Restriktionsmodifikationssystemet er et enzymatisk system af bakterier , der ødelægger fremmed DNA , der er kommet ind i cellen . Dens hovedfunktion er at beskytte cellen mod fremmed genetisk materiale, såsom bakteriofager og plasmider . Komponenterne i systemet er karakteriseret ved to typer aktivitet - methyltransferase (methylase) og endonuklease . Både individuelle proteiner og et protein, der kombinerer begge funktioner, kan være ansvarlige for hver af dem . [en]
Restriktionsmodifikationssystemet (SR-M) er specifikt for visse sekvenser af nukleotider i DNA, kaldet restriktionssteder . Hvis visse nukleotider i sekvensen ikke er methylerede , indfører restriktionsendonukleasen et dobbeltstrengsbrud i DNA'et (ofte med et skift af flere nukleotider mellem strengene), mens DNA-molekylets biologiske rolle krænkes. I det tilfælde, hvor kun en af DNA-strengene er methyleret, sker der ingen spaltning; i stedet tilføjer methyltransferase methylgrupper til nukleotiderne i den anden streng. Denne specificitet af SR-M gør det muligt for bakterier selektivt at spalte fremmed DNA uden at påvirke deres eget. Normalt er alt DNA i en bakteriecelle enten fuldt methyleret eller fuldt methyleret langs kun én streng (umiddelbart efter replikation ). I modsætning hertil er fremmed DNA ikke methyleret og undergår hydrolyse. [en]
Restriktionsmodifikationssystemer blev opdaget som et resultat af at studere de molekylære mekanismer af et fænomen kaldet værtskontrolleret restriktion . Essensen af fænomenet ligger i det faktum, at bakteriofager isoleret fra cellerne i en bakteriestamme formerer sig meget dårligt i en anden. Når de er inficeret med virale partikler isoleret fra den anden stamme, oplever cellerne i den første igen undertrykkelse af fagreproduktion, mens de i den anden stamme formerer sig normalt. I bakterier observeres således et system til at undertrykke reproduktionen af bakteriofager. Virus, der stadig formåede at overvinde det, bliver resistente over for handlingen fra dette system. S. Luria og ML Human skrev i deres artikel fra 1952 [2] :
Ved at analysere forholdet mellem visse fager og visse mutanter af deres værtsbakterier stødte vi på et nyt fænomen: værtens genotyp , hvori virussen replikerer, påvirker fænotypen af nye vira. Fænotypiske ændringer hæmmer virusets evne til at replikere i visse stammer. Dette er en ikke-permanent ændring, en vellykket reproduktionscyklus i en passende vært returnerer virussen til sin oprindelige form.
Originaltekst (engelsk)[ Visskjule] Ved at analysere forholdet mellem visse fager og visse mutanter af deres bakterielle værter, er vi stødt på en ny situation: genotypen af værten, hvori en virus reproducerer, påvirker fænotypen af den nye virus. Den fænotypiske ændring undertrykker virusets evne til at reproducere i visse værter, men ikke i andre. Det er en forbigående ændring i den forstand, at en vækstcyklus i en passende vært returnerer virussen til sin oprindelige form.Efterfølgende blev det vist, at bakteriofager isoleret fra forskellige stammer har den samme genotype, men et andet mønster af DNA-methylering, svarende til specificiteten af CP-M af denne stamme. [3]
I 1978 blev Werner Arber , Daniel Nathans og Hamilton Smith tildelt Nobelprisen i fysiologi eller medicin "for deres opdagelse af restriktionsenzymer og deres anvendelse på molekylær genetik".
CP-M-enzymer er navngivet efter det system, der blev foreslået i 1973 af Smith og Nathans . [4] Navnet på et enzym begynder med et akronym på tre bogstaver, hvor det første bogstav er det samme som det første bogstav i slægtsnavnet , og resten er de to første bogstaver i den art , hvor enzymet blev fundet . Akronymet er skrevet med kursiv. Yderligere bogstaver tjener til at angive en bestemt stamme eller serotype . Romertal tildeles i den rækkefølge, som enzymer af en given type findes i en bestemt organisme. Yderligere bogstaver og tal er ikke i kursiv. For eksempel:
I trykte kilder er der betydelige forskelle i stavningen af navnene på de samme enzymer (med hensyn til kursiv og tilstedeværelsen af mellemrum). I 2003 foreslog en stor gruppe videnskabsmænd at systematisere klassificeringen og nomenklaturen af restriktaser og methyltransferaser. [5] Det foreslås især at opgive brugen af kursiv, hele navnet skal skrives uden mellemrum. Det anbefales, at navnene "restriktionsenzym" og "methylase" undgås, ved at bruge "restriktionsendonuklease" og "methyltransferase" i stedet; typen af enzymatisk aktivitet er angivet med bogstaverne R (endonuklease) og M (methyltransferase) før akronymet - M.EcoRI og R.EcoRI.
Restriktionsendonukleaser introducerer brud i begge DNA-strenge og deler det i to dele. Afhængig af DNA-skæringens specificitet dannes der produkter, som har forskellige endestrukturer (se figur).
Restriktionsmodificerende methyltransferaser tilføjer methylgrupper til de nitrogenholdige baser af DNA-nukleotidrester. Methylering kan finde sted ved N5- og N6-positioner i adenin , N4 og C5-i cytosin . Den eneste donor af methylgrupper til DNA-methyltransferaser er S-adenosin-L-methionin . I de fleste tilfælde er kun den anden streng af semi-methyleret DNA methyleret, mens fuldstændigt umethyleret DNA spaltes på grund af endonukleaseaktiviteten af CP-M.
