En række biokemiske switche styrer overgange mellem og inden for forskellige faser af cellecyklussen . Cellecyklussen er en række komplekse, ordnede, sekventielle hændelser, der styrer opdelingen af en celle i to celler og omfatter flere forskellige faser. Faserne omfatter G1- og G2-faser, DNA-replikation eller S-fase og selve processen med celledeling, mitose eller M-fase [1] . Under M-fasen adskilles kromosomerne, og der opstår cytokinese.
Kontakterne opretholder den velordnede udvikling af cellecyklussen og fungerer som kontrolpunkter for at sikre, at hver fase afsluttes korrekt, før man går videre til næste fase [1] . For eksempel er Cdk eller cyclinafhængig kinase en masterregulator af cellecyklussen og tillader cellen at gå fra G1 til S eller fra G2 til M ved at tilføje fosfat til proteinsubstrater. Sådanne multikomponent-omskiftere (der involverer mange indbyrdes forbundne proteiner) har vist sig at generere afgørende, pålidelige (og potentielt irreversible) overgange og udløse stabile oscillationer [2] . Som følge heraf er de genstand for aktiv forskning, der forsøger at forstå, hvordan sådanne komplekse egenskaber er relateret til biologiske kontrolsystemer [2] [3] [4] .
Mange biologiske kredsløb producerer komplekse output ved hjælp af en eller flere feedback -sløjfer . I en sekvens af biokemiske hændelser vil feedback referere til et nedstrøms element i sekvensen (B i det tilstødende billede), der påvirker en opstrømskomponent (A i det tilstødende billede) til at påvirke sin egen produktion eller aktivering (output) i fremtiden. Hvis dette element virker for at øge sit eget output, deltager det i positiv feedback (blå pil). En positiv feedback-loop er også kendt som en selvforstærkende loop, og det er muligt, at disse loops kan være en del af en større loop, da dette er almindeligt i reguleringskredsløb [1] .
Omvendt, hvis dette element fører til sin egen hæmning gennem højere elementer, er dette kanonisk negativ feedback (rød stump pil). En negativ feedback loop er også kendt som en balancering loop og der kan ofte ses oscillationer, hvor et forsinket negativ feedback signal bruges til at opretholde en homøostatisk balance i systemet [1] .
Feedback loops kan bruges til forstærkning (positiv) eller selvkorrektion (negativ). Den rigtige kombination af positive og negative feedbacks kan generere overfølsomhed og bistabilitet [5] [6] , som igen kan generere kritiske overgange og svingninger.
Positive og negative feedback loops fungerer ikke altid godt. I mekanismen af biokemiske afbrydere arbejder de sammen for at skabe et fleksibelt system. For eksempel, ifølge Pfeuty & Kaneko (2009), for at overvinde manglen på biokemiske systemer, kan positive feedback regulatoriske sløjfer interagere med negative regulatoriske sløjfer for at lette genopretning fra stabile tilstande [7] . Sameksistensen af to stabile tilstande er kendt som bistabilitet, som ofte er resultatet af positiv feedbackkontrol.
Et eksempel, der afslører interaktionen mellem flere negative og positive feedback-løkker, er aktiveringen af cyclin-afhængige proteinkinaser eller Cdks14. Positive feedback-loops spiller en rolle ved at skifte celler fra lav til høj Cdk-aktivitet. Samspillet mellem de to typer sløjfer er manifesteret i mitose. Mens positiv feedback initierer mitose, fremmer en negativ feedback-loop inaktivering af cyclin-afhængige kinaser af det anafase-stimulerende kompleks. Dette eksempel viser tydeligt de kombinerede virkninger af positiv og negativ feedback på cellecyklusregulering.
En alt-eller-intet reaktion på en stimulus kaldes overfølsomhed . Med andre ord forårsager en meget lille ændring i stimulus en meget stor ændring i respons, hvilket skaber en sigmoidal dosis-responskurve. Den overfølsomme respons er beskrevet af den generelle ligning V = S n /(S n + K m ), kendt som Hill-ligningen , når n, Hill-koefficienten, er større end 1. Hældningen af sigmoid-kurven afhænger af værdien af n. Værdien n = 1 giver et hyperbolsk eller Michael-svar. Ultrasensitivitet opnås i forskellige systemer; et bemærkelsesværdigt eksempel er den kooperative binding af enzymets hæmoglobin til dets substrat. Da hypersensitiv respons er næsten "digital", kan den bruges til at øge responsen på en stimulus eller til at foretage en pludselig brat overgang (mellem "off" og "on" tilstande).
Ultrasensitivitet spiller en vigtig rolle i reguleringen af cellecyklussen. For eksempel er Cdk1 og Wee1 regulatorer af mitose og er i stand til at inaktivere hinanden gennem hæmmende phosphorylering. Dette er en dobbelt negativ feedback-sløjfe, hvor begge regulatorer inaktiverer hinanden. Ifølge Kim et al. (2007) skal der være et ultrafølsomt element for at generere en bistabil respons. Det viste sig, at Wee1 har et overfølsomt respons på Cdk1, og dette skyldes sandsynligvis substratkonkurrence mellem forskellige fosforyleringssteder på Wee1 [8] .
