Tsien, Roger

Roger Tsien
engelsk  Roger Tsien
Fødselsdato 1. februar 1952( 1952-02-01 ) [1] [2] [3] […]
Fødselssted
Dødsdato 24. august 2016( 2016-08-24 ) [1] [2] [3] […] (64 år)
Et dødssted
Land
Videnskabelig sfære biokemi
Arbejdsplads UC Berkeley
UC San Diego
Alma Mater Harvard University
Cambridge University
videnskabelig rådgiver Richard Adrian
Jeremy Sanders
Præmier og præmier ulv præmie icon.png Wolf-prisen i medicin (2004) Nobelprisen i kemi ( 2008 )
Nobel pris
Internet side tilab.ucsd.edu
 Mediefiler på Wikimedia Commons

Roger Tsien ( Roger Qian , engelsk  Roger Tsien , kinesisk 钱永健, pinyin Qián Yǒngjiàn , pall. Qian Yongjian [4] ; 1. februar 1952  – 24. august 2016 ) - amerikansk kemiker af kinesisk oprindelse, professor ved Institut for Kemi og Biochemistry University of California i San Diego [5] . I 2008 blev han tildelt Nobelprisen i kemi "for opdagelsen og arbejdet med det grønne fluorescerende protein " sammen med to andre kemikere [6] .

Biografi

Tidlige år

Roger Yongchin Tsien blev født i New York den 1. februar 1952, den yngste af tre sønner, af Xuezhu Tsien, en maskiningeniør ved Massachusetts Institute of Technology, og sygeplejerske Ying. Hans families herkomst er forbundet med en række lærde-adelsmænd fra Hangzhou , med et langt historisk dokumenteret forhold til Song-dynastiet . Desuden havde familien en usædvanlig skæbne, der afspejlede kinesiske historiske begivenheder under og umiddelbart efter Anden Verdenskrig. Dets repræsentanter gjorde ofte karriere i Vesten på trods af fiaskoer og fordomme. Så Qian Xuesen , en af ​​grundlæggerne af Jet Propulsion Laboratory ved California Institute of Technology , er en fætter til Tsiens far. Tsiens bror, Richard, er også en berømt forsker ved Stanford. Roger sagde engang:

"Jeg er født ind i dette job."

Rogers far ejede et lille handelsfirma i New York og arbejdede også som ingeniørkonsulent i Westchester County. Hans far flyttede derefter familien til Livingston, New Jersey, da Roger var otte år gammel. Der arbejdede min far på vakuumrør og petrokemikalier for Radio Corporation of America og Esso Research and Engineering.

Som barn led Tsien af ​​astma og tilbragte derfor meget tid indendørs. Han viste usædvanlig høje evner til videnskabelig viden, som siden udviklede sig til en kærlighed til teoretisk og praktisk kemi. Dette begyndte forudsigeligt med en interesse for ligandmedieret kromoforadfærd -  de farvede overgange af metalioner involveret i en lang række klassiske eksperimenter i uorganisk kemi - og manifesterede sig mest fremtrædende i forsøg på at syntetisere acetylsalicylsyre , ofte i baghaven, i husholdningsretter og med improviserede instrumenter. Roger modtog sit første spejdermærke for sine tjenester inden for kemi. Hans notesbog, hvori han skrev sine kemiske eksperimenter ned som otte-årigt barn, opbevares nu på Nobelmuseet i Stockholm [7] .

Skoleår

Talentet for kemi og kærligheden til det forblev hos den unge Roger i hans skoleår. Han afsluttede et sommerforskningsprogram ved Ohio University i 1967 med støtte fra National Science Foundation. Undersøgelsen fokuserede på de omgivende egenskaber af thiocyanat (SCN - ) som stammer fra den lignende negative ladningsfordeling mellem de nukleofile svovl- og nitrogenatomer. Denne symmetriske ladningsfordeling antydede muligheden for at danne en binding, der forbinder to eller flere metalioner gennem bindingen af ​​et N- og S-atom til henholdsvis klasse A- og B-metaller. På trods af at dette arbejde ikke bragte glæde til Roger og endda irriterede ham, modtog forskningen alligevel den højeste pris i 1968 som en del af Westinghouse Science Talent Search-konkurrencen, da han var 16 år gammel [7] .

Forskning karriereudvikling

Roger tager derefter til Harvard , hvor hans interesse for kemi blev afbrudt af universitetets liberale kunst. På universitetet mødte Tsien Walter Gilbert i molekylærbiologikurser, Jack Nichols, David Hubel (udenlandsk medlem af Royal Society of London, 1982) og Torsten Wiesel (udenlandsk medlem af Royal Society of London, 1982) i kurser i neurofysiologi af de visuelle systemer, og med Nelson Kiang ved forelæsninger om de auditive systemers neurofysiologi . Roger sluttede sig til Phi Beta Kappa i kemi og fysik i 1972, hvor han dimitterede summa cum laude (cum laude) fra Harvard med Detur-prisen. Rådene fra de ovenfor nævnte lærere førte til, at Roger med succes kvalificerede sig til et Marshall-stipendium, der dækker et ph.d.-program ved Churchill College, Cambridge University , i Physiology Laboratory.

Lederen af ​​sit Cambridge PhD-projekt, professor Richard Adrian var interesseret i den cellulære fysiologi af skeletmuskelaktivering ; hun og Tsien blev venner. Adrian var mere interesseret i at give studerende af høj intellektuel og videnskabelig kaliber en chance for at udvikle deres oprindelige ambitioner og uafhængighed end i at rekruttere underordnede, der arbejdede flittigt og uden tvivl under ledelse af hovedforskeren. Dette var generelt tilfældet i det fysiologiske laboratorium grundlagt af Hill i 1965.

I den videnskabelige tilgang arvede Tsien Adrians engagement i laboratoriearbejde og tætte relationer til et lille antal kolleger, som havde exceptionelle kvaliteter i en lille forskergruppe. Vejleder og studerende støttede hinanden: år efter eksamen holdt Roger kontakten med sin mentor indtil slutningen af ​​sidstnævntes liv.

Den studerende blev ikke tiltrukket af de tilgængelige elektrofysiologiske metoder (metoder til at registrere funktionerne i den ekstracellulære respons i individuelle neuroner inden for en enorm population af centralnervesystemet), som blev brugt i arbejdet, om end på grund af deres reaktioner på simple sensoriske stimuli. Han havde lange samtaler med Richard Adrian om anvendelsen af ​​Laplace-transformationen og kabelteorien om dendritter til analyse af elektrisk strøm i celler, der er i stand til excitation; den første dannede efterfølgende grundlaget for definitionerne af effektiv kapacitans i et distribueret netværk af membraner [8] , og diskussioner om kabelteori affødte nye "spændingsklemme"-metoder anvendt på endeløse kabler [9] .

Roger Tsien var i tæt kontakt med kemikere som Gerry Smith, Ian Baxter og Jeremy Sanders ved University Chemistry Laboratories, samt Arye Lew og John Kimura med kolleger fra Denis Haydons gruppe på Physiological Laboratory. Selvom Tsien således ikke var udadvendt af natur, fik han mange venskaber og professionelle kontakter på universitetet [7] .

Sidste år og død

I 2014 fik Tsien et slagtilfælde . Han flyttede sammen med sin kone, Wendy Globe, fra San Diego til Eugene, Oregon. To år senere, i 2016, i en alder af 64, døde Tsien, mens han kørte på cykel.

Roger Tsiens videnskabelige arv

Tsiens arbejde var helliget udviklingen af ​​forskellige metoder til måling af nøgleioner og molekyler inden for cellefysiologi. Disse metoder førte til gengæld til skabelsen af ​​værktøjer, der gjorde det muligt at lave vigtige fænomener i fysiologien og dechifrere deres mekanismer allerede i løbet af en videnskabsmands liv. Han efterlod også en kohorte af kandidater og forskere [7] .

