Kryobeskyttere er stoffer , der beskytter levende genstande mod de skadelige virkninger af frysning. Kryobeskyttere bruges til kryokonservering - lav temperatur opbevaring af levende genstande (med andre ord ved frysning af cellekulturer , blod, sædceller , embryoner, isolerede organer og hele biologiske genstande).
Forglasning har vigtige anvendelser til at bevare embryoner, biologiske væv og organer til transplantation. Forglasning bruges også i kryonik. at reparere frostskader. Disse stoffers kryobeskyttende egenskaber består i at sænke glasovergangstemperaturen for en frossen genstand til under smeltepunktet. Kryobeskyttelsesmidler forhindrer således effektiv frysning, og systemet bevarer en vis fleksibilitet i den glasagtige fase, og opfører sig således som et amorft fast stof, der størkner uden at danne krystaller, som kan beskadige prøven.
I tilfælde af biologiske prøver er skaden primært forårsaget ikke af iskrystaller (da cellernes indre normalt ikke fryser på denne måde, hvis overhovedet), men af ændringer i osmotisk tryk og ionstyrke (elektrolytindhold i cellens celler). væske). Ved frysning påvirkes levende genstande af to skadelige faktorer: dannelsen af intracellulær is og dehydrering . Placering af levende genstande i opløsninger af kryobeskyttelsesmidler og frysning i disse opløsninger reducerer eller helt eliminerer dannelsen af intracellulær is og dehydrering.
Mange kryobeskyttelsesmidler fungerer også ved at danne hydrogenbindinger med biologiske molekyler, når de erstatter vandmolekyler. Hydrogenbinding i vandige opløsninger er afgørende for den korrekte funktion af proteiner og DNA. Derfor, når kryobeskyttelsesmidlet erstatter vandmolekylerne, bevarer det biologiske materiale sin naturlige fysiologiske struktur (og funktion), selvom det ikke længere er nedsænket i vandmiljøet. En sådan konserveringsstrategi ses meget ofte ved anhydrobiose .
Der er et stort antal stoffer med kryobeskyttende egenskaber, men i medicinsk og laboratoriepraksis anvendes ikke mere end et dusin forbindelser, som vil blive anført nedenfor. Der er to typer af kryobeskyttelsesmidler: gennemtrængende og ikke-gennemtrængende.
Kryobeskyttende midler virker ved at øge koncentrationen af opløste stoffer i celler. Men for at være biokompatible skal de (1) let trænge ind i celler og (2) være ikke-toksiske for selve cellerne. Efter afrimning skal levende genstande befries for kryobeskyttelsesmidler.
Biologiske frostvæsker omfatter forbindelser med lav molekylvægt og frostvæsker. De findes især i organismer i det arktiske klima. Glycerol , andre polyoler , urinstof og glucose , blandt andre, bruges som lavmolekylære forbindelser. Det er forbindelser, der let danner brintbindinger med tilstødende vandmolekyler. Forbindelser, der trænger ind i cellemembraner, forhindrer væksten af iskrystaller. Dette sænker frysetemperaturen inde i cellerne. I nogle tilfælde falder koncentrationen af vand i cellerne også ( anhydrobiose ).
De fleste frostvæskeproteiner forhindrer ikke celleplasma i at fryse, men kan forsinke det lidt. Deres virkning er baseret på, at de hæmmer væksten af iskrystaller og beskytter iskrystaller, der allerede er dannet, som kan fungere som krystallisationskerner . Som et resultat forbliver de resulterende krystaller små, isen bliver finkornet og kan ikke ødelægge cellestrukturer, selvom den fryser. Efter optøning genoptager cellen sine normale funktioner.
Frostbeskyttelsesproteiner (AFP'er) tilhører en klasse af polypeptider, der produceres af visse hvirveldyr, planter, svampe og bakterier, som gør det muligt for dem at overleve i negative miljøer. Disse proteiner binder sig til små iskrystaller og forhindrer deres vækst og omkrystallisation, som ellers ville være dødelig. Der er også voksende beviser for, at AFP'er interagerer med cellemembranerne i pattedyrceller for at beskytte dem mod kuldeskader.