Bistabilitet indebærer hysterese , og hysterese indebærer multistabilitet. Multistabilitet angiver tilstedeværelsen af to eller flere stabile tilstande for et givet input. Derfor er bistabilitet et systems evne til at eksistere i to stationære tilstande [9] . Med andre ord er der en række stimulusværdier, for hvilke en respons kan have to steady-state værdier. Bistabilitet er ledsaget af hysterese , hvilket betyder, at systemet nærmer sig en af to stabile tilstande fortrinsvis afhængigt af dets historie. Bistabilitet kræver feedback såvel som et ultrafølsomt kredsløbselement.
Under passende omstændigheder kan positive og negative tilbagekoblingssløjfer give betingelser for bistabilitet; for eksempel på grund af den positive feedback forbundet med kredsløbets ultrafølsomme responselement. Et hysteretisk bistabilt system kan fungere som en pålidelig reversibel kontakt, fordi det er vanskeligere for systemet at skifte mellem "on" og "off" tilstande (sammenlignet med en tilsvarende monostabil hypersensitiv respons). Systemet kan også konfigureres, så en af overgangene er fysisk utilgængelig; for eksempel vil ingen mængde af stimulusreduktion returnere systemet til "off"-tilstand, hvis det allerede er i "on"-tilstand. Dette vil danne en pålidelig irreversibel kontakt. Hvordan man designer en simpel biologisk switch er beskrevet i et konferenceoplæg [10] .
Der er ingen en-til-en-korrespondance mellem netværkstopologier, fordi mange netværk har lignende ind- og udgående relationer. Netværkstopologi indebærer ikke input eller output, og på samme måde indebærer input eller output ikke netværkstopologi. Det er af denne grund, at parametrering er meget vigtig for driften af kredsløbet. Hvis dynamikken i inputtet er sammenlignelig med eller hurtigere end systemets respons, kan responsen virke hysteretisk.
Nedenfor er beskrevet tre cellecyklus-omskiftere, der giver bratte og/eller irreversible overgange ved brug af nogle af de ovenfor beskrevne mekanismer.
G1/S - overgangen , bedre kendt som kontrolpunktet i spirende gær (restriktionspunkt i andre organismer), regulerer forløbet af cellecyklussen [1] . Ved dette kontrolpunkt stopper cellerne enten før replikering af DNA (på grund af næringsrestriktion eller et feromonsignal), forlænger G1 (størrelseskontrol), eller begynder replikation og gennemgår resten af cellecyklussen. G1/S regulatoriske netværk eller regulon i spirende gær omfatter cycliner G1 Cln1, Cln2 og Cln3, Cdc28 (Cdk1), transkriptionsfaktorer SBF og MBF og transkriptionshæmmer Whi5 [2] . Cln3 interagerer med Cdk1 for at initiere en sekvens af hændelser ved phosphorylering af en lang række mål, herunder SBF, MBF og Whi5 . Fosforylering af Whi5 får det til at bevæge sig ud af kernen, hvilket forhindrer det i at blive hæmmet af SBF og MBF. Aktiv SBF/MBF driver G1/S-overgangen, inklusive B-type cycliner og initiering af DNA-replikation, knopdannelse og spindelduplikation. Desuden regulerer SBF/MBF ekspressionen af Cln1 og Cln2, som også kan interagere med Cdk1 for at fremme phosphorylering af dets mål.
Denne G1/S-switch blev oprindeligt antaget at fungere som en lineær sekvens af begivenheder, der starter ved Cln3 og slutter ved fase S [11] . Imidlertid indikerer observationen, at enten Clns var tilstrækkelig til at aktivere regulonet, at Cln1 og Cln2 muligvis kan bruge positiv feedback til at aktivere deres egen transkription. Dette ville resultere i en konstant accelererende cyklus, der kunne fungere som en irreversibel bistabil flip-flop [2] . Scotheim et al. brugte enkeltcellemålinger i spirende gær for at vise, at denne positive feedback faktisk forekommer [2] . En lille mængde Cln3 inducerer ekspressionen af Cln1/2, og derefter kommer en feedback-løkke i spil, hvilket fører til en hurtig og brat udgang af Whi5 fra kernen og følgelig sammenhængende ekspression af G1/S regulon-generne. I fravær af sammenhængende genekspression tager celler længere tid om at forlade G1, og en betydelig del stopper endda før S-fasen, hvilket understreger vigtigheden af positiv feedback til at forbedre G1/S-omskifteren.