Tsien studerede en bred vifte af små fluorescerende molekyler og fluorescerende proteiner, hvilket førte til udviklingen af ​​vigtige metoder til direkte visualisering af forskellige biokemiske nøgleprocesser i en levende celle og endda levende organismer. Disse stoffer kan indføres i cellen enten ved deres penetrerende analoger eller ved at udtrykke dem direkte i cellen ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker. Nogle af dem kan bruges som individuelle fluorescerende komponenter, andre kan bruges som interagerende par ( FRET ). Dette gjorde det muligt for dem at blive brugt til at studere en hel klasse af cellulære fysiologiske processer, lige fra spørgsmålet om, hvorvidt generne involveret i denne proces er tændt, gå videre til studiet af ekspression, translokation og interaktion mellem deltagende proteiner og slutningen med studiet af selve de fysiologiske processer, der opstår under interaktionen af ​​proteiner [7] .

Videnskabelig forskning

Postgraduate studier og yderligere forskning ved Cambridge: biofysiske metoder til overvågning af cellens fysiologiske aktivitet

Tsiens afhandling, afsluttet i 1977, "The Design and Use of Chemical Instruments in Cellular Physiology", blev tildelt den prestigefyldte Gage Prize in Biology ved Cambridge, samt et tilbud om optagelse til Comyns Berkeley Research Fellowship-programmet ved Gonville og Caius College . I denne periode begyndte Tsien udviklingen af ​​kemiske og derefter molekylærbiologiske indikatorer, der kan indføres i en celle eller udtrykkes i den for at studere dens fysiologiske processer. Denne opgave blev oprindeligt reduceret til at måle koncentrationen af ​​intracellulært calcium, selvom efterfølgende arbejde omfattede et meget bredere udvalg af ioner og molekyler. Tsiens interesse for at måle calcium kom på det helt rigtige tidspunkt: I slutningen af ​​1970'erne erkendte det videnskabelige samfund gradvist calciums rolle i cytosolen som en vigtig anden budbringer. Belysningen af ​​dens modifikation forud for triggeraktiveringen eller reguleringsstadiet og kontrollen af ​​denne proces gennem udvekslingen mellem frie og bundne cytosoliske rum, intracellulære calciumdepoter og ekstracellulært rum, har været central for at forstå mekanismen for regulering af cellulær aktivitet.

Udvikling af en elektrokemisk metode til påvisning og kvantificering af calciumioner

Dette videnskabelige problem opstod fra direkte målinger foretaget med elektroder, der er i stand til at trænge igennem det indre af en celle, der er i stand til excitation; sådanne målinger blev oprindeligt brugt til at bestemme membranpotentialer [10] . Elektroder selektive for natrium-, kalium-, hydrogen- og chloridioner var allerede tilgængelige på det tidspunkt og blev meget brugt [11] , men brugen af ​​calcium-selektive elektroder var begrænset af en række vanskeligheder. Elektroderne var underlagt kravet om høj selektivitet med hensyn til calciumioner på baggrund af andre kationer , der potentielt er til stede i systemet, herunder magnesium-, natrium- og hydrogenkationer, samt kravet om høj systemstabilitet med minimal hysterese , når calcium koncentrationsændringer. Tsien udviklede mere Ca 2+ -selektive, neutrale (i modsætning til de anvendte anioner - organiske fosfater) ligander som sensorer [12] . Desuden var elektroder med en tilstrækkelig lille spidsdiameter (ca. 0,4 mikron) [13] påkrævet for at undgå celleskade, hvilket kunne føre til en artefakt - en stigning i lokal calciumkoncentration. De høje modstande, der kræves hertil, forbundet med elektroden, i størrelsesordenen 20-30 og 60-120 GΩ i en opløsning med p(Ca 2+ ) = 3 og kræves for at bruge en spids med diametre på 1,5 eller 0,5 μm førte til gengæld til skabelsen af ​​tilpassede, specialfremstillede elektrometre med meget høj indgangsimpedans og lave stabile forspændingsstrømme (mindre end 10 fA) for at undgå falske signaler.

De eksperimentelle data opnået med de optimerede elektroder opfyldte den teoretisk forventede Nernst-relation mellem udgangsspændingen minus de samtidigt registrerede membranpotentialer og koncentrationen af ​​frit calcium op til 1 µM i 0,1 M kaliumchlorid med en respons, der varer op til 100 nM [Ca] 2+ ] (fig. 1). Disse målinger var i overensstemmelse med data opnået ved allerede etableret luminescensspektroskopi i gigantiske muskelfibre fra stangmuskler [14] og frøskeletmuskler [15] . Målinger i sidstnævnte blev foretaget under anvendelse af aequorin-fluoroforen , som indeholder tre Ca2 + -bindende EF-håndmotiver. Aequorin blev opnået fra vandmænden Aequorea victoria , fundet i Stillehavet ud for Nordamerikas vestkyst; stoffet udsender et fluorescerende blink ved excitering [16] [17] .

Optiske metoder til måling af Ca 2+ ved hjælp af udviklede organiske molekyler

Elektrodemetoder åbnede således vejen for kvantitativ bestemmelse af calcium i brede koncentrationsområder, var selektive med hensyn til calcium på baggrund af magnesium- og hydrogenioner og var anvendelige i elektrofysiologiske undersøgelser. Men for at fastslå den fysiologiske rolle af calciumioner i cellen krævedes en metode, der også kunne bruges i en lang række eksperimentelle forhold og celletyper. I denne henseende er flere optiske tilgange blevet foreslået blandt de tilgængelige fluorescensteknikker. Optiske metoder viser bedre signalstabilitet over for natriumioner og hurtigere respons sammenlignet med elektrodemetoder, hvilket gør dem velegnede til overvågning af cellulære hændelser. I modsætning til målinger på et specifikt punkt gjorde optiske metoder det også muligt at estimere calciumkoncentrationen i gennemsnit over ethvert område af interesse og karakterisere den rumlige fordeling af calciumioner ved hjælp af tilgængelig konfokal mikroskopi.

Tsiens forskning, i samarbejde med Timothy Rink og Tulio Pozzan, bidrog i høj grad til udviklingen af ​​optiske målemetoder og gjorde dem til den vigtigste tilgang, der bruges i dag i studiet af calciumcellulær fysiologi. Det var nødvendigt, at liganderne udviklet til dette formål viser sig i stand til at detektere ændringer i emissions- og absorptionsegenskaber under excitationsbetingelser, der er kompatible med signalregistreringsbetingelser og cellelivsbetingelser. Desuden bør molekylerne være specifikke for calcium og give evnen til at måle både stationære og mellemliggende koncentrationer af ionen. Det luminescerende aequorin-signal gav reproducerbare reaktioner på ikke-ligevægtskoncentrationer, men liganden havde en lav affinitet for ionen, og forholdet mellem koncentration og signal blev udtrykt ved en ligning med en potens på 2,5, hvilket i høj grad komplicerede den kvantitative fortolkning af eksperimentet , især når man studerer heterogene ionfordelinger i myoplasmaet [15] . Fluoroforer, der senere blev tilgængelige, gav højere affinitet, en bredere række af linearitet og hurtigere association med ioner (antipyrylazo-III, << 1 ms; dichlorphosphonase-III, <2 ms; arsenazo-III, 2-3 ms) - dette gjorde det muligt at spore hurtige kalkstigninger i skeletmuskulaturen [18] . Stoffer som arsenazo-III og anti-pyrylazo-III viste imidlertid variabel calciumbindingsstøkiometri, der dannede 1:2 og 2:1 komplekser afhængigt af farvestofkoncentrationen; de undergik også store ændringer i deres adsorptionsegenskaber som reaktion på magnesium- og hydrogenioner i nærvær af calcium [19] . Desuden kunne tilstedeværelsen af ​​betydelige koncentrationer af indikatoren i sig selv påvirke systemet under undersøgelse: for eksempel viste antipyrilase III og arsenazo III forskellige absorptionstidsafhængigheder efter store lange spændingsimpulser på omkring -20 mV. Dette giver grund til at tro, at en eller begge indikatorer påvirkede calciumovergange [20] . Stoffet kan også potentielt binde til cytoplasmatiske komponenter eller adskille dem i ikke-cytosoliske rum - det er mulige fortolkninger baseret på in vitro kuvettekalibreringer. Endelig krævede alle disse indikatorer introduktion i cellen, hvilket mindede om mikroelektrodemålinger. Dette ville begrænse anvendelsen af ​​metoden til kun tilstrækkeligt stærke, godt tilknyttede enkelte store celler såsom muskelfibre, gigantiske blæksprutte-axoner og Limulus -nethindeceller .

