Calponin ( eng. Calponin ) er et medlem af familien af actin-bindende proteiner, typisk typisk for glatte muskelceller , der binder G- og F - actin . Calponiner er produktet af 3 gener og er opdelt i det såkaldte α-calponin (h1 eller basisk, 292 a.k. , 34 kDa), β-calponin (252 a.k.) - som er produktet af det samme gen som α- calponin men med en deletion af aminosyrer i segmentet 216-256. To andre isoformer, neutral calponin (h2 calponin) og sur calponin, udtrykkes i glat muskulatur og ikke-muskelceller. Andre repræsentanter for calponiner er SM22 og transgelin. Calponin tager sit navn fra CH- eller Calponin Homology-domænet, der er til stede blandt mange ABP'er (aktinbindende proteiner ). På trods af dette faktum viser calponin ikke actinbinding gennem dette sted (Gimona og Mital, 1998), men binder i stedet lipider (Bogatcheva og Gusev, 1995; Fujii et al., 1995). Det aktinbindingssted menes (Mezgueldi et al., 1992) at være lokaliseret i området mellem CH-domænet og calponin-lignende gentagelser (CLIK - calponin-lignende gentagelse). Calponin er termostabilt. Molekylvægten af den glatte muskelisoform er 34 kDa. Andre væv præsenterer mere sure calponinisoformer, der ikke binder calcium , men binder calmodulin . Binding af Ca2 + /calmodulin hæmmer binding til actin. Fosforylering af calponin med serin-threoninkinaser fører til en lignende virkning . Calponin har også et tropomyosin - bindingssted.
Calponin er et actin-, calmodulin- og tropomyosin-bindende protein, der er blevet fundet i det glatte muskelvæv hos flere hvirveldyr og i nogle ikke-muskelceller. Under fremstillingen af tynde kyllingemavefilamenter blev det vist, at de indeholder actin, tropomyosin, caldesmon og calponin i et molforhold på 7:0,9:0,6:0,7. Ligesom caldesmon hæmmer calponin actomyosin ATPase - aktivitet i opløsning, glidende actin i forhold til phosphoryleret myosin in vitro , og denne hæmning udløses af Ca2 + /calmodulin. Hæmningen ophæves ved proteinphosphorylering in vitro . Disse egenskaber tyder på, at calponin kan være en yderligere regulator af actin-myosin-interaktioner.
Fuldstændig eller delvis kymotryptisk fordøjelse af calponin udføres ved 25°C under anvendelse af et vægtforhold mellem protease og substrat på henholdsvis 1:100 eller 1:1000, i 10 mM imidazol - HCI , 30 mM NaCl , 2 mM MgCl2 , 2 mM MgCl2 NaN3 , pH 7,0, i fravær eller tilstedeværelse af F-actin (4 mg/ml) (aktin/calponin molforhold = 3:1). Ved passende tidsintervaller (0-60 min) blandes veldefinerede mængder af proteiner med et lige så stort volumen af Laemmlis kogende prøvebuffer og klargøres til gelelektroforese . Til tværbindingsreaktioner og bindingsforsøg afsluttes fordøjelsen med 2,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) . Total hydrolyse af det kovalente calponin-actin-kompleks (11 mg/ml) med CNBr (67 mg/ml tilsat i to lige store mængder) udføres i 24 timer i 70% myresyre -holdig 14 mM β-mercaptoethanol.
Calponin (0,7-1,3 mg/ml) i 10 mM imidazol-HCl, 30 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 4 mM NaN3, pH 7,0, blandet med nativt eller subtilisin-spaltet F-actin (2,4-4,5 mg/ml) ( calponin/actin molforhold = 1:3) i nærvær af 2 mM EDC og 5 mM NHS. Reaktionen blev udført ved 25°C i 0-30 minutter og blev overvåget ved SDS-gelelektroforese. Caldesmon (1,4 mg/ml) tværbinder til F-actin under de samme betingelser under anvendelse af et proteinmolforhold på 1:6. Den kovalente binding mellem F-actin og det 22 kDa NH2-terminale chymotryptiske fragment af calponin opnås som følger: 60 min chymotryptisk fordøjelse af calponin, i et vægtforhold mellem enzym og substrat på 1:1000, suppleres med F-actin kl. et molforhold på 1:3, efter centrifugering ved 180.000 x g i 1 time ved 4°C, resuspenderes pelleten i imidazol-HCl, pH 7,0, buffer. Til den præparative separation af 76 kDa F-actin-calponinadduktet fra ikke- tværbundet calponin blev en opløsning af tværbundet F-actin-calponin (110 mg protein) opnået efter 45 minutters reaktion justeret i 3 mM β-mercaptoethanol, dialyseret natten over ved 4°C mod depolymeriseringspuffer ( 50 mM Tris-HCl, 0,6 mM KI, 5 mM natriumthiosulfat, 0,5 mM ATP , 0,5 mM CaCl2 og 0,5 mM β-mercaptoethanol, pH 7,5), og derefter filtreres gelen igennem en søjle af Sephacryl-S-300 (1,6 x 120 cm), ækvilibreret ved 4°C i den samme buffer. De indledende proteinfraktioner elueres indeholdende et 76 kDa-addukt fri for frit calponin, som analyseret ved gelelektroforese. De samlede fraktioner dialyseres med destilleret vand, lyofiliseres og udsættes for CNBr- fordøjelse .