G1/S-cellecykluskontrolpunktet kontrollerer overgangen af eukaryote celler fra den første fase af G1-gabet til DNA-syntesefasen, S. I dette skifte i pattedyrsceller er der to cellecykluskinaser, der hjælper med at kontrollere kontrolpunktet: cellecyklisk kinaser CDK4/6-cyclin D og CDK2-cyclin E [1] . Et transkriptionskompleks inklusive Rb og E2F er vigtigt for kontrollen af dette kontrolpunkt. I den første gap-fase binder Rb-HDAC-repressorkomplekset til E2F-DP1-transkriptionsfaktorerne og hæmmer derved nedstrøms transkription. Fosforylering af Rb med CDK4/6 og CDK2 dissocierer Rb-repressorkomplekset og tjener som en cellecyklusomskifter. Efter phosphorylering af Rb fjernes inhiberingen af den transskriptionelle aktivitet af E2F. Dette muliggør transkription af S-fase gener, der koder for proteiner, der forbedrer G1-skiftet til S-fase.
Mange forskellige stimuli bruges til at kontrollere kontrolpunkter, herunder TGFb, DNA-skader, kontakthæmning, replikativ aldring og tilbagetrækning af vækstfaktorer. De første fire virker ved at inducere medlemmer af INK4- eller Kip/Cip-familien af cellecykluskinasehæmmere. TGFb hæmmer transkription af Cdc25A, en phosphatase, der aktiverer cellecykluskinaser, og fjernelse af vækstfaktor aktiverer GSK3b, som phosphorylerer cyclin D. Dette fører til dets hurtige ubiquitinering [12] .
G2 begynder med E2F-medieret transkription af cyclin A, som danner cyclin A-Cdk2-komplekset. For at fortsætte til mitose aktiveres cyclin B - Cdk1-komplekset (først opdaget som en faktor, der bidrager til MPF eller M-fase; Cdk1 er også kendt som Cdc2 i fissionsgær og Cdc28 i spirende gær) af Cdc25 , en proteinphosphatase [1 ] . Når mitosen begynder, desintegrerer kernehylsteret, kromosomerne kondenserer og bliver synlige, og cellen forbereder sig på at dele sig. Aktivering af cyclin B -Cdk1 fører til ødelæggelse af kernemembranen, hvilket er typisk for initiering af mitose [1] .
Cyclin B-Cdk1-komplekset er involveret i et regulatorisk kredsløb, hvori Cdk1 kan fosforylere og aktivere sin aktivator, Cdc25 (positiv feedback), og fosforylere og inaktivere dens inaktivator, Wee1 -kinase (dobbelt negativ feedback) [1] . Dette kredsløb kan fungere som en bistabil flip-flop [13] med en stabil tilstand i G2 (Cdk1 og Cdc25 slukket, Wee1 tændt) og en anden stabil tilstand i fase M (Cdk1 og Cdc25 aktive, Wee1 slukket). Imidlertid er Wee1 selv reguleret af andre faktorer såsom Cdr2 .
Dette er blevet foreslået og forsvaret af Jin et al. [14] i deres serie af eksperimenter med den humane HeLa-cellelinje i 1998 viste, at det er det rumlige arrangement af cyclin B inde i cellen, der initierer mitose. Som det er kendt fra tidligere forsøg med både humane celler og søstjerneoocytter, har Jin et al. opsummere, at cyclin B1 er rigeligt i cytoplasmaet under mitosens ikke-delende faser, men identificeres i kernen i kompleks med Cdk1 lige før cellen går ind i mitose. Andre forsøgspersoner har vist, at celler ikke vil dele sig, hvis cyclin B forbliver i cytoplasmaet. For yderligere at undersøge effekten af cyclin B rumlige position på celledeling og cykluskontrol, Jin et al. mærket cyclin B med et nuklear lokaliseringssignal (NLS), som holder cyclin inde i kernen. Til at begynde med producerede denne cyclin B NLS ikke den forventede effekt af accelereret indtræden i mitose. Dette resultat skyldes hæmningen vist i figuren nedenfor. Wee1, en hæmmer af cyclin B-Cdk1-komplekset, er lokaliseret i kernen og phosphorylerer sandsynligvis cyclin B NLS, hvilket gør det ude af stand til at virke efter hensigten. Dette postulat blev bekræftet, da Jin et al. brugte Cdc2AF, en ikke-phosphoryleret mutant af Cdk1, og observerede accelereret indtræden i celledeling på grund af nuklear lokalisering af cyclin B. Derfor er nuklear lokalisering af cyclin B nødvendig, men ikke tilstrækkelig til at udløse celledeling.