Evnen til at give specifik binding til calcium i det fysiologiske koncentrationsområde for sidstnævnte opstod fra ideen om at danne et chelatkompleks med fire carboxylgrupper i den velkendte ligand ethylenglycol-bis(beta-aminoethylether) -N,N ,N`,N`- tetraeddikesyre (EGTA) (Fig. 2a), som danner et støkiometrisk kompleks med en ion med en sammensætning på 1:1 [21] . Dette gav anledning til det rationelle design af højaffinitetsbuffere og optiske calciumindikatorer; det første skridt i udviklingen var udskiftningen af ​​methylengrupperne, der binder oxygen og nitrogen, med phenylrester. I en af ​​disse analoger, 1,2-bis(2-aminophenoxy)ethan- N,N, N` , N` -tetraeddikesyre (BAPTA), erstatter to benzenringe methylengrupperne, der forbinder N- og O-atomerne med bevarelse af den overordnede geometri, specificitet og affinitet af molekylet for calcium (fig. 2b). BAPTA er en meget anvendt og effektiv intracellulær calciumbuffer, hvis binding sammenlignet med EGTA er mindre påvirket af mediets surhedsgrad, er mere selektiv med hensyn til calcium i et magnesiummedium og har en højere hastighed for dannelse og ødelæggelse af komplekset.

Imidlertid absorberer EGTA lys i det fjerne UV-område og fluorescerer ikke. BAPTA er kendetegnet ved et UV-fluorescensspektrum, der ændrer sig ved calciumbinding og topper omkring 250 nm, hvilket ikke er godt til fluorescensanalyse. Det blev fundet, at udskiftningen af ​​en oxobenzen med en methoxyquinolinring førte til fremkomsten af ​​absorptions- og emissionsmaksima ved henholdsvis 340 og 492 nm i den nye quin-2-forbindelse (fig. 2c). Disse bølgelængder ændrede sig ikke, men fluorescensintensiteten steg med en faktor på seks, når calcium blev bundet. Målingerne blev kalibreret ved typiske hvilende cytosoliske calciumkoncentrationer (10 −7 M) og derunder, ned til 10 −8 M. Andre tilgængelige metoder på den tid havde en optimal detektion kun ved aktiverede tilstandskoncentrationer (10 −6 M), så hvordan signaler i hvile var allerede under detektionsgrænsen.

Endelig resulterede inkubation af celler i opløsninger indeholdende en membranpermeabel acetomethoxyether (AM)-del bundet til quin-2 (quin-2-AM) i en atraumatisk, permanent indtræden af ​​stoffet i cellen uden mikromanipulation eller membranafbrydelse. Efter at molekylet kom ind i cellen, skar endogene esteraser esterkomponenten ud og frigav den aktive tetraanion (7), som ikke passerede gennem membranen (fig. 2d). Stigningen i fluorescensintensitet med stigende calciumkoncentration kunne overvåges ved anvendelse af et konventionelt kuvettespektrofotometer. Således har quin-2 fået en nøglerolle i måling af cytosolisk calcium i en lang række pattedyrceller og deres suspensioner, herunder lymfocytter, blodplader, spermatozoer, neutrofiler og makrofager, især når man studerer calciums rolle i signal-respons-processen [22] [23] . I fremtiden blev denne metode til at introducere esterificerede, membranpermeable derivater i cellen udvidet til at studere funktionerne af kandidatmolekyler til rollen som cellulære budbringere, såsom phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat, i cellefysiologi [24 ] .

UC Berkeley: Nye ligander til at måle og manipulere intracellulært calcium og andre ioner

Muligvis på grund af vanskelighederne med at finde beskæftigelse og uklare jobmuligheder, der opstod for forskere, der beskæftigede sig med tværfaglig forskning i Storbritannien, accepterede Tsien i 1981, efter så betydelig forskning, en invitation til at få et job i Institut for Fysiologi og Anatomi ved Universitetet i Californien i Berkeley (på det tidspunkt blev afdelingen ledet af Terry Manchen) i takt med adjunkt. Tsien arbejdede der i otte år, et af arbejdsområderne var videreudvikling og optimering af calciumfølsomme ligander i samarbejde med Steven Adam og Robert Zucker. Takket være dette projekt blev mange reagenser, der er ekstremt udbredte i cellefysiologi, introduceret i kommerciel produktion. Alle kom ind i cellerne efter inkubation af det undersøgte system med de tilsvarende AM-derivater. Stoffer, der kombinerede en 8-koordineret tetracarboxylat-chelaterende del med en stilben-kromofor gav forbedret calciumselektivitet i forhold til andre dobbeltladede kationer og kun lidt lavere affinitet end quin-2 [21] . Affiniteterne for disse stoffer varierede fra Kd = 100 nM (quin-2) til Kd = 90 μM (fluor-5N), hvilket dækkede typiske fysiologiske calciumkoncentrationer i en lang række exciterede og hvilende celletyper. Højere excitationsbølgelængder sammenlignet med quin-2 (339 nm) gjorde det muligt at undgå ultraviolet bestråling af celler, hvilket kunne føre til autofluorescens af den exciterede celle og forårsage dens skade. Introduktionen af ​​ethylengruppen af ​​stilben i den heterocykliske ring forbedrede kvanteudbyttet og fotokemisk stabilitet - fluorescensintensiteten kunne stige op til 30 gange. Denne forbedring i ekstinktionskoefficient og kvanteudbytte sammenlignet med quin-2 (<5000 og 0,03 i forhold til henholdsvis 0,14) reducerede også mængden af ​​mærkning, der kræves i systemet (i tilfælde af quin-2 taler vi altså om millimolær koncentrationer). Faktum er, at store mængder potentielt kan danne et buffersystem med intracellulært calcium og forstyrre processen under undersøgelse.

Udover at ændre stoffernes fluorescensintensitet ændrede sig endelig også bølgelængderne af calciumbindingen, mens quin-2 kun producerede ændringer i signalstyrken (dette gjorde målingen følsom over for variationer i bestrålingsintensitet, signaldetektion, ligandkoncentration, og effektiv celletykkelse i optisk stråle). Målinger ved hjælp af spektrale skift i absorptions- og/eller emissionsområdet gjorde det muligt at omgå disse kilder til artefakter [25] . Således havde indo-1 en dobbelt emissionstop med et hovedskift fra 475 til 400 nm efter calciumbinding. Indo-1 har fundet bred anvendelse i flowcytometri (fig. 3a). Fura-2 udsender kun ved en bølgelængde på 510 nm, men excitationstoppen skifter fra ca. 380 til 350 nm ved binding, og intensitetsforholdet er direkte relateret til ionkoncentrationen. Det høje fotonudbytte af denne forbindelse gjorde den praktisk at bruge selv med videooptagelse i realtid af den lokale koncentration af intracellulært calcium [26] (fig. 3b).

