Enkeltcelle DNA-sekventering

Den aktuelle version af siden er endnu ikke blevet gennemgået af erfarne bidragydere og kan afvige væsentligt fra den version , der blev gennemgået den 12. oktober 2019; checks kræver 5 redigeringer .

Enkeltcellet DNA-sekventering er en  tilgang, der gør det muligt at opnå data om DNA -sekvensen af ​​en individuel celle ved hjælp af sekventering og derfor identificere forskelle mellem individuelle celler fra encellede organismer , organer, væv og cellesubpopulationer af flercellede organismer . Tilgangen gør det muligt at analysere cellens funktionelle egenskaber i sammenhæng med mikromiljøet. Enkeltcelle genomsekventering involverer flere trin: enkeltcelleisolering , helgenomamplifikation , biblioteksgenerering og DNA-sekventering ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker .

Med fremkomsten af ​​en række forskellige sekventeringsmetoder blev det muligt at etablere sekvensen af ​​genomisk DNA. Imidlertid er de fleste data til dato opnået ved at sekventere genomiske DNA-prøver isoleret fra populationer af mikroorganismer eller cellesubpopulationer af flercellede organismer [1] . Det er dog kendt, at diversitet inden for begge grupper kan være betydelig, da cellerne selv yder forskellige bidrag til eksistensen af ​​en population eller organisme.

Sekventering af genomet af en enkelt celle gør det muligt at overføre studiet af genomet til cellulært niveau. I dag hjælper det med at løse sådanne problemer som de novo sekventering af ikke-dyrkbare mikroorganismer [2] , undersøgelse af genetisk mosaicisme i normale og patologiske tilfælde [3] , identifikation og undersøgelse af tumorcellesubpopulationers bidrag til kræftudvikling og fremkomst af behandlingsresistens [4] .

Teknologiske udfordringer

Enkeltcelle DNA-sekventering står over for udfordringerne ved fysisk at isolere individuelle celler , vælge en amplifikationsmetode med det mindste potentiale for at indføre fejl for at opnå en tilstrækkelig mængde materiale og vælge en sekventeringsmetode [5] [6] .

Isolering af enkeltceller

Det første trin i celleisolering er at skabe en suspension af levedygtige celler, der ikke er forbundet med hinanden. Formålet med isolering kan enten være et tilfældigt udvalg af celler for at skabe en repræsentativ prøve, når sammensætningen af ​​subpopulationer analyseres, eller en målrettet søgning efter specifikke celler. I undersøgelsen af ​​hårdt væv er foreløbig mekanisk eller kemisk dissociation af prøven nødvendig, og dissociationsbetingelserne bør ