Klorofylfluorescens

Klorofylfluorescens er fænomenet luminescens af klorofyl , når det absorberer lys, opstår som et resultat af tilbagevenden af molekylet fra den exciterede tilstand til grundtilstanden. Det er meget brugt som en indikator for fotosyntetisk energiomdannelse i højere planter , alger og bakterier . Ophidset klorofyl mister den absorberede lysenergi, spilder den på fotosyntese (fotokemisk energiomdannelse eller fotokemisk quenching), omdanner den til varme som følge af ikke-fotokemisk quenching eller udsender den i form af fluorescens. Da alle disse processer konkurrerer med hinanden, kan man ved at analysere klorofylfluorescensen få en idé om intensiteten af fotosyntesen og plantens sundhed [1] .

Kautsky-effekt

Efter belysning af mørkt tilpassede blade kan der observeres en hurtig stigning i Photosystem II (PSII) fluorescens efterfulgt af et langsomt fald. Dette fænomen blev første gang beskrevet af H. Kautsky og A. Hirsch i 1931. Effekten blev kaldt Kautsky-effekten efter dens opdager.

Stigningen i fluorescens skyldes, at reaktionscentrene i fotosystem II (PSII) går i en "lukket" tilstand. Et reaktionscenter siges at være "lukket", når det ikke længere er i stand til at overføre elektroner. Dette sker, når opstrøms elektronbæreren er blevet genoprettet og endnu ikke har overført sine elektroner til den næste elektronacceptor. Lukningen af reaktionscentre reducerer den samlede effektivitet af fotokemiske reaktioner (kP) og øger derfor niveauet af fluorescens (kF). Den bratte overførsel af bladet fra mørk tilstand til lys øger andelen af lukkede PSII-reaktionscentre og fører til en stigning i fluorescens i løbet af de første 1-2 sekunder. Senere svækkes fluorescensen langsomt, denne proces kan fortsætte i flere minutter. Faldet skyldes aktiveringen af "fotokemisk quenching" og overførslen af elektroner fra PSII gennem ETC af chloroplaster til NADP og carbonfikseringscyklussen, samt inklusion af ikke-fotokemiske quenching- mekanismer , som omdanner excitationsenergi til varme .

Fluorescensmålinger

Målinger begynder med at bestemme baggrundsniveauet af fluorescens , som måles ved at udsætte bladet for et kort lysglimt med lav intensitet (for PAM-enheder), utilstrækkeligt til at forårsage en fotokemisk reaktion (alle reaktionscentre er åbne), og fører derfor fuldstændig til fluorescens [2] . $F_{0}$

For at bruge måling af klorofylfluorescens til at analysere fotosyntese, skal forskere skelne mellem fotokemisk quenching og ikke-fotokemisk quenching (varmegenerering). Dette opnås ved at stoppe fotokemiske reaktioner, hvilket giver forskere mulighed for at måle fluorescens i nærværelse af ikke-fotokemisk quenching alene. For at gøre dette oplyses planten skarpt med et stærkt lysglimt eller bringes ind i lyset efter mørketilpasning. Der er en midlertidig lukning af alle PSII-reaktionscentre, og energi overføres ikke langs elektronbærerkæden. Ikke-fotokemisk quenching har ingen effekt, hvis blitzen er kort nok. Under et glimt (eller efter en pludselig eksponering af planten for lys fra mørke) er reaktionscentrene mættede med lys med en overgang til en lukket tilstand. Under sådanne forhold, når der ikke er nogen fotokemisk quenching, og ikke fotokemisk quenching er ubetydeligt lille, når fluorescens sit maksimale niveau, betegnet som fluorescensmaksimum [2] . $F_{m}$

Effektiviteten af fotokemisk quenching, som bestemmer effektiviteten af PSII, kan vurderes ved at sammenligne med det stationære niveau af fluorescens i lyset og baggrundsniveauet af fluorescens i fravær af lys egnet til fotosyntese. Effektiviteten af ikke-fotokemisk quenching varierer afhængigt af forskellige interne og eksterne faktorer. Dens styrkelse fører til en stigning i varmeafgivelsen og et fald i . Da det er umuligt fuldstændigt at stoppe spredning af termisk energi, er det umuligt at måle klorofylfluorescens i fuldstændig fravær af ikke-fotokemisk quenching. Derfor bruger forskere det mørke tilpasningspunkt ( ), som de sammenligner den beregnede værdi af ikke-fotokemisk quenching med [2] . $F_{m}$ $F_t$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{m}^{0))$

Generelle fluorescensparametre

$F_{0}$ : Minimum fluorescens (i relative enheder). Fluorescensniveau under forhold, hvor alle reaktionscentre antages at være åbne (mørketilpasning).

$F_{m}$ : Maksimal fluorescens (i relative enheder). Fluorescensniveau ved glimt af høj intensitet. Alle reaktionscentre anses for lukkede.

${F_{0))'$ : Minimum fluorescens (i relative enheder) under lystilpasningsforhold. Fluorescensniveauet af den bestrålede prøve, som er reduceret sammenlignet med på grund af tilstedeværelsen af ikke-fotokemisk quenching. $F_{0}$

${F_{m))'$ : Maksimal fluorescens (i relative enheder) under lystilpasningsforhold. Fluorescensniveau af en prøve bestrålet med mættende lysimpulser, der midlertidigt dækker alle PSII-reaktionscentre.

${\displaystyle F_{tr))$ : Terminal fluorescens (i relative enheder). Slukning af fluorescens ved afslutningen af testen.

$T_{{1/2}}$ : Halvdelen af hævetiden fra til . $F_{0}$ $F_{m}$

Designparametre

${\displaystyle F_{v))$ : Variabel fluorescens. Beregnet som = - [3] . ${\displaystyle F_{v))$ $F_{m}$ $F_{0}$

${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ : Forholdet mellem variabel fluorescens og maksimal fluorescens. Beregnet som . [4] . Det er et mål for den maksimale effektivitet af PSII (hvis alle centre var åbne). kan bruges til at vurdere den potentielle effektivitet af PSII, når prøver måles under mørke tilpasningsforhold. ${\displaystyle {\frac {F_{m}-F_{0}}{F_{m))))$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

$qP$ : Fotokemisk bratkøling. denne parameter giver et groft skøn over andelen af åbne PSII-reaktionssteder. Beregnet som [5] . ${\frac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ : Effektivitet af fotokemiske reaktioner af fotosystem II. Beregnet som = [6] . Denne parameter angiver andelen af lys absorberet af PSII, der blev brugt i fotokemiske reaktioner. Som sådan kan det give et mål for hastigheden af lineær elektrontransport og karakteriserer derfor al fotosyntese som helhed. $Y_{(II)}$ ${\tfrac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'}}$

$\Phi _{PSII}$ giver et skøn over effektiviteten af fotosyntesen , og fortæller os, hvilke processer der påvirker effektiviteten. Lukning af reaktionscentre som følge af høj lysintensitet vil ændre værdien . Ændringer i effektiviteten af ikke-fotokemisk quenching vil ændre forholdet . $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$ $qP$ ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$

Praktisk brug

Fotosystem II effektivitet som et mål for fotosyntese

Klorofylfluorescens bruges til at måle niveauet af fotosyntese, men i sin kerne er dette en oversimplifikation. Fluorescens kan bruges til at måle effektiviteten af PSII-fotokemi, som kan bruges til at estimere hastigheden af lineær elektrontransport ved at multiplicere med lysintensitet. Men når forskere siger "fotosyntese", mener de normalt kulstoffiksering . Elektrontransport og CO 2 -fiksering har en ret god korrelation, men dette kan muligvis ikke observeres i felten på grund af konkurrerende processer såsom fotorespiration , nitrogenmetabolisme og Mehler-reaktionen .

Forholdet mellem elektrontransport og kuldioxidfiksering

At måle klorofylfluorescens og gasudveksling samtidigt for at få et komplet billede af, hvordan planter reagerer på deres miljø, kræver en seriøs og sofistikeret forskningsteknik. En metode er samtidig at måle CO 2 -fiksering og PSII fotokemiske reaktioner ved forskellige lysintensiteter under forhold, der undertrykker fotorespiration . Grafer over CO 2 - fiksering og PSII fotokemiske reaktioner gør det muligt at beregne antallet af elektroner , der kræves til assimilering af et CO 2 - molekyle . Baseret på denne vurdering er det muligt at estimere niveauet af fotorespiration . Denne metode bruges til at undersøge betydningen af fotorespiration som en fotobeskyttende mekanisme under tørke.

Sobradu (2008) [7] studerede gasudveksling og klorofylfluorescens som reaktion på høj lysintensitet hos pioner- og skovarter. Ved middagstid blev gasudvekslingen af blade målt med måling af det totale niveau af fotosyntese og den intercellulære koncentration af CO 2 ( ). I de samme blade blev klorofylfluorescensparametre (baggrund ; maksimum ; og variabel ) målt. Resultaterne viste, at på trods af, at pioner- og skovareter stammer fra forskellige levesteder, viste begge en lignende modtagelighed for middagsfotoinhibering . $C_{i}$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Måling af stressniveauer og modstandsdygtighed

Klorofylfluorescens gør det muligt at måle planters stressniveau. Ud fra dets niveau kan man bedømme niveauet af eksponering for abiotisk stress, da ekstreme temperaturer, overdreven belysning og tørke påvirker plantemetabolismen negativt. Dette fører igen til en ubalance mellem absorptionen af lysenergi af klorofyl og brugen af denne energi i fotosynteseprocessen [8] .

Favaretto et al. (2010) [9] undersøgte høj lystilpasning i pioner- og sen successionsarter dyrket under forhold på 100 % (sol) og 10 % (skygge) af normalt lys. Faldet i fuldt lys viste sig at være større hos sene successionsarter end hos pionerarter. Samlet set indikerer disse resultater, at pionerarter vokser bedre i fuldt lys end sene successionsarter, hvilket tyder på, at de har en høj tolerance over for fotooxidativ skade. ${\tfrac {F_{v}}{F_{m}}}$
Neocleous og Vasilakakis (2009) [3] undersøgte hindbærs reaktion på bor og saltstress . Ved hjælp af et fluorometer målte de , og . Bladklorofylfluorescens var ikke signifikant afhængig af NaCl-koncentrationen, når borkoncentrationen var lav. Når borkoncentrationen blev øget, faldt klorofylfluorescensen af bladene under de samme saltholdighedsforhold. Det kan konkluderes, at den kombinerede virkning af bor og NaCl på hindbær forårsager en toksisk virkning, der påvirker fotokemiske parametre. $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{v))$

Nitrogenbalanceindeks

I betragtning af forholdet mellem klorofyl og kvælstofindhold i blade, kan klorofylindhold bruges til at påvise nitrogenmangel i planter. Der er flere forskellige metoder til dette.

Det viste sig, at det er muligt at bedømme planters nitrogenmetabolisme ud fra niveauet af polyfenoler . Når planten er i optimale forhold, fremmer den normalt stofskifte og syntesen af proteiner (hovedformen for biologisk nitrogen), klorofyler og en lille mængde flavonoider (sekundære metabolitter). På den anden side sker der ved nitrogenmangel en øget produktion af flavonoider [10] .

Nitrogenbalanceindekset giver dig mulighed for at vurdere kvælstofindholdet under naturlige forhold ved at beregne forholdet mellem klorofyl og flavonoider.

Måling af klorofylindhold

Gitelson (1999) postulerede: "Forholdet mellem klorofylfluorescens ved 735 nm og i bølgelængdeområdet fra 700 nm til 710 nm er lineært relateret til klorofylindholdet (med en bestemmelseskoefficient r2 større end 0,95) og kan derfor bruges som en nøjagtig indikator for klorofylindhold i planteblade. [elleve]

Fluorometre

Udviklingen af fluorometre har gjort måling af klorofylfluorescens til en almindelig metode i plantefysiologi. En revolution i analysen af klorofylfluorescens blev lavet ved opfindelsen af puls-amplitude-modulation (PAM) teknikken [ 12 ] [ 13] og fremkomsten af det første kommercielle puls fluorimeter eller PAM-fluorimeter PAM-101 (Walz, Tyskland ). Ved at modulere amplituden af målelysstrålen (mikrosekunds pulsområde) og parallelt detektere den exciterede fluorescens, er det muligt at bestemme det relative fluorescensudbytte (Ft) i nærvær af spredt lys. Grundlæggende betyder det, at klorofylfluorescens kan måles i marken selv under direkte sollys [2] .

