonne, R. Bouillon. Brugen af ​​real-time revers transkriptase PCR til kvantificering af cytokin-genekspression  // Journal of biomolecular techniques: JBT. - 2003-03. - T. 14 , nej. 1 . — s. 33–43 . — ISSN 1524-0215 . Arkiveret fra originalen den 29. april 2016.
  10. ↑ S. Dhanasekaran, T. Mark Doherty, John Kenneth, TB Trials Study Group. Sammenligning af forskellige standarder for real-time PCR-baseret absolut kvantificering  // Journal of Immunological Methods. - 31-03-2010. - T. 354 , nr. 1-2 . — s. 34–39 . — ISSN 1872-7905 . - doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . Arkiveret fra originalen den 2. marts 2019.
  11. ↑ Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). Real-time PCR-håndbog / Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). — Life Technologies (Thermo Fisher Scientific). - 2014. - S. 40-43. - 68 sek.
  12. ↑ Benes V. , Castoldi M. Ekspressionsprofilering af mikroRNA ved hjælp af real-time kvantitativ PCR, hvordan man bruger det, og hvad der er tilgængeligt.  (engelsk)  // Metoder (San Diego, Californien). - 2010. - April ( bind 50 , nr. 4 ). - S. 244-249 . - doi : 10.1016/j.ymeth.2010.01.026 . — PMID 20109550 .
  13. ↑ 12 Patrik Asp. Sådan kombineres chip med qPCR  //  Chromatin Immunoprecipitation / Neus Visa, Antonio Jordán-Pla. - New York, NY: Springer New York, 2018. - Vol. 1689 . — S. 29–42 . - ISBN 978-1-4939-7379-8 , 978-1-4939-7380-4 . - doi : 10.1007/978-1-4939-7380-4_3 .
  14. ↑ Sails AD (2009). Anvendelser i klinisk mikrobiologi. Real-Time PCR: Aktuel teknologi og applikationer . Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-39-4
  15. ↑ FDA godkender nødbrug af influenzamedicin, diagnostisk test som svar på svineinfluenzaudbrud hos mennesker. FDA News, 27. april 2009.
  16. ↑ Yeh SH , Tsai CY , Kao JH , Liu CJ , Kuo TJ , Lin MW , Huang WL , Lu SF , Jih J. , Chen DS , Chen PJ Kvantificering og genotypning af hepatitis B-virus i en enkelt reaktion ved real-time PCR og smeltekurveanalyse.  (engelsk)  // Journal of Hepatology. - 2004. - Oktober ( bind 41 , nr. 4 ). - s. 659-666 . - doi : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . — PMID 15464248 .
  17. ↑ Sawtell NM Sandsynligheden for in vivo reaktivering af herpes simplex virus type 1 stiger med antallet af latent inficerede neuroner i ganglierne.  (engelsk)  // Journal Of Virology. - 1998. - August ( bd. 72 , nr. 8 ). - P. 6888-6892 . — PMID 9658140 .
  18. ↑ Dawei Wang, Bo Hu, Chang Hu, Fangfang Zhu, Xing Liu. Kliniske karakteristika for 138 indlagte patienter med 2019 ny coronavirus-inficeret lungebetændelse i Wuhan, Kina   // JAMA . - 2020-03-17. — Bd. 323 , udg. 11 . - S. 1061 . — ISSN 0098-7484 . doi : 10.1001 / jama.2020.1585 . Arkiveret 1. april 2020.
  19. ↑ Chunqin Long, Huaxiang Xu, Qinglin Shen, Xianghai Zhang, Bing Fan. Diagnose af Coronavirus-sygdommen (COVID-19): rRT-PCR eller CT?  (engelsk)  // European Journal of Radiology. – 2020-05. — Bd. 126 . — S. 108961 . doi : 10.1016 / j.ejrad.2020.108961 . Arkiveret 14. maj 2020.
  20. ↑ Cen P. , Ni X. , Yang J. , Graham DY , Li M. Cirkulerende tumorceller i diagnosticering og behandling af bugspytkirtelkræft.  (engelsk)  // Biochimica Et Biophysica Acta. - 2012. - December ( bd. 1826 , nr. 2 ). - S. 350-356 . - doi : 10.1016/j.bbcan.2012.05.007 . — PMID 22683404 .
  21. ↑ Young R. , Pailler E. , Billiot F. , Drusch F. , Barthelemy A. , Oulhen M. , Besse B. , Soria JC , Farace F. , Vielh P. Circulating tumor cells in lung cancer.  (engelsk)  // Acta Cytologica. - 2012. - Bd. 56 , nr. 6 . - S. 655-660 . - doi : 10.1159/000345182 . — PMID 23207444 .
  22. ↑ Brüggemann M. , Gökbuget N. , Kneba M. Akut lymfoblastisk leukæmi: overvågning af minimal restsygdom som et terapeutisk princip.  (engelsk)  // Seminars In Oncology. - 2012. - Februar ( bind 39 , nr. 1 ). - S. 47-57 . - doi : 10.1053/j.seminoncol.2011.11.009 . — PMID 22289491 .
  23. ↑ DiNardo CD , Luger SM Beyond morfologi: minimal restsygdomsdetektion i akut myeloid leukæmi.  (engelsk)  // Current Opinion In Hematology. - 2012. - Marts ( bd. 19 , nr. 2 ). - S. 82-88 . - doi : 10.1097/MOH.0b013e3283501325 . — PMID 22314322 .
  24. ↑ Andergassen U. , Kölbl AC , Hutter S. , Friese K. , Jeschke U. Detektion af cirkulerende tumorceller fra blod fra brystkræftpatienter via RT-qPCR.  (engelsk)  // Kræft. - 2013. - 25. september ( bind 5 , nr. 4 ). - S. 1212-1220 . - doi : 10.3390/cancers5041212 . — PMID 24202442 .
  25. ↑ Filion, M (redaktør) (2012). Kvantitativ realtids-PCR i anvendt mikrobiologi, Caister Academic Press. ISBN 978-1-908230-01-0 .
  26. ↑ Nobre Giselle , S. Miglioranz Lucia Helena. Probiotika: Virkningerne på menneskers sundhed og nuværende udsigter   // Probiotika . - 2012. - 3. oktober. — ISBN 9789535107767 . - doi : 10.5772/50048 .
  27. ↑ Baldwin BG Fylogenetisk anvendelighed af de interne transskriberede spacere af nukleært ribosomalt DNA i planter: et eksempel fra sammensætningen.  (engelsk)  // Molecular Phylogenetics And Evolution. - 1992. - Marts ( bind 1 , nr. 1 ). - S. 3-16 . — PMID 1342921 .
  28. ↑ Holst-Jensen A. , Rønning SB , Løvseth A. , Berdal KG PCR-teknologi til screening og kvantificering af genetisk modificerede organismer (GMO'er).  (engelsk)  // Analytisk og bioanalytisk kemi. - 2003. - April ( bd. 375 , nr. 8 ). - S. 985-993 . - doi : 10.1007/s00216-003-1767-7 . — PMID 12733008 .
  29. ↑ Brodmann PD , Ilg EC , Berthoud H. , Herrmann A. Real-time kvantitative polymerase-kædereaktionsmetoder for fire genetisk modificerede majssorter og majs-DNA-indhold i fødevarer.  (engelsk)  // Journal Of AOAC International. - 2002. - Maj ( bind 85 , nr. 3 ). - s. 646-653 . — PMID 12083257 .

Litteratur

  • Glick B., Pasternak J. Molekylær bioteknologi. Principper og anvendelse. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .