Anti-CRISPR ( engelsk Anti-CRISPR ) er et proteinsystem , takket være hvilket bakteriofager (både bakterier og archaea ) modstår den destruktive virkning af CRISPR /Cas-systemer. Anti-CRISPR-systemer er blevet beskrevet i mange bakteriofager. Proteinerne i disse systemer forstyrrer i de fleste tilfælde processen med målgenkendelse og Cas-proteinernes arbejde. Anti-CRISPR-systemer kan være af bioteknologisk betydning, da de kan bruges til at finjustere genomredigering ved hjælp af CRISPR/ Cas9-teknologi .
Før opdagelsen af anti-CRISPR var den eneste kendte måde, hvorpå fager undgår at blive ødelagt af CRISPR/Cas-systemet, ved at erhverve punktmutationer . De påvirker praktisk talt ikke fagens levedygtighed, men de forstyrrer komplementariteten af parringen af fag- DNA med guide-RNA'et , på grund af hvilket CRISPR/Cas-systemet ikke kan genkende det virale genetiske materiale . Imidlertid finder mikroorganismer hurtigt en måde at omgå denne beskyttelse ved at indsætte nye fragmenter af fremmed DNA i deres genom . De første anti-CRISPR-proteiner blev opdaget i 2013 i flere beslægtede fager, der angriber bakterien Pseudomonas aeruginosa . Teoretisk set, hvis en fag integreres i genomet af en bakterie, der har et aktivt CRISPR/Cas-system, vil bakterien dø, fordi den skærer sit eget genom. Imidlertid førte indsættelsen af nogle fager i genomet af bakterier med aktiv CRISPR/Cas ikke til celledød. Når man sammenlignede genomerne fra fager, der forårsager bakteriecellers død, og fager, der ikke fører til celledød, viste det sig, at sidstnævnte har et særligt locus , der indeholder ti helt forskellige og meget korte gener (150-450 nukleotider lange ). Det viste sig, at proteinprodukterne fra fem af dem (acrF1-acrF5) forstyrrer IF-type CRISPR/Cas-systemet i P. aeruginosa , og yderligere fire (acrE1-acrE4) blokerer IE-typen i den samme bakterie. Anti-CRISPR-gener er blevet identificeret ikke kun i P. aeruginosa -fager , men også i plasmider og konjugative øer af denne bakterie [1] .
Aminosyresekvenserne af anti-CRISPR-proteiner varierer meget og mangler ethvert fælles motiv , der ville hjælpe med at identificere lignende gener i genomerne af andre bakteriofager ved hjælp af standard bioinformatiske metoder . Det viste sig dog, at miljøet for anti-CRISPR-gener er meget ens: efter selve anti-CRISPR-generne har de alle et gen, der koder for transkriptionsfaktoren Aca1 ( anti-CRISPR-associeret 1 ) [1] . Fager, der mangler anti-CRISPR-gener , mangler også aca1 -genet . Desuden danner anti-CRISPR-generne og aca1 -genet en enkelt operon , og Aca1-proteinet ser ud til at regulere anti-CRISPR- ekspression i henhold til stadiet af faginfektionscyklussen . Aca1-proteinet har et helix-turn-helix strukturelt motiv , som ofte findes blandt transkriptionsfaktorer. For at fastslå, om den undersøgte region af bakteriofaggenomet koder for anti-CRISPR-proteiner, tjekkede forskerne for tilstedeværelsen umiddelbart efter det af et gen, der koder for et protein med "helix-turn-helix"-motivet. Ved at bruge denne tilgang er anti-CRISPR-proteiner, der virker mod type I-systemer, blevet opdaget i bakteriofager af en række forskellige proteobakterier . Den samme tilgang førte til opdagelsen af anti-CRISPR-forstyrrende Type II-systemer [1] [2] .
For nylig er der oprettet en database med anti-CRISPR-proteiner, antiCRISPRdb, hvor alle kan finde kendt information om et anti-CRISPR-protein af interesse [3] .