I en undersøgelse af cellecyklusregulering har Jin et al. manipulerede celler for at vurdere lokaliseringen af cyclin B i celler med DNA-skade. Gennem en kombination af DNA-skade og nuklear lokalisering af eksogent cyclin B var de i stand til at bestemme, at celler ville dele sig selv med DNA-skader, hvis cyclin B blev tvunget til at blive udtrykt i kernen. Dette indikerer, at den rumlige lokalisering af cyclin B kan spille rollen som mitosekontrolpunkt. Hvis celler normalt ikke deler sig, når deres genetiske information er beskadiget, men går i mitose, hvis endogent cyclin B udtrykkes i kernen, er det sandsynligt, at translokation af cyclin B til cytoplasmaet er den mekanisme, der forhindrer umoden mitotisk indtrængen. Denne hypotese blev yderligere bekræftet af Jin et al. Analyse af celler tilbageholdt i G2 på grund af DNA-skade. I disse celler har Jin et al. observerede høje niveauer af aktivitet af cyclin B-Cdc2-komplekset i cytoplasmaet. Dette bekræfter den tidligere nævnte teori, da den viser, at Cdc2 kan aktivere cyclin uden umiddelbar translokation til kernen. Derudover understøtter akkumuleringen af cyclin B-Cdk1-komplekser i cytoplasmaet af celler, som ikke deler sig på grund af DNA-skade, teorien om, at det er den nukleare lokalisering af cyclin B, der initierer mitotisk indtrængen.
Således spiller den rumlige lokalisering af cyclin B en rolle i indtræden i mitose. Translokation af cyclin B fra cytoplasmaet til kernen er nødvendig for celledeling, men er ikke tilstrækkelig, da dets inhibitorer ikke tillader cellen at gå ind i mitose for tidligt. Udover at reservere hæmning af cyclin B-Cdk1 komplekset forhindres for tidlig celledeling ved translokation af selve cyclin B. Cyclin B-Cdk1 komplekset vil forblive i cytoplasmaet i celler med DNA-skade frem for at flytte til kernen, hvilket forhindrer celle i at hæmme cellens indtræden i mitose. Det næste spørgsmål stillet af forskere på dette område er, hvilken specifik mekanisme der regulerer denne translokation.
Santos et al. [15] foreslog, at cyclin B-translokation reguleres af en positiv feedback-mekanisme svarende til den, der regulerer aktiveringen af cyclin B-Cdk1-komplekset. De mente, at en positiv feedback-loop involverede phosphorylering af cyclin B og dets translokation til kernen. For at begynde at udforske dette bekræftede de først nogle af resultaterne fra Jin et al. eksperimenter med immunfluorescens til at vise cyclin B i cytoplasmaet før deling og translokation ind i kernen for at initiere mitose, hvilket de brugte sammenlignet med nuklear envelope disruption (NEB). Ved at bruge nuklear cyclin, som ikke kan inaktiveres af Wee1 eller Myt1, observerede Santos et al., at aktivt nuklear cyclin rekrutterer mere cyclin fra cytoplasmaet til at bevæge sig ind i kernen. De bekræftede denne observation ved at bruge iRap-behandling med rapamycin. iRap inducerer translokation af mærket cyclin B fra cytoplasmaet til kernen. Især Santos et al. så, at umærket cyclin B migrerer med cyclin B under påvirkning af iRap. Umærket cyclin reagerer ikke på behandling og bevæger sig uafhængigt af behandlet cyclin. Dette bekræfter den første del af den positive feedback-loop, at nuklear lokalisering af cyclin B, som fører til mitotisk indtrængen, fremmer øget translokation af cytoplasmatisk cyclin B ind i kernen, hvilket yderligere letter migrationen af det resterende cytoplasmatiske cyclin B ind i kernen osv. .
Santos et al. foreslår endvidere, at cyclin B-phosphorylering er en anden komponent i den positive feedback-loop. De bemærkede, at cyclin B naturligt kommer ind i kernen før NEB. I modsætning hertil kommer muteret, ikke-phosphoryleret cyclin B ind i kernen under NEB. Dette er overraskende, da det er karakteristisk for cellecyklussen at flytte cyclin ind i kernen før NEB for at få cellecyklussen til at udvikle sig til mitotisk deling. Således har Santos et al. konkludere, at phosphorylering af cyclin B fremmer translokation til kernen. Men derudover fremmer translokation til kernen cyclin-phosphorylering. Forfatterne bemærker, at phosphoryleringen af cyclin B i kernen er nitten gange mere gunstig end i cytoplasmaet på grund af det mindre totale volumen af kernen, hvilket giver en højere phosphoryleringshastighed. Øget translokation på grund af phosphorylering og øget phosphorylering på grund af translokation illustrerer en positiv feedback-loop, der ligner den tidligere opdagede, der aktiverer cyclin B-Cdk1-komplekset.
Som konklusion er nuklear lokalisering af cyclin B nødvendig for celleindtræden i mitose. Translokationen af cyclin fra cytoplasmaet til kernen, som sikrer celledeling, reguleres af en positiv feedback-loop. Aktivt cyclin B bevæger sig ind i kernen og fremmer aktiveringen og bevægelsen af yderligere cyclin-enheder placeret i kernen. Dette fænomen forstærkes, når man overvejer phosphorylering. Fosforylering af cyclin B fremmer nuklear translokation, og cyclin B i kernen er meget mere tilbøjelige til at blive phosphoryleret, så nuklear lokalisering fremmer igen cyclin B-phosphorylering.