Alle CP-M'er kræver Mg 2+ som en cofaktor. SR-M af den første og tredje type har brug for ATP , og den fjerde i GTP . S-adenosylmethionin kan ikke kun tjene som donor af methylgrupper, men også som en allosterisk regulator.
På nuværende tidspunkt, baseret på underenhedsstrukturen, substratspecificiteten, enzymets krav til cofaktorer og arten af DNA-spaltning [1] skelnes der mellem fire typer restriktionsmodifikationssystemer. [5] [6]
CRM'er af den første type er dannet af fem underenheder, der fungerer som en helhed. Underenheder er betegnet med forkortelsen Hsd (værtsspecificitetsdeterminant) og bogstavet, der svarer til funktionen (M- DNA-methyltransferase , R- restriktionsendonuklease , S-substratgenkendelse). CP-M af den første type er et kompleks af to HsdM, to HsdR og en HsdS. HsdR spalter phosphodiesterbindinger i DNA og har helicaseaktivitet . HsdM producerer methylering af adeninrester i restriktionsstederne ved det sjette nitrogenatom (m6A). HsdS giver genkendelse af visse DNA-regioner, der bestemmer specificiteten af SR-M. [7]
Når der virker på umethyleret DNA, dominerer nukleaseaktivitet, de novo methylering kan udføres med ekstrem lav effektivitet, hvilket gør det muligt for bakteriofager at overvinde virkningen af CP-M og erhverve evnen til at formere sig i en ny stamme (for flere detaljer, se ovenfor) ).
Restriktionsstedet er en asymmetrisk todelt sekvens: 5'-sekvensen på 3-5 specifikke nukleotider er adskilt af 6-8 nukleotider af enhver type fra den 3'-specifikke sekvens på 4-5 basepar. Efter at have genkendt målet, bevæger det enzymatiske kompleks sig langs DNA-molekylet og afvikler det ( helikaseaktivitet ), indtil det støder på en forhindring (for eksempel et andet protein). Der indføres således en pause i en stor vilkårlig afstand (tusindvis af basepar) fra restriktionsstedet. [7] Spaltning af CP-M type I DNA kræver ATP -hydrolyse . Dette skyldes det faktum, at der kræves energi for at bevæge sig langs DNA-molekylet og afvikle det efter genkendelse af CP-M-stedet. ATP udnyttes ved hjælp af den såkaldte. DEAD-motoren [7] er en bevaret to-domænestruktur, der er karakteristisk for helicaser og nogle andre proteiner (for eksempel den molekylære motor af Sec-translokasen SecA). [otte]
Denne type er opdelt i fire familier (IA-D) baseret på genetisk komplementering, DNA-hybridisering og immun krydsreaktivitet (krydsreaktivitet med antistoffer ). [9]
I restriktionsmodifikationssystemer af denne type er methyltransferase- og nukleaseaktiviteter i de fleste tilfælde tilvejebragt af uafhængige proteiner. Endonukleaser skærer DNA i strengt definerede positioner inde i eller nær restriktionsstedet, som et resultat heraf har DNA-enderne ved brudstedet 3'-hydroxylgrupper og 5'-phosphatgrupper. På grund af disse egenskaber er endonukleaser af denne type (især IIP) meget udbredt i genteknologi . SR-M II kræver ikke ATP eller andre energikilder for at fungere. Aktive nukleaser kan eksistere som en monomer , homodimer eller homotetramer (for forskellige systemer). [5]
Methyltransferaser fungerer normalt som en monomer. Methylering sker ved den fjerde (N) eller femte (C) position i cytosinresten eller ved den sjette (N) - adenin (for forskellige systemer har hvert enkelt enzym streng specificitet). [5]
Der er flere undergrupper af type II SR-M, nogle systemer kan tilhøre flere af dem på én gang. [5]
Længden af et anerkendt palindrom er i de fleste tilfælde 4, 6 eller 8 nukleotider. Spaltningen sker i en fast position inden for eller umiddelbart ved siden af restriktionsstedet. Samtidig forårsager forskellige enzymer dannelsen af både klæbrige og stumpe ender.
Type III SR-M'er inkluderer to underenheder (Res og Mod), der kombineres til en heterotetramer (Res 2 Mod 2 ) [7] med endonuklease- og methyltransferaseaktiviteter. Res-underenheden har helicaseaktivitet og kræver ATP - hydrolyse for at fungere . [6] I modsætning til type 1 CP-M kræver DNA-hydrolyse interaktion af to enzymkomplekser. De genkender to identiske restriktionssteder i modsatte orienteringer. Steder kan være umethylerede eller enkeltstrengede methylerede. [7]
Mod-underenheden kan fungere separat fra Res og fungere som en methyltransferase (m6A). Samtidig manifesteres nukleaseaktiviteten af Res-underenheden kun, når den er i kompleks med Mod. [5]
Type IV SR-M'er spalter kun modificeret DNA, der indeholder methylerede, hydroxymethylerede eller glycosylhydroxymethylerede baser. DNA-spaltning kræver hydrolyse af GTP . Endonukleaseaktivitet tilvejebringes af et enkelt polypeptid. Methyltransferaseaktivitet er fraværende [10] . Nukleaseaktivitet aktiveres allosterisk af S-adenosylmethionin . Restriktionsstedet er asymmetrisk og består af to adskilte dele. DNA-skæring sker i nærheden af et af stederne. [6] [7]