Disse resultater gav anledning til skabelsen af ​​en bred klasse af nye detektormolekyler af forskellige ioner og molekyler involveret i fysiologiske processer [27] . For det første gjorde disse nye varianter det muligt at måle koncentrationen af ​​calcium under forskellige forhold og celletyper. Fluo-3-signalet optages i det synlige område ved excitation med en argonlaser ved 488 nm, stigende ved binding ved et emissionsmaksimum ved 525 nm, hvilket er tæt på værdierne, der er påvist i målinger med fluorescein-isothiocyanat (FITC) ( Fig. 3c). Dens hurtigere dissociation sammenlignet med fura-2 gør det muligt at spore den hurtige kinetik af calcium i skelet- og hjertemuskler. Dette har været særligt nyttigt ved optagelse af mikroskopiske calciumfrigivelseshændelser ("calciumglimt") ved hjælp af konfokal mikroskopi.28 Funktionen er også blevet brugt til at optage de resulterende skjulte Ca 2+ -udbredende bølger, hvilket afspejler øget calciumfrigivelse fra ryanodin-receptorer i det sarkoplasmatiske retikulum , som opstår på grund af manglen på konjugation af kanaler med en transmembran dihydropyridinreceptor i skelet [29] eller proarytmiske omstændigheder i hjertemuskler [30] [31] .

For det andet blev det muligt at påvise og måle koncentrationen ikke kun for intracellulært calcium, men også for andre deltagere i processerne. For eksempel var carboxylgrupperne i carboxyfluorescein-derivatet 2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(u-6)-carboxyfluorescein (BCECF) mere egnede til at bestemme hydrogenioner end calcium. Tilgængeligheden af ​​BCECF blev opnået af en cellegennemtrængende AM-analog, og selve stoffet havde en enkelt emissionstop (535 nm) og en dobbelt excitationstop (ca. 490 og 440 nm). Dets pKa ( ca. 6,98) og lineære respons mellem pH 6,4 og 7,4 sikrede dets anvendelighed i cellulær fysiologi i gastriske parietalceller [32] .

For det tredje kunne lys reversibelt frigive calcium fra Nitr-2 og senere udviklede Nitr-5 og DM-nitrofen [33] . Nitr-2 består af en calciumchelaterende BAPTA koblet til en nitropiperonylgruppe, der er i stand til at gennemgå fotolyse ved nær ultraviolet lys (300-400 nm). Denne hændelse ændrer signifikant calciumdissociationskonstanten fra 160 og 630 nM til 7 og 18 µM ved en ionstyrke på henholdsvis 0,1 og 0,3 M, hvilket frigiver bundet calcium og ændrer således koncentrationen af ​​intracellulært calcium [34] (fig. 4a-c) ). Egenskaben har fundet anvendelse i den fotokemiske kontrol af ionstrømme i neuroner [35] . Tsien udviklede derefter denne tilgang til andre bioaktive controllere, og rumlig opløsning blev opnået ved at fokusere laserkilden til excitation i tre koordinater. Som et resultat forbedrede kobling af bromerede 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyler med kandidatmediatorer frigivelsesudbyttet ved brug af to-foton, infrarød (i modsætning til UV) excitation og gjorde det for første gang muligt at opnå et tredimensionelt kort af glutamatfølsomhed i sektioner af rottekortikale hjerneneuroner [36] .

Udvikling af fluorescerende proteinmarkører

Allerede før Tsien flyttede til San Diego i 1989, udløste Alexander Glasers arbejde med fluorescerende phycobiliproteiner hans interesse for fluorescerende cAMP-sporing. Han betragtede naturlige cAMP-bindende proteiner som grundlaget for et fluorescerende mærke: dette kunne umiddelbart give de nødvendige affiniteter og selektiviteter. I fravær af cAMP er phosphokinase A (PKA) inaktiv, og dens regulatoriske og katalytiske underenheder er tæt koblet (fig. 5). Binding af cAMP til regulatoriske underenheder fører til dissociation og katalytisk aktivering, som tillader overførsel af fosfat fra ATP til visse specifikke proteiner. Ved at give enzymet et optisk signal for sådanne bindingsbegivenheder bragte Roger tilbage til hans universitetsinteresser i fluorescerende resonansenergioverførsel (FRET) mellem to lysfølsomme kromoforer, der er sterisk tæt på hinanden. En exciteret donorkromofor kan overføre energi til en acceptor på grund af ikke-strålende dipol-dipol-interaktion. Dette system blev konstrueret ved at fæstne en type 1 fluorofor til den regulatoriske underenhed og en type 2 fluorofor til den katalytiske underenhed. FRET kunne opstå i intakt PKA med tæt kontakt mellem underenheder af de to typer, men burde være forsvundet ved dissociation efter cAMP-binding: så ville signalerne i disse to situationer blive observeret ved forskellige bølgelængder. Disse eksperimenter, udført med gruppen af ​​Suzanne Taylor, var karakteriseret ved hårdt arbejde, der krævede stor udholdenhed: store mængder rekombinante PKA-underenheder var nødvendige. På trods af vanskelighederne var projektet vellykket og gav anledning til en metode, hvor fluorescein-mærkede katalytiske underenheder binder til rhodamin-mærkede regulatoriske underenheder for at danne cAMP FRET-sensorer [37] . Denne metode har fundet anvendelse i undersøgelsen af ​​osteoblaster [38] , melanocytter [39] og Aplysia- neuroner [40] .

Ved University of California i San Diego: udvikling af genetisk kodede makromolekylære indikatorer

Brugen af ​​fluorescerende proteiner komplementerede således elegant klassen af ​​ligander med lille molekylvægt. Imidlertid skulle de nødvendige proteiner udtrykkes og oprenses i enorme mængder for selektivt at vedhæfte to forskellige mærker in vitro til forskellige proteindomæner eller underenheder, samtidig med at proteinernes funktioner blev bibeholdt. Derudover skulle proteiner i tidligere arbejde også indføres i cellen. Disse vanskeligheder tvang forskere til at udvikle indikatorer kodet direkte i genomet - i dette tilfælde var det kun nødvendigt at introducere gener, der koder for to fluorescerende proteiner af den rigtige farve, i cellerne, der blev undersøgt. Denne tilgang havde meget lavere krav og involverede anvendelse af etablerede procedurer til transfektion af celler med en lille mængde DNA (sammenlignet med introduktion af protein) med efterfølgende selektiv selektion af transficerede celler. Denne opgave henledte Tsiens opmærksomhed på vandmænden Aequorea victoria (for anden gang) , en kilde til aequorin [16] så nyttig i klassiske fysiologiske eksperimenter. Shimomura opdagede, isolerede og rensede grønt fluorescerende protein (GFP) fra cirka 10.000 individer, efterfulgt af karakterisering af dets fysisk-kemiske egenskaber, herunder spektral, under forskellige forhold. Han viste, at GFP er en FRET-excitationsacceptor fra aequorindonor og producerer in vivo fluorescens i den grønne region af spektret, forskellig fra det blå signal fra det oprensede aequorinpræparat ved excitation i UV-regionen [41] . Shimomura identificerede også en kromofor p -hydroxybenzylidenimidazolin-del i proteinkæden [42] .