Når først celler er i mitose, aktiverer cyclin B-Cdk1 det anafasestimulerende kompleks (APC), som igen inaktiverer cyclin B-Cdk1 ved at nedbryde cyclin B, hvilket i sidste ende fører til udgang fra mitose. Kombinationen af den bistabile responsfunktion af Cdk1 med negativ feedback fra APC kan generere den såkaldte afslapningsoscillator [3] med skarpe udbrud af Cdk1-aktivitet, der udløser stabile mitotiske cyklusser. Men i afslapningsoscillatoren bevæger kontrolparameteren sig langsomt i forhold til systemets responsdynamik, hvilket kan være en nøjagtig repræsentation af mitotisk input, men ikke nødvendigvis mitotisk output.
Det er nødvendigt at inaktivere cyclin B-Cdk1-komplekset for at forlade det mitotiske stadium af cellecyklussen. Cellerne kan derefter vende tilbage til den første fase af G1-gabet og vente, indtil cyklussen fortsætter igen.
I 2003 skrev Pomerening et al. gav stærke beviser for denne hypotese ved at demonstrere hysterese og bistabilitet i Cdk1-aktivering i cytoplasmatiske ekstrakter af Xenopus- oocytter [3] . De demonstrerede først et intermitterende spidsrespons af Cdk1 på en ændring i koncentrationen af ikke-nedbrydeligt Cyclin B (for at afkoble Cdk1-responsnetværket fra APC-medieret negativ feedback). En sådan respons vil dog svare til både en monostabil superfølsom overgang og en bistabil overgang. For at skelne mellem disse to muligheder målte de steady-state-niveauer af aktivt Cdk1 som reaktion på skiftende cyclin-niveauer, men i to separate eksperimenter startede det ene med et interfaseekstrakt og det andet startede med et ekstrakt, der allerede var i mitose. Ved mellemliggende koncentrationer af cyclin fandt de to stationære koncentrationer af aktivt Cdk1. Hvilken af de to steady states, der var optaget, afhang af systemets historie, dvs. om de startede med en interfase eller mitotisk ekstrakt, der effektivt udviste hysterese og bistabilitet.
Samme år nåede Sha et al. [16] uafhængigt af hinanden til den samme konklusion ved at finde en hysterese-løkke også ved hjælp af Xenopus laevis-ægekstrakter. Tre forudsigelser af Nowak-Tyson- modellen blev testet i dette papir for at konkludere, at hysterese er drivkraften bag "cellecyklusovergange ind og ud af mitose". Forudsigelserne af Nowak-Tyson-modellen er fælles for alle saddelpunktbifurkationer. Sadelspidsbifurkationer er ekstremt nyttige i en uperfekt verden, fordi de hjælper med at beskrive uperfekte biologiske systemer. Den første forudsigelse var, at tærskelkoncentrationen af cyclin for at gå ind i mitose er højere end tærskelkoncentrationen af cyclin for at forlade mitose, og dette blev bekræftet ved supplering af cykliske ægekstrakter med ikke-nedbrydeligt cyclin B og måling af aktiverings- og inaktiveringstærsklen efter tilsætning af cycloheximid (CHX), som er en inhibitor af proteinsyntese [1] . Derudover blev den anden forudsigelse af Nowak-Tyson-modellen også bekræftet: ikke-replikeret deoxyribonukleinsyre eller DNA øger tærskelkoncentrationen af cyclin, der kræves for at komme ind i mitose. For at nå denne konklusion blev CHX, APH (DNA-polymerasehæmmer) eller begge dele og ikke-nedbrydeligt cyclin B tilsat til ekstrakterne frigivet af den cytostatiske faktor. Den tredje og sidste forudsigelse, der blev testet og bekræftet i denne artikel, var, at hastigheden af Cdc2-aktivering aftager nær tærskelkoncentrationen for cyclinaktivering. Disse forudsigelser og eksperimenter demonstrerer skiftadfærd svarende til skift, som kan beskrives ved hysterese i et dynamisk system [17] .