Nogle flash-fluorometre kan bestemme både lysparametre og mørketilpasningsparametre (F o , F m , F o ', F m ', F v /F m , Y, F t , F oq ) og kan beregne fotokemiske quenching-koefficienter. og ikke -fotokemisk quenching (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) og NPQ). Nogle fluorometre er fuldstændig bærbare og betjenes med én hånd.

Udviklingen af et billeddannelsessystem har lettet bestemmelsen af rumlige inhomogeniteter i fotosyntetisk aktive prøver. Disse heterogeniteter forekommer i planters blade, for eksempel på grund af vækster, forskellige miljøbelastninger eller et smittestof. Kendskab til prøvens inhomogenitet er afgørende for den korrekte fortolkning af prøvens fotosyntetiske produktivitetsmålinger. Den høje billedkvalitet giver mulighed for at analysere en enkelt celle eller endda en enkelt kloroplast, såvel som områder, der dækker hele blade eller planter.

Alternative tilgange

LIF-sensorer

Metoder baseret på Kautsky-effekten udtømmer ikke hele rækken af metoder til måling af klorofylfluorescens. Især giver de seneste fremskridt inden for laser-induceret fluorescens (LIF) en mulighed for at udvikle tilstrækkeligt kompakte og effektive sensorer til fotofysiologisk statusbestemmelse og biomassevurdering. I stedet for at måle den totale fluorescensflux registrerer sådanne sensorer den optiske tæthed af denne flux exciteret af stærke nanosekunders laserimpulser. Denne metode kræver ikke 15-20 minutters mørketilpasning (som det er tilfældet med metoder baseret på Kautsky-effekten [14] ) og gør det muligt at excitere prøven fra en betydelig afstand. LIF-sensorer kan give hurtige og ret lange afstandsvurderinger.