Karakteriseringen af ​​en del af GFP-genet af Douglas Prasher [43] indledte et samarbejde i forskellige laboratorier. Roger har arbejdet på produktionen og fluorescensegenskaberne af GFP ved hjælp af Saccharomyces cerevisiae i samarbejde med Roger Heim og Scott Emre. Martin Chalfie (Foreign Fellow of the Royal Society of London, 2018) fra staten Columbia, som først demonstrerede den UV-inducerede fluorescens af GFP injiceret i hvirvelløse celler og foreslog den potentielle brug af proteinet som en biomarkør, har arbejdet på dets udtryk i Escherichia coli og Caenorhabditis elegan. Tsiens forskning resulterede i opdagelsen af ​​en Y66H (BFP) mutant med forbedret stabil blå fluorescens i forhold til den oprindelige vildtype GFP. Yderligere modifikationer af proteinet, stereokemisk imødekommende tryptophan, førte til fremkomsten af ​​Y66W-mutanten, der koder for det cyanfluorescerende protein (CFP) [44] [45] (fig. 6a). I FRET-parret førte konformationelle ændringer i strukturen af ​​UV-exciteret BFP til energioverførsel til GFP (fig. 6b). Dette indebar GFP's evne til at blive exciteret af de blå bølgelængder, der udsendes af BFP-donoren. GFP-excitationsspektret havde dog en stor top i UV og en lille top i den blå region. Problemet blev løst ved at skabe en mutant GFP-variant: den uønskede top i UV-regionen forsvandt, og det blå steg ca. 5-6 gange med et efterfølgende +10 nm-skift efter S65T-mutationen [45] . I et forsøg på at teste hypotesen introducerede forskerne en peptidbinding mellem BFP og GFP-S65T-mutanten, såvel som andre mutanter, der har en lignende excitationsprofil som GFP-S65T. Selektiv UV-excitation af BFP resulterede faktisk i forskellige typer af grøn og blå emission i nærvær eller fravær af FRET-overførsel før og efter proteintrypsinolyse. Yderligere test bekræftede, at S65T er den optimale fluorofor, når F64L-mutationen introduceres, hvilket giver strukturretention og foldning ved højere temperaturer [46] . Denne dobbeltmutant, omtalt som "forbedret (S65T-F64L) GFP", er kommercielt tilgængelig fra Clontech.

Strukturelle undersøgelser af GFP-S65T afslørede en cylindrisk struktur med en diameter på 2,4 nm og en længde på 4,0 nm, inklusive 11 β-strenge, der omgiver en aksialt forlænget helix, i hvis centrum en kromofor blev indsat [47] (fig. 7 ) ). Således var grupperingen beskyttet mod virkningerne af opløsningsmidlet og fremmede enzymer, men inde i hulrummet var der plads til den potentielle introduktion af en aromatisk ring, som ville blive forbundet ved at stable med kromoforen; dette blev senere verificeret ved at introducere en række mutationer, inklusive T203Y, spektret af denne variant havde excitations- og emissionsskift på ca. 20 nm. Det resulterende gule fluorescerende protein (YFP) og dets yderligere mutantvarianter viste sig at være gode signalacceptorer fra CFP, der dannede alternative CFP/YFP-par.

Roger bekræftede også dannelsen af ​​en kromofor p -hydroxybenzylidenimidazolin-del fra resterne S65, Y66 og G67 i GFP-kæden [31] . Mekanismen for kromoforens fremkomst involverede en overraskende de novo -dannelse af en heterocyklus med dehydrogenering af α-β C-C-bindingen til dannelse af en dobbeltbinding. Til dette var der brug for en brintacceptor - Tsien mente, at det var atmosfærisk ilt. Dyrkning af GFP-producerende bakterier under anaerobe forhold førte til, at det syntetiserede protein ikke havde fluorescens, men det manifesterede sig flere timer efter udsættelse af proteinet for luft [44]  , en egenskab som senere fandt sin anvendelse i undersøgelsen af fysiologi.

Oprettelse af detektorproteiner ved at parre "FRET donor" - "acceptor GFP protein"

Anvendelsen af ​​FRET-billeddannelse af specifikke intracellulære signaler krævede koblingen af ​​FRET-komponenter til et molekyle, der specifikt ville binde den cellulære komponent under undersøgelse. I samarbejde med Atsushi Miyawaki forsøgte Roger at binde donor- og acceptorproteinerne til modsatte ender af det cytosoliske domæne af den nyligt klonede inositol-1,4,5-triphosphat (InsP3) receptor. Mest sandsynligt var dette arbejde en afspejling af hans interesse for kemisk signalering mellem cellemembraner. Projektet førte til en forståelse af, hvordan denne vigtige budbringer virker i skeletmuskulaturen i excitations-kontraktionsforbindelsen [48] , og hvordan Ca 2+ influxfaktoren [49] virker , hvilket giver transduktion fra intracellulære Ca 2+ depoter til membranoverfladen af depotdrevet Ca 2 + port [50] . I tilfælde af signalering blev det efterfølgende bevist, at processen forløber under påvirkning af direkte, snarere end kemisk, kobling mellem overflade-L-type calciumkanaler og intracellulære sarkoplasmatiske retikulære ryanodin-calciumfrigivelsesreceptorer [51] . Imidlertid tvang de vanskeligheder, der opstod på grund af den ufuldstændige forståelse af mekanismen for InsP3-binding til receptorer, Tsien til at rette sin opmærksomhed mod udviklingen af ​​andre intracellulære calciumdetektorer sammen med Mitsushiko Ikura. Dette arbejde involverede at fæstne BFP og derefter CFP til N-terminalen af ​​calmodulin (CaM). S65T og derefter YFP blev tværtimod knyttet til C-terminalen af ​​mål-M13-peptidet. Den endelige struktur blev opnået ved at kombinere CaM- og M13-fragmenter [52] [53] .

Genetisk kodede mærker ("kamæleoner") opnået på denne måde, der er i stand til langtidsbrug og anvendelige til enhver celle eller organisme, hvori sådan DNA kan indføres, førte til fremkomsten af ​​en af ​​de mest populære metoder til sporing af aktivitet i identificeret neuroner og udvidede rækken af ​​undersøgte objekter til intakte nervesystemer. Desuden har de rykket grænserne for de anvendte biologisk vigtige molekyler. En betydelig indsats fra forskere har ført til opdagelsen af ​​linkere, der sikrer fusionen af ​​fluorescerende proteiner med PCA, samtidig med at underenhedernes evne til at reagere på tilstedeværelsen af ​​cAMP opretholdes. Sådanne proteiner kunne visualisere den subcellulære fordeling af cAMP i cardiomyocytter efter stimulering med katekolaminer [54] . Endelig var en modificeret kamæleon, hvor M13 blev erstattet af et kinasesubstratpeptid og CaM af et proteindomæne indeholdende et phosphoaminosyrebindende domæne, der kan binde phosphoryleret serin, threonin eller tyrosin, i stand til at visualisere aktiviteten af ​​kinaser, der specifikt phosphorylerer serin, henholdsvis threonin eller tyrosin. Fosforylering af disse rester af kinasen fører til dannelsen af ​​et kompleks, hvor afstanden eller orienteringen mellem donor- og acceptorproteinerne ændres [55] . Snart blev denne metode uundværlig i forskningspraksis.