Under overgangen fra metafase til anafase er det ekstremt vigtigt, at søsterkromatider adskilles korrekt og samtidigt i modsatte ender af cellen [1] . Søsterkromatidseparation er indledningsvis stærkt hæmmet for at forhindre for tidlig adskillelse i sen mitose, men denne hæmning dæmpes ved ødelæggelse af de inhiberende elementer af det anafasestimulerende kompleks (APC), når søsterkromatidbiorientering er opnået. Et sådant hæmmende element er securin , som forhindrer ødelæggelsen af cohesin , komplekset, der holder søsterkromatider sammen, ved at binde til en proteaseseparase , som målretter Scc1 , en underenhed af cohesinkomplekset , til ødelæggelse. I dette system kan Cdc14 -phosphatase fjerne hæmmende fosfat fra securin og derved lette nedbrydningen af APC-securin ved at frigive separase. Som vist af Uhlmann et al., under bindingen af kromosomer til den mitotiske spindel, forbliver kromatider i par, da binding mellem søstre forhindrer adskillelse [8] [18] . Kohæsion etableres under DNA-replikation og afhænger af cohesin, som er et multi-underenhedskompleks bestående af Scc1, Scc3, Smc2 og Smc3. I gær, under overgangen fra metafase til anafase, adskilles Scc1 fra kromosomer, og søsterkromatider adskilles. Denne virkning styres af Esp1-proteinet, som er tæt bundet til anafasehæmmeren Pds1, som nedbrydes af det anafasestimulerende kompleks. For at verificere, at Esp1 faktisk spiller en rolle i reguleringen af Scc1 kromosomassociation, blev cellestammer standset ved G1 med alfafaktor. Disse celler forblev i en standsningstilstand under udviklingen. Mutante Esp1-1-celler blev brugt, og eksperimentet blev gentaget, hvor Scc1 med succes bindede til kromosomer og forblev forbundet selv efter ophør af syntese. Dette var vigtigt for at demonstrere, at med Esp1 hæmmes evnen af Scc1 til at blive stabilt forbundet med kromosomer under G1, og Esp1 kan faktisk fjerne Scc1 fra kromosomerne direkte.
Dette er blevet vist af Holt et al. [4] at separase aktiverer Cdc14, som igen virker på securin, og dermed skaber en positiv feedback-loop, der forbedrer metafase-til-anafase overgangsklarhed og koordinering af søsterkromatid-separation [19] . Holt et al. undersøgte grundlaget for den positive feedback-effekt på securin-phosphorylering ved hjælp af mutante securin-gærstammer og testede, hvordan ændringer i securin-phosphorregulering påvirker synkroniseringen af søsterkromatid-separation. Deres resultater indikerer, at interferens med denne securin-separase-cdc14 positive sløjfe reducerer synkroniseringen af søsterkromatidseparation. Denne positive feedback kunne hypotetisk generere bistabilitet ved overgangen til anafase, hvilket får cellen til at træffe en irreversibel beslutning om at adskille søsterkromatider.
Udgangen fra mitosen er et vigtigt overgangspunkt, der markerer slutningen af mitosen og begyndelsen på en ny G1-fase for cellen, og cellen skal stole på specifikke kontrolmekanismer, så den efter at have forladt mitosen aldrig vender tilbage til mitosen, før den er komplet. Bestået trin G1, S og G2 og bestået alle nødvendige kontrolpunkter. Mange faktorer, herunder cycliner , cyclin-afhængige kinaser (CDK'er), ubiquitin-ligaser , inhibitorer af cyclin-afhængige kinaser og reversibel phosphorylering , regulerer mitotisk exit for at sikre, at cellecyklushændelser forekommer i den korrekte rækkefølge med de færreste fejl [20] . Slutningen af mitose er karakteriseret ved opløsning af spindlen, afkortning af kinetochore mikrotubuli og den udtalte udvækst af astrale (nonkinetochore) mikrotubuli [21] . For en normal eukaryot celle er udgang fra mitose irreversibel [22] .
Mange forslag er blevet fremsat vedrørende de kontrolmekanismer, som cellen bruger til at sikre irreversibiliteten af udgang fra mitose i en model eukaryot organisme, den spirende gær Saccharomyces cerevisiae . Proteolytisk nedbrydning af cellecyklusregulatorer og den tilsvarende effekt på niveauerne af cyclinafhængige kinaser er blevet foreslået som en mekanisme, der fremmer den eukaryote cellecyklus og især overgangen fra metafase til anafase. I denne teori fremmer det anafasestimulerende kompleks (APC), en klasse af ubiquitinligase, nedbrydningen af mitotiske cycliner (Clb2) og anafasehæmmende faktorer (PDS1, CUT2) for at fremme mitose-exit [23] . APC ubiquitinerer et ni-aminosyre-motiv kendt som en disruption box (D-box) i det NH2-terminale domæne af mitotiske cycliner til proteasomnedbrydning [23] . APC i forbindelse med Cdc20 (APC-Cdc20) ubiquitinerer og målretter mitotiske cycliner (Clb2) til nedbrydning i den indledende fase. Samtidig medierer APC-Cdc20 nedbrydningen af securiner, som hæmmer separaser ved at binde tidligt i anafasen. Den frigivne og aktive separase spalter cohesin, som holder søsterkromatider sammen, hvilket letter søsterkromatidadskillelse og initierer mitotisk exit, hvilket fremmer frigivelsen af Cdc14 fra nukleolus [24] [25] . I en senere fase fremmer nedregulering af Cdk1 og aktivering af Cdc14, en Cdh1-aktiverende