Se også

Ikke-fotokemisk quenching

Noter

↑ Lu Congming, Zhang Jianhua. Effekter af vandstress på fotosystem II fotokemi og dens termostabilitet i hvedeplanter // Oxford Journals : tidsskrift. - 1999. - Juli. Arkiveret fra originalen den 16. juni 2016.
↑ 1 2 3 4 Klorofylfluorescens - en praktisk guide . jxb.oxfordjournals.org (1. april 2000). Dato for adgang: 28. marts 2011. Arkiveret fra originalen 23. april 2012.
↑ 1 2 Effekter af bor og saltholdighed på røde hindbær in vitro - International Journal of Fruit Science . Informaworld.com (3. december 2008). Hentet: 28. marts 2011.
↑ Kitajima M., Butler WL Slukning af klorofylfluorescens og primær fotokemi i kloroplaster med dibromothymoquinon // Biochim Biophys Acta : journal. - 1975. - Bd. 376 . - S. 105-115 . - doi : 10.1016/0005-2728(75)90209-1 .
↑ Schreiber U., Schliwa U., Bilger W. Kontinuerlig registrering af fotokemisk og ikke-fotokemisk klorofylfluorescensslukning med en ny type modulationsfluorometer // Photosynth Res : journal. — Bd. 10 . - S. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 .
↑ Genty B., Briantais JM, Baker NR Forholdet mellem kvanteudbyttet af fotosyntetisk elektrontransport og quenching af klorofylfluorescens // Biochem Biophys Acta : journal. - 1989. - Bd. 990 . - S. 87-92 . - doi : 10.1016/s0304-4165(89)80016-9 .
↑ Sobrado. Bladkarakteristika og daglig variation af klorofylfluorescens i blade af 'bana'-vegetationen i amazonregionen (engelsk) (PDF). (utilgængeligt link)
↑ Plantestressbiologi . _ personalpages.manchester.ac.uk. Hentet 6. januar 2017. Arkiveret fra originalen 27. juli 2017.
↑ Favaretto et al. Differentielle reaktioner af antioxidantenzymer i pionerer og sent på hinanden følgende tropiske træarter dyrket under sol- og skyggeforhold : journal . - 2011. Arkiveret den 19. september 2012.
↑ A. Cartelat, ZG Cerovic, Y. Goulas, S. Meyer, C. Lelarge, J.-L. Prioul, A. Barbottin, M.-H. Jeuffroy, P. Gate, G. Agati, I. Moya. Optisk vurderet indhold af bladpolyphenoler og klorofyl som indikatorer for nitrogenmangel i hvede (Triticum aestivum L. ) : journal. — Field Crops Research Volume 91, Issue 1, pages 35-49, 2005. Arkiveret fra originalen den 24. september 2015.
↑ Gitelson Anatoly A; Buschmann Claus; Lichtenthaler Hartmut K. The Chlorophyll Fluorescence Ratio F735/F700 as a Accurate Measure of the Chlorophyll Content in Plants // Remote Sensing of Environment : journal. - 1999. - Bd. 69 , nr. 3 . - S. 296-302 . - doi : 10.1016/S0034-4257(99)00023-1 .
↑ Schreiber U., Bilger W. og Schliwa U. Kontinuerlig registrering af fotokemisk og ikke-fotokemisk chloropyhll-fluorescensslukning med en ny type modulationsfluorometer // Lægemidler : journal. - Adis International , 1986. - Vol. 10 . - S. 51-62 . - doi : 10.1007/bf00024185 . Arkiveret fra originalen den 21. juli 2017.
↑ Schreiber Ulrich. Påvisning af hurtig induktionskinetik med en ny type højfrekvent moduleret chloropyhll fluorometer // Lægemidler : journal. - Adis International , 1986. - Vol. 9 . - S. 261-272 . - doi : 10.1007/bf00029749 . Arkiveret fra originalen den 3. juni 2018.
↑ Handy PEA : Continuous Excitation Plant Efficiency Analyzer . - Norfolk: Hansatech Instruments, 2012. - S. 2. Arkiveret 7. april 2016 på Wayback Machine Arkiveret kopi (link utilgængeligt) . Hentet 26. marts 2016. Arkiveret fra originalen 7. april 2016. (ubestemt)

Litteratur

Lazar. Klorofyl a-fluorescensinduktion // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics : journal. - 1999. - Bd. 1412 . - S. 1-28 . - doi : 10.1016/s0005-2728(99)00047-x .
Lazar. Den polyfasiske klorofyl a fluorescensstigning målt under høj intensitet af spændende lys // Functional Plant Biology : journal . - 2006. - Bd. 33 . - S. 9-30 . - doi : 10.1071/fp05095 .
Lazar. Parametre for fotosyntetisk energifordeling (engelsk) // Plant Physiology : journal. - American Society of Plant Biologists , 2015. - Vol. 175 . - S. 131-147 . - doi : 10.1016/j.jplph.2014.10.021 .
Kalaji et al. Eksperimentelle in vivo-målinger af lysemission i planter: et perspektiv dedikeret til David Walker // Drugs : journal. - Adis International , 2012. - Vol. 114 . - S. 69-96 . - doi : 10.1007/s11120-012-9780-3 .
Maxwell, K.; Johnson, GN Klorofylfluorescens--en praktisk vejledning (engelsk) // Journal of Experimental Botany : tidsskrift. - Oxford University Press , 2000. - Vol. 51 , nr. 345 . - s. 659-668 . doi : 10.1093 / jexbot/51.345.659 . — PMID 10938857 .
Murchie og Lawson. Klorofylfluorescensanalyse: en guide til god praksis og forståelse af nogle nye anvendelser // Journal of Experimental Botany : tidsskrift. - Oxford University Press , 2013. - Vol. 64 , nr. 13 . - S. 3983-3998 . - doi : 10.1093/jxb/ert208 .
Heinz Walz GmbH. Chloropyll fluorometer .