I dag kendes 22 familier af anti-CRISPR- proteiner . De er kun forenet af deres lille størrelse (fra 50 til 150 aminosyrerester), de har ikke noget fælles motiv, og ingen af dem ligner noget protein med en kendt funktion. Derfor viste det sig at være umuligt at foreslå virkningsmekanismen for anti-CRISPR ved hjælp af bioinformatik. Hidtil har det været muligt at etablere virkningsmekanismen for seks anti-CRISPR-proteiner ved hjælp af genetiske , biokemiske og strukturelle tilgange. Teoretisk set kan anti-CRISPR-proteiner påvirke driften af CRISPR/Cas på flere stadier [1] . De kan:
I øjeblikket er virkningen af anti-CRISPR-proteiner i de sidste to scenarier blevet beskrevet. For eksempel binder AcrF1- og AcrF2-proteiner til komplekset af Cas-proteiner og RNA, hvilket forhindrer det i at binde til fremmed DNA. AcrF3-proteinet interagerer med Cas3-proteinet, som har helicase- og nukleaseaktiviteter , og forhindrer det i at slutte sig til komplekset af andre Cas-proteiner og RNA, der allerede har bundet mål-DNA'et. AcrIIC1 binder til nukleasedomænet af Cas9-proteinet (det eneste Cas-protein i type II-systemer), hvilket forhindrer det i at skære DNA [1] .
Nogle anti-CRISPR-proteiner er aktive mod flere CRISPR/Cas-systemer. For eksempel undertrykker anti-CRISPR-proteiner, der virker mod type II-A-systemer funktionen af homologe Cas9-proteiner, hvis aminosyresekvenser kun er 53 % ens [1] [2] .
Nylige undersøgelser har vist, at punktmutationer alene ikke er nok til, at bakteriofager kan undslippe virkningen af CRISPR/Cas. Fagen skal have mindst ét anti-CRISPR-gen for at undgå at blive fuldstændig dræbt, når den dyrkes sammen med bakterier med aktive CRISPR/Cas-systemer. Tilsyneladende bidrager sådan en stærk selektion til mangfoldigheden af aminosyresekvenser og virkningsmekanismer af anti-CRISPR. Anti-CRISPR-proteiner tjener som vigtige faktorer i udviklingen af mikroorganismer. Således fører indsættelsen af mobile genetiske elementer med generne af sådanne proteiner i bakteriegenomet til permanent inaktivering af CRISPR/Cas-systemerne på grund af den stabile ekspression af anti-CRISPR. En celle i denne tilstand kan ikke modstå indtrængen af andre transponerbare genetiske elementer og derfor horisontal genoverførsel . Ved langvarig inaktivering af CRISPR/Cas kan en bakterie helt miste cas -generne eller akkumulere mutationer , der gør dem ikke-funktionelle. Bioinformatisk analyse af forskellige bakteriers CRISPR/Cas-systemer viste, at omkring 12 % af dem er ikke-funktionelle på grund af tab af cas -gener eller skadelige mutationer i dem. Det er eksperimentelt blevet påvist, at under forhold, hvor erhvervelsen af fremmed DNA er gavnlig, kan bakterier fuldstændigt miste CRISPR/Cas-systemet [2] .
I øjeblikket kendes anti-CRISPR-proteiner, som undertrykker aktiviteten af Cas9 af bakterien Streptococcus pyogenes (dette enzym bruges oftest til redigering af genomer ved hjælp af CRISPR/Cas-systemer). Hvad mere er, to af dem gør det i menneskelige celler , hvilket blokerer genomredigering. Derfor kan anti-CRISPR-proteiner regulere genomredigering af CRISPR/Cas, for eksempel ved kun at efterlade systemet aktivt i visse væv og organer , kun på bestemte stadier af embryonal udvikling eller kun på bestemte tidspunkter af cellecyklussen . Derudover vil brugen af anti-CRISPR hjælpe med at reducere hyppigheden af ikke-planlagte mutationer introduceret af Cas9. Normalt er Cas9 aktiv, indtil cellen ødelægger enten enzymet eller guide-RNA'et, og en for lang periode med Cas9-aktivitet resulterer ofte i mutationer uden for målgenet. Mange humane bakterielle patogener har aktive CRISPR/Cas-systemer, og brugen af anti-CRISPR-proteiner kan øge effektiviteten af fagterapi betydeligt . Således kan anti-CRISPR-proteiner finde bred anvendelse inden for bioteknologi, genteknologi og medicin i fremtiden [1] .