Frostvæskeproteiner sænker ikke frysepunktet i forhold til koncentrationen. I stedet arbejder de ikke-koligativt [1] . Dette giver dem mulighed for at fungere som et frostvæske ved koncentrationer på 1/300 til 1/500 af andre opløste stoffer, med efterfølgende minimering af deres effekt på osmotisk tryk. Disse usædvanlige evner tilskrives deres evne til at binde sig til visse overflader af iskrystaller.
Frostvæskeproteiner skaber en forskel mellem isens smeltepunkt og vands frysepunkt, kendt som termisk hysterese . Tilsætningen af AFP-proteiner ved grænsefladen mellem is og flydende vand hæmmer den termodynamisk gunstige vækst af iskrystaller. Krystalvækst hæmmes kinetisk af AFP, som dækker overfladerne af iskrystaller, der er tilgængelige for vand.
De mest almindelige kryobeskyttelsesmidler i industrien er forskellige glycoler, dvs. polyhydroxoalkoholer ( ethylenglycol , propylenglycol , glycerol ). Ethylenglycol er en ingrediens i vinterkølervæsker til biler, og propylenglykol bruges nogle gange til at reducere mængden af iskrystaller i is og producere en glattere tekstur. Et andet populært kryobeskyttelsesmiddel er dimethylsulfoxid sammen med glycerol, der almindeligvis bruges til at beskytte biologiske prøver (sperm, embryoner) under deres opbevaring i flydende nitrogen.
For at øge effektiviteten af kryobeskyttende midler og afbøde bivirkninger fra deres brug, anvendes deres blandinger oftest. En blanding af formamid med dimethylsulfoxid, propylenglycol og det tilsvarende kolloid har længe været det mest effektive kunstigt skabte kryobeskyttelsesmiddel.
Forglasning er meget udbredt som en metode til kryokonservering af embryoner og oocytter . Nævnte glasovergang opnås ved meget hurtig afkøling, som anvender en højkoncentreret opløsning, der ikke krystalliserer ved frysning, således at dens viskositet stiger med faldende temperatur, indtil der dannes et amorft fast stof. Temperaturfaldshastigheden når 23000°C/min. For at opnå en stor temperaturændring ved høj hastighed anvendes et minimalt mellemvolumen (mindre end 0,1 mikroliter) og flydende nitrogen ved -196° C. Eksponeringen og frysehastigheden skal være høj nok til at undgå toksicitet og dannelse af intracellulært krystaller, der kan beskadige indholdscellerne. For at opnå meget hurtig dehydrering anvendes kryobeskyttelsesmidler i høje koncentrationer. Hastigheden af frysning/optøning er indirekte proportional med koncentrationen af kryobeskyttelsesmidler. Før frysning skal det biologiske materiale ækvilibreres med denne kryobeskyttelsesopløsning (i en lavere koncentration), så det kan modstå osmotisk shock. Prøveoverlevelsesrater overstiger 90%, og embryoner overlever normalt intakte.
Når forglasningen er finjusteret i laboratoriet, overstiger overlevelsesraterne 90 %, uanset prøvetype. Embryoer overlever normalt intakte (100 % blastomerer). Denne metode er nyttig for både embryoner og oocytter, men ikke til spermatozoer. Ekstrem hastighed er påkrævet under afglasning (optøning) processen, fjernelse af prøven fra flydende nitrogen og indføring i midten ved 37 ° C. Nogle undersøgelser understreger, at denne optøningshastighed kan være vigtigere end frysehastigheden for at opnå høje overlevelsesrater for kryokonserverede oocytter.
| Kryonik | |
|---|---|
| Begreber | |
| Mennesker | |
| Organisationer | |
| relaterede emner | |
| Kategori " Cryonics " | |