phosphatase, dannelsen af APC i forbindelse med Cdh1 (APC-Cdh1) for at nedbryde Clb2 [22] . Cdc20 og Cdh1, som er APC-aktivatorer, rekrutterer substrater såsom securin og B-type cycliner (Clb) til ubiquitinering [26] . Uden Cdk1-Clb2-komplekser til at phosphorylere proteiner, der er involveret i spindeldynamik, såsom Sli15, Ase1 og Ask1 , sikres spindelforlængelse og kromosomal segregation, hvilket letter udgang fra mitose [22] . Betydningen af proteolytisk nedbrydning i den eukaryote cellecyklus har ændret synet på celledeling som en simpel kinasekaskade til en mere kompleks proces, der kræver interaktioner mellem phosphorylering, ubiquitinering og proteolyse [23] . Forsøg med spirende gærceller med cdc28-as1, en INM-PP1 (ATP-analog)-følsom Cdk-allel, har imidlertid bevist, at ødelæggelse af B-type cycliner (Clb) ikke er nødvendig for at udløse irreversibel udgang fra mitose [22] . Clb2-nedbrydning forkorter den periode af Cdk1-hæmning, der kræves for at udløse irreversibel mitotisk exit, hvilket indikerer, at cyclinproteolyse bidrager til den dynamiske natur af den eukaryote cellecyklus på grund af dens langsommere virkningstid, men det er usandsynligt, at det er den vigtigste determinant for at udløse en irreversibel cellecyklus.. overgange [22] .
Der er gjort opdagelser, der indikerer vigtigheden af niveauet af inhibitorer af cyclin-afhængige kinaser i reguleringen af den eukaryote cellecyklus. Det er især blevet vist, at niveauet af Sic1 , en støkiometrisk inhibitor af Clb-CDK-komplekser i spirende gær, er særligt vigtigt for den irreversible G1-S-overgang på grund af den irreversible aktivering af S-fase kinaser [27] . Det har vist sig, at Sic1-niveauet spiller en vigtig rolle i at udløse den irreversible udgang fra mitose (M-G1-overgang) såvel som i G1-S-overgangen. Under mitose fører et fald i Cdk1-niveauer til aktiveringen af Cdc14, en fosfatase, der modvirker Cdk1 gennem aktiveringen af Cdh1 og Swi5, en transkriptionel aktivator af Sic1-proteinerne [28] . Mens nedbrydning af Sic1 til et vist lavt niveau udløste S-fase, var akkumulering af Sic1 til et vist højt niveau påkrævet for at udløse irreversibel udgang fra mitose [22] . Cdk1-hæmmere kan inducere mitotisk exit, selv når nedbrydningen af B-type cycliner blokeres af ekspressionen af ikke-nedbrydelige Clb'er eller proteasomhæmmere. Søsterkromatider formår imidlertid ikke at segregere, og celler vender tilbage til mitose, efter at inhibitorer er udvasket, hvilket indikerer, at et tærskelniveau af inhibitorer skal nås for at udløse irreversibel mitotisk exit uafhængigt af cyclin-nedbrydning [29] . På trods af de forskellige Sic1-niveautærskler, der kræves for at udløse mitotisk exit sammenlignet med G1-S-overgangen, har Sic1-niveau vist sig at spille en nøglerolle i reguleringen af den eukaryote cellecyklus ved at hæmme CDK-aktivitet.
Fordi den eukaryote cellecyklus involverer mange proteiner og regulatoriske interaktioner, kan en dynamisk systemtilgang bruges til at forenkle en kompleks biologisk kæde til en fælles struktur for bedre analyse [30] . Blandt de fire mulige input/output-forhold ser forholdet mellem Sic1-niveau og mitotisk exit ud til at udvise karakteristika for en irreversibel bistabil switch drevet af feedback mellem APC-Cdh1, Sic1 og Clb2-Cdk1 [22] . Bistabilitet er kendt for at kontrollere biologiske funktioner såsom cellecykluskontrol og celledifferentiering og spiller en nøglerolle i mange cellulære regulatoriske netværk [31] . En bistabil input/output-forbindelse er karakteriseret ved to stabile tilstande med to bifurkationspunkter. Flere udgange er mulige for en bestemt indgang i bistabilitetsområdet markeret med to bifurkationspunkter. Desuden udviser bistabil kobling hysterese: den endelige tilstand/output afhænger af inputhistorien såvel som den aktuelle værdi af input, da systemet har en hukommelse [32] . Et bifurkationspunkt har en negativ værdi af kontrolparameteren (bifurkationspunktet er på den anden side af aksen), hvilket fører til et mellemrum mellem de to stabile tilstande og irreversibiliteten af overgangen fra en tilstand til en anden. Med hensyn til udgang fra mitose er de to stabile tilstande bestemt af mitose og G1-fasen. Når niveauet af Sic1 (input) overstiger tærsklen, er der en irreversibel overgang fra mitose (stabil tilstand I) til G1-fasen (stabil tilstand II). I et uperfekt miljø er den eneste bifurkation, der forbliver uændret, sadel-node bifurkationen . Saddel-node bifurkation er ikke krænket (sadel-node er den forventede generelle adfærd), mens transkritiske og gaffel bifurkationer ikke krænkes i nærværelse af ufuldkommenheder [33] . Den eneste endimensionelle bifurkation, der kan eksistere i en uperfekt biologisk verden, er saddel-node bifurkationen [32] . Den bistabile forbindelse mellem M-G1-overgangen og Sic1-niveauet kan repræsenteres som et diagram af to saddel-node-bifurkationer, hvor systemets opførsel kvalitativt ændres med en lille ændring i kontrolparameteren, værdien af Sic1.