Færdiggørelse af paletten af ​​farver af fluorescerende proteiner; udvidelse af anvendelsesområdet for FRET til måling af membranpotentiale

Yderligere udviklinger har tilføjet arsenalet af fluorescerende proteiner, der dækker en bred vifte af spektret og muliggør fotoswitching [56] [57] [58] . Opdagelsen og tilgængeligheden af ​​genet, der koder for koralrødt fluorescerende protein (DsRed) [59] fik Roger til at gå ud over GFP i sin forskning. DsRed er en tetramer, hvis kromofor-del begynder på samme måde som i GFP. Yderligere dehydrogenering fører imidlertid til dannelsen af ​​acylimin, som kun er stabil i miljøet af det intakte protein og viser et langbølgelængdeskift i absorptions- og emissionsspektrene [60] [61] . Ved styret evolution blev der skabt et monomert rødt fluorescerende protein (RFP), som er mindre kræsent for fusion med andre proteiner sammenlignet med tetrameren og blev grundlaget for et helt sæt af monomere proteiner, hvis emissionsmaksima dækkede resten af ​​det synlige spektrum. op til 648 nm [62] .

Roger havde også en hånd med at manipulere selve FRET-teknikken og forfølge sine tidlige forskningsinteresser i optiske målinger af membranpotentiale. Dette har været i stand til at forbedre veletablerede, men ofte relativt langsomme eller ufølsomme metoder baseret på en enkelt indikatorfluorofor. En to-komponent, FRET-baseret tilgang brugte fluorescerende lectiner som en donor, og senere coumarin-mærket phosphatidylethanolamin bundet til den ydre side af membranen (fig. 8). Donorer overførte energi til en ladet transmembran bis(1,3-dihexyl-2-thiobarbiturat)tri (eller penta)methinoxonol-acceptor, når den passerede fra ydersiden af ​​membranen til indersiden på grund af ladningen, da membranpotentialet ændrede sig. Denne tilgang gjorde det muligt at opnå hidtil uset følsomhed (for hver 100 mV steg fluorescenssignalet med mere end 50%) og korte tidskonstanter (mindre end 0,4 ms) sammenlignet med andre optiske indikatorer [63] .

Fra cellulær fysiologi til systemfysiologi, translationel medicin og formidling af nye indikatorer

Mod slutningen af ​​sin videnskabelige karriere var Tsien i stand til at udvikle sådanne optiske analyseværktøjer, der blev brugt med særlig succes i studiet af hele organer eller endda dyr. Disse værktøjer kan potentielt bruges inden for klinisk, neurokirurgisk, kardiovaskulær eller onkologisk medicin. Nogle af dem blev udviklet i samarbejde med Nguyen Thao Quyen ( vietnamesisk: Quyến Thẩm Nguyễn ) . Et nyt fluorescerende mærket F-NP41-molekyle, som let indføres i cellen og binder til nerven, og som er rettet mod at interagere med basalmembranproteinet laminin, kan forbedre den operationelle visualisering af kronisk trunkerede nerver [64] [65] , potentielt forenkling af design og kirurgisk implementering af "reparation" nerver [66] [67] . En mærkningsteknik for positronemissionstomografi ved brug af injicerede erytrocytter mærket med et positron-emitterende, multimodalt fluorescerende mærke kunne potentielt bruges til at påvise intrakraniel blødning som et alternativ til 99mTc-mærkede stoffer [68] og kunne være nyttig i eksperimentelle NMR-undersøgelser af cerebrale processer. [69] . Introduktionen af ​​membrangennemtrængende peptider, der viser signifikante ændringer i fluorescens efter at være blevet skåret af tumorassocierede proteaser inde i cellen, kunne potentielt hjælpe i den tidlige diagnose af maligne læsioner [70] . Det har vist sig, at både disse aktiverende peptider og deres gadolinium-bundne dendrimere former selektivt akkumuleres i tumorceller, hvilket forbedrer påvisningen af ​​sidstnævnte og tilbyder et middel til deres fremtidige NMR-diagnose [71] . Aktiverende peptider er på lignende måde blevet brugt til selektivt at levere anti-tubulin-radiosensibilisatoren monomethylauristatin E til tumorceller, hvilket åbner en ny terapeutisk horisont for disse midler [72] .

Gennem hele sin karriere har Tsien forsøgt at gøre de ligander, han udviklede, tilgængelige for kolleger. I den tidlige udvikling af quin-2 formåede Roger ikke at overbevise UK National Research and Development Corporation om den kommercielle værdi af en generaliseret struktur, der er følsom over for calcium, med hidtil uset præcision og selektivitet. Senere udtrykte Lancaster Synthesis (nu en del af Johnson Matthey Company Alfa Aesar) interesse for quin-2 og dets AM-derivat. Et af resultaterne af Rogers videnskabelige aktivitet er omkring 160 amerikanske patenter. Tsien grundlagde også flere virksomheder: sammen med Charles Zucker skabte han Aurora Biosciences Corporation, som producerer værktøjer til lægemiddelopdagelse ved hjælp af fluorescerende markører, og Senomyx, som er engageret i søgningen efter smagsløgsmodulatorer. Takket være hans patenter har andre mennesker også været i stand til at danne virksomheder, såsom Molecular Probes.

Hæder og priser

Nobelprisen

Roger delte 2008 Nobelprisen i kemi med Osamu Shimomura ( Woods Hole Marine Biological Laboratory ) og Martin Chalfie ( Columbia University , USA). Udvalgets formulering understregede specifikt Tsiens bidrag til at forstå de fluorescerende egenskaber af GFP og relaterede proteiner, hvilket førte til deres anvendelse i studiet af dynamiske processer i levende systemer. Til ære og respekt for Douglas Prasher, som først begyndte opgaven med at studere GFP, inviterede han Tsien til ceremonien.

Andre priser

Medlemskab af organisationer og foreninger

Familie

Tsien var gift med Wendy Globe. Roger havde ingen egne børn; opdraget sin stedsøn Max Rink med sin kone.

Personlige egenskaber

Ifølge hans ven Christopher Huang delte Tsien og hans vejleder Richard Adrian "lignende videnskabelige og personlige værdier, adfærd, en venlig, generøs, respektfuld holdning til verden og en yderst ærlig og human holdning til andre."

Interesser og hobbyer

Engageret i amatørfotografering. Han elskede udendørs aktiviteter.