Da opførselen af cellecyklussen er kritisk afhængig af mængden af Sic1 i M-G1 overgangstilstanden, er mængden af Sic1 stramt reguleret af feedback på systemniveau. Da Cdk1-Clb2 hæmmer Sic1 ved at phosphorylere Sic1 og gøre Sic1 tilgængelig for nedbrydning via ubiquitinering, reducerer APC-Cdh1-afhængig nedbrydning af Cdk1-Clb2 ikke kun niveauet af tilgængelige Cdk1-Clb2-komplekser, men øger også niveauet af Sic1, hvilket i tur yderligere hæmmer funktionen af Cdk1-Clb2 [28] . Denne dobbelte negative feedback-sløjfeaktivering initieres af APC-Cdc20-afhængig nedbrydning af Cdk1-Clb2 og frigivelse af Cdc14 fra det nukleolære Net1/Cfi1-protein [34] . FEAR (anaphase early release of Cdc14)-vejen letter Clb2-Cdk1-afhængig Net1-phosphorylering, som forbigående frigiver Cdc14 fra Net1 [35] . De frigivne Cdc14- og Clb2-Cdk1-komplekser passerer ind i spindlen, som aktiverer det mitotiske udgangsnetværk (MEN). MEN sikrer vedvarende frigivelse af Cdc14 fra nukleolus [35] og Cdc14 modvirker Clb2-Cdk1 aktivitet ved at aktivere Cdh1 og stabilisere Sic1 via aktivering af Sic1 transkriptionelle aktivator Swi5 [36] . Sic1 regulerer sig selv positivt ved at hæmme Cdk1-Clb2 for at frigive Swi5-hæmning, og Cdh1 regulerer også sig selv positivt ved at hæmme Clb2-Cdk1 for at frigive MEN-hæmning, hvilket kan aktivere Cdc14 og derefter Cdh1 selv. Den dobbelte negative feedback-løkke dannet af APC-Cdh1 og Sic1 er nødvendig for at opretholde lav Clb2-Cdk1-aktivitet, da Clb2 automatisk aktiverer sin syntese ved at aktivere transkriptionsfaktorer, Fkh2-Mcm1 Ndd1 - komplekset [28] .
Den eukaryote cellecyklus består af forskellige kontrolpunkter og feedback-loops for at sikre korrekt og vellykket celledeling. For eksempel, under mitose, når duplikerede kromosomer er ukorrekt fastgjort til den mitotiske spindel, inhiberer spindle assembly checkpoint (SAC) proteiner, inklusive Mad og Bub, APC-Cdc20, hvilket forsinker indgangen til anafase og nedbrydning af B-type cyclin. Derudover, når mitotiske spindler forskydes, hæmmes MEN og efterfølgende Cdc14 af Bub2 og Bfa1-afhængigt for at forhindre nedbrydning af mitotiske cycliner og indtræden i anafase [36] . Sic1 er et godt eksempel på, hvordan feedback-sløjfer på systemniveau interagerer for at registrere miljøforhold og udløse cellecyklusovergange. Selvom den faktiske M-G1-overgang er ekstremt kompleks, der involverer mange proteiner og reguleringer, giver den dynamiske systemtilgang os mulighed for at forenkle dette komplekse system til et bistabilt input/output forhold med to saddelknudebifurkationer, hvor outputtet (mitotisk output) afhænger af kritisk koncentration. Sic1. Ved hjælp af univariat analyse kunne man forklare de mange irreversible overgangspunkter i den eukaryote cellecyklus, der reguleres af kontrol og feedback på systemniveau. Andre eksempler på irreversible overgangspunkter omfatter Start (en irreversibel forpligtelse til en ny celledelingscyklus), som kan forklares ved en irreversibel bistabil switch, hvis kontrolparameter er stramt reguleret af systemfeedback, herunder Cln2, Whi5 og SBF [ 37] .
| cellecyklus | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Faser |
| ||||||||||
| Regulatorer |
| ||||||||||