Se også

Noter

  1. ↑ 1 2 3 4 https://www.washingtonpost.com/national/health-science/roger-y-tsien-chemist-shared-nobel-for-tool-to-research-alzheimers-dies-at-64/2016 /08/31/90ca6de8-6fc9-11e6-8533-6b0b0ded0253_story.html
  2. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Encyclopædia  Britannica
  3. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Brockhaus Encyclopedia  (tysk) / Hrsg.: Bibliographisches Institut & FA Brockhaus , Wissen Media Verlag
  4. ↑ 钱永健研水母发光盼助治癌(utilgængeligt link) . Lianhe Zaobao . Hentet 8. oktober 2008. Arkiveret fra originalen 25. december 2018. 
  5. ↑ Roger Y. Tsien ved University of California, San Diego  (link ikke tilgængeligt)  (link ikke tilgængeligt)
  6. ↑ Nobelpriskomiteens hjemmeside . Hentet 8. oktober 2008. Arkiveret fra originalen 26. oktober 2012.
  7. ↑ 1 2 3 4 5 Huang CL-H. Roger Yonchien Tsien. 1. februar 1952 - 24. august 2016 // Biogr. Mems faldt. R. Soc., 2018, v. 65, s. 405-428.
  8. ↑ Adrian RH, Almers W. Måling af membrankapacitet i skeletmuskulatur.// Nat. New Biol., 1973, v. 242, s. 62-64.
  9. ↑ Adrian, RH, Marshall, MW Natriumstrømme i pattedyrs muskler // J. Physiol., 1977, v. 268, s. 223-250.
  10. ↑ Adrian RH Effekten af ​​intern og ekstern kaliumkoncentration på membranpotentialet i frømuskel. // J. Physiol., 1956, v. 133, s. 631-658.
  11. ↑ Thomas R. Ionfølsomme intracellulære mikroelektroder. New York, NY: Academic Press, 1978.
  12. ↑ Tsien RY, Rink TJ Neutrale bærerion-selektive mikroelektroder til måling af intracellulært frit calcium. // Biochim. Biofys. Acta Biomembr., 1980, v. 599, s. 623-638.
  13. ↑ Tsien RY Væskesensorer til ion-selektive mikroelektroder. // Trends Neurosci., 1980, v. 3, s. 219-221.
  14. ↑ Tsien RY, Ashley C., Rink TJ Ændringer i frit Ca under muskelkontraktion, målt med en intracellulær Ca-selektiv elektrode // J. Physiol., 1978, v. 280, s. 27.
  15. ↑ 1 2 blinker JR, Rüdel R., Taylor SR Calciumtransienter i isolerede paddeskeletmuskelfibre: påvisning med aequorin // J. Physiol., 1978, v. 277, s. 291-323.
  16. ↑ 1 2 Shimomura O., Johnson F., Saiga Y. Ekstraktion, oprensning og egenskaber af aequorin, et bioluminescerende protein fra den lysende hydromedusan, Aequorea // J. Cell Comp. Physiol., 1962v. 59, s. 223-239.
  17. ↑ Shimomura O. Luminescens af aequorin udløses af bindingen af ​​to calciumioner // Biochem. Biofys. Res. Commun., 1995, v. 211, s. 359-363.
  18. ↑ Csernoch L., Huang CL-H., Szucs G., Kovacs L. Differentielle virkninger af tetracain på ladningsbevægelser og Ca2+ signaler i frøens skeletmuskulatur // J. Gen. Physiol., 1988, v. 92, s. 601-612.
  19. ↑ Baylor SM Optiske undersøgelser af excitations-kontraktionskobling ved brug af spændingsfølsomme og calciumfølsomme prober // Comp. Physiol., 2011 (originalpublikation: Handb. Physiol., Skelet. Muscle Suppl., 1983, v. 27, s. 355-379).
  20. ↑ Palade P., Vergara J. Arsenazo-III og antipyrylazo-III calciumtransienter i enkelte skeletmuskelfibre // J. Gen. Physiol., 1982, v. 79, s. 679-707.
  21. ↑ 1 2 Tsien RY Nye calciumindikatorer og buffere med høj selektivitet over for magnesium og protoner: design, syntese og egenskaber af prototypestrukturer // Biochemistry, 1980, v. 19, s. 2396-2404.
  22. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink TJ T-celle mitogener forårsager tidlige ændringer i cytoplasmatisk fri Ca2+ og membranpotentiale i lymfocytter. Nature, 1982, v. 295, s. 68-71.
  23. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink TJ Calciumhomeostase i intakte lymfocytter: cytoplasmatisk frit calcium overvåget med en intracellulært fanget fluorescerende indikator // J. Cell Biol., 1982, v. 94, s. 325-334.
  24. ↑ Tsien RY, Jiang T., Sweeney G., Rudolf MT, Klip A., Traynor-Kaplan A. Membrangennemtrængende estere af phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, s. 11 017-11 024.
  25. ↑ Tsien RY, Grynkiewicz G., Poenie M. En ny generation af Ca2+ indikatorer med stærkt forbedrede fluorescensegenskaber // J. Biol. Chem., 1985, v. 260, s. 3440-3450.
  26. ↑ Cannell MB, Berlin JR, Lederer WJ Intracellulært calcium i hjertemyocytter: calciumtransienter målt ved hjælp af fluorescensbilleddannelse // Soc. Gen. physiol. Ser., 1987, v. 42, s. 201-214.
  27. ↑ Haugland R. The molecular probes handbook: a guide to fluorescerende prober og mærkningsteknologier // . ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA, 2010 s. 99-121. Adgangstilstand: https://www. thermofisher.com/uk/en/home/references/molecular-probes-the-handbook.html. Hentet 6. juni 2018.
  28. ↑ Cheng H., Lederer MR, Xiao RP, Gómez AM, Zhou YY, Ziman B., Spurgeon H., Lakatta EG, Lederer WJ Excitation-kontraktionskobling i hjertet: ny indsigt fra Ca2+ gnister // Cell Calcium, 1996, v. . 20, s. 129-140.
  29. ↑ Chawla S., Skepper JN, Hockaday AR, Huang, CL-H. Calciumbølger induceret af hypertoniske opløsninger i intakte frøskeletmuskelfibre // J. Physiol., 2001, v. 536, s. 351-359.
  30. ↑ Goddard CA, Ghais NS, Zhang Y., Williams AJ, Colledge WH, Grace AA, Huang CL-H. Fysiologiske konsekvenser af P2328S-mutationen i ryanodinreceptorgenet (RyR2) i genetisk modificerede murine hjerter // Acta Physiol., 2008, v. 194, s. 123-140.
  31. ↑ 1 2 Cody CW, Prasher DC, Westler WM, Prendergast FG, Ward WW Kemisk struktur af hexapeptidkromoforen af ​​Aequorea grønt-fluorescerende protein // Biochemistry, 1993, v. 32, s. 1212-1218.
  32. ↑ Tsien RY, Paradiso AM, Machen TE Na±H+-udveksling i gastriske kirtler som målt med en cytoplasmatisk fanget, fluorescerende pH-indikator // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1984, v. 81, s. 7436-7440.
  33. ↑ Zucker RS​Effekter af fotolabile calciumchelatorer på fluorescerende calciumindikatorer // Cell Calcium, 1992, v. 13, s. 29-40.
  34. ↑ Tsien RY, Zucker RS-Kontrol af cytoplasmatisk calcium med fotolabile tetracarboxylat-2-nitrobenzhydrol-chelatorer // Biophys. J., 1986, v 50, s. 843-853.
  35. ↑ Gurney AM, Tsien RY, Lester HA Aktivering af en kaliumstrøm ved hurtige fotokemisk genererede trinstigninger af intracellulært calcium i sympatiske rotte-neuroner // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1987, v. 84, s. 3496-3500.
  36. ↑ Tsien RY, Furuta T., Wang SS-H., Dantzker JL, Dore TM, Bybee WJ, Callaway EM, Denk W. Brominerede 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: fotolabile beskyttelsesgrupper med biologisk nyttige tværsnit til to- fotonfotolyse // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1999, v. 96, s. 1193-1200.
  37. ↑ Tsien RY, Adams SR, Harootunian AT, Buechler YJ, Taylor SS Fluorescensforhold billeddannelse af cyklisk AMP i enkeltceller // Nature, 1991, v. 349, s. 694-697.
  38. ↑ Tsien RY, Civitelli R. , Bacskai BJ, Mahaut-Smith MP, Adams SR, Avioli LV Enkeltcelleanalyse af cyklisk AMP-respons på parathyroidhormon i osteoblastiske celler // J. Bone Min. Res., 1994, v. 9, s. 1407-1417.
  39. ↑ Tsien RY, Sammak PJ, Adams SR, Harootunian AT, Schliwa M. Intracellulær cyklisk AMP, ikke calcium, bestemmer retningen af ​​vesikelbevægelse i melanoforer: direkte måling ved billeddannelse af fluorescensforhold // J. Cell Biol., 1992, v. 117, s. 57-72.
  40. ↑ Tsien RY, Bacskai BJ, Hochner B., Mahaut-Smith M., Adams SR, Kaang BK, Kandel ER Rumligt opløst dynamik af cAMP og proteinkinase A-underenheder i Aplysia sensoriske neuroner // Science, 1993, v. 260, s. 222-226.
  41. ↑ Morise H., Shimomura O., Johnson FH, Winant J. Intermolekylær energioverførsel i det bioluminescerende system af Aequorea // Biochemistry, 1974, v. 13, s. 2656-2662.
  42. ↑ Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green-fluorescerende protein // FEBS Lett., 1979, v. 104, s. 220-222.
  43. ↑ Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ Primær struktur af Aequorea victoria grønt-fluorescerende protein // Gene, 1992, v. 111, s. 229-233.
  44. ↑ 1 2 Heim TR, Prasher DC, Tsien RY Bølgelængdemutationer og posttranslationel autooxidation af grønt-fluorescerende protein. Proc. Natl Acad. sci. USA, 1994, v. 91, s. 12501-12504.
  45. ↑ 1 2 Tsien RY, Heim R. Engineering grønt-fluorescerende protein for forbedret lysstyrke, længere bølgelængder og fluorescensresonans energioverførsel // Curr. Biol., 1996, v. 6, s. 178-182.
  46. ↑ Cormack BP, Valdivia RH, Falkow, S. FACS-optimerede mutanter af det grønt-fluorescerende protein (GFP) // Gene, 1996, v. 173, s. 33-38.
  47. ↑ Tsien RY, Brejc K., Sixma TK, Kitts PA, Kain S.R. , Ormo M., Remington SJ Strukturelt grundlag for dobbelt excitation og fotoisomerisering af Aequorea victoria grønt-fluorescerende protein. Proc. Natl. Acad. sci. USA, 1997, v. 94, s. 2306-2311.
  48. ↑ Tsien RY, Vergara J., Delay M. Inositol 1,4,5-trisphosphate: a possible chemical link in excitationcontraction coupling in muscle // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1985, v. 82, s. 6352-6356.
  49. ↑ Randriamampita C., Tsien RY Nedbrydning af en calciumtilstrømningsfaktor (CIF) kan blokeres af fosfatasehæmmere eller chelering af Ca2+ // J. Biol. Chem., 1995, v. 270, s. 29-32.
  50. ↑ Putney JW Former og funktioner af butiksdrevne calciumindgangsmediatorer STIM og Orai // Adv. Biol. Regul., 2017, v. 68, s. 88-96.
  51. ↑ Huang CL-H., Pedersen TH, Fraser JA Reciprocal dihydropyridine and ryanodine receptor interactions in skeletal muscle activation // J. Muscle Res. Cell Motil., 2011, v. 32, s. 171-202.
  52. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Llopis J., Heim R., Michael McCaffery J., Adams JA, Ikura M. Fluorescerende indikatorer for Ca2+ baseret på grønt-fluorescerende proteiner og calmodulin // Nature, 1997, v. 388, s. 882-887.
  53. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R. Dynamiske og kvantitative Ca2+-målinger ved hjælp af forbedrede kameleoner // Proc. Natl Acad. sci. USA, 1999, v. 96, s. 2135-2140.
  54. ↑ Zaccolo M., Pozzan T. Diskrete mikrodomæner med høj koncentration af cAMP i stimulerede neonatale hjertemyocytter fra rotter // Science, 2002, v. 295, s. 1711-1715.
  55. ↑ Zhang J., Allen MD FRET-baserede biosensorer til proteinkinaser: belysning af kinomet // Mol. Biosyst., 2007, v. 3, s. 759-765.
  56. ↑ Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW Fremskridt inden for fluorescerende proteinteknologi // J. Cell Sci., 2007, v. 120, s. 4247-4260.
  57. ↑ Tsien RY, Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, Giepmans BNG, Palmer AE Forbedrede monomere røde, orange og gule fluorescerende proteiner afledt af Discosoma sp. rødt fluorescerende protein // Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, s. 1567-1572.
  58. ↑ Tsien RY, Rodriguez E., Campbell R., Lin J., Lin M., Miyawaki A., Palmer A., ​​Shu X., Zhang J. Den voksende og glødende værktøjskasse af fluorescerende og fotoaktive proteiner // Trends Biochem. Sc., 2016, v. 42, s. 111-129.
  59. ↑ Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA Fluorescerende proteiner fra ikke-bioluminescerende Anthozoa-arter // Nat. Biotechnol., 1999, v. 17, s. 969-973.
  60. ↑ Wall MA, Socolich M., Ranganathan R. Det strukturelle grundlag for rød fluorescens i den tetramere GFP-homolog DsRed, Nat. Struktur. Biol., 2000, v. 7, s. 1133-1138.
  61. ↑ Yarbrough D., Wachter RM, Kallio K., Matz MV, Remington SJ Raffineret krystalstruktur af DsRed, et rødt fluorescerende protein fra koraller, ved 2,0-Å opløsning // Proc. Natl Acad. sci. USA, 2001, v. 98, s. 462-467.
  62. ↑ Campbell R., Tsien R.Y., Tour. O., Palmer A., ​​Steinbach P., Baird GS, Zacharias D. Et monomert rødt fluorescerende protein // Proc. Natl Acad. sci. USA, 2002, v. 99, s. 7877-7882.
  63. ↑ Tsien RY, Gonzalez JE Forbedrede indikatorer for cellemembranpotentiale, der bruger fluorescensresonansenergioverførsel // Chem. Biol., 1997, v. 4, s. 269-277.
  64. ↑ Hussain T., Tsien R.Y. et al. Fluorescensmærket peptid øger identifikation af degenererede ansigtsnervegrene under operation og forbedrer funktionelt resultat // PLoS ONE, 2015, v. 10, e0119600.
  65. ↑ Tsien R.Y. et al. Laminin-målretning af et perifert nerve-fremhævnende peptid muliggør degenereret nervevisualisering // Proc. Natl. Acad. sci. USA, 2016, v. 113, s. 12 774-12 779
  66. ↑ Glasby MA, Gschmeissner SG, Hitchcock RJI, Huang CL-H. Afhængigheden af ​​nerveregenerering gennem muskeltransplantater hos rotter af tilgængeligheden og orienteringen af ​​basalmembranen // J. eurocytol., 1986, v. 15, s. 497-510.
  67. ↑ Gattuso JM, Davies AH, Glasby MA, Gschmeissner SE, Huang CL-H. Perifer nerve reparation ved hjælp af muskel autografts: genopretning af transmission i primater // J. Bone Jt Surg. Ser. B, 1988v. 70, s. 524-529.
  68. ↑ Tsien R.Y. et al. 18F-positron-emitterende/fluorescerende mærkede erytrocytter tillader billeddannelse af indre blødninger i en murin intrakraniel blødningsmodel // J. Cereb. Blood Flow Metab., 2017, v. 37, s. 776-786.
  69. ↑ Smith JM, Bradley DP, James MF, Huang CL-H. Fysiologiske undersøgelser af kortikal spredning af depression // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc., 2006, v. 81, s. 457-481.
  70. ↑ Tsien R.Y. et al. Tidlig påvisning af pladecellecarcinom i carcinogen-induceret oral cancer-gnavermodel ved hjælp af ratiometriske aktiverbare cellepenetrerende peptider // Oral Oncol., 2017, v. 71, s. 156-162.
  71. ↑ Tsien RY, Malone CD, Olson ES et al. Tumordetektion ved 3 tesla med en aktiverbar cellepenetrerende peptiddendrimer (ACPPD-Gd), et T1 magnetisk resonans (MR) molekylært billeddannende middel // PLoS ONE. (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0137104)
  72. ↑ Tsien R.Y. et al. Tumorradiosensibilisering ved monomethylauristatin E: virkningsmekanisme og målrettet levering // Cancer Res., 2015, v. 75, s. 1376-1387.

Links

  Gå til Wikidata-elementet  Tematiske steder
Ordbøger og encyklopædier
Slægtsforskning og nekropolis
 Vindere af Ulveprisen i medicin
  • Matematik
  • Kunst
  • Kemi
  • Fysik
  • Medicinen
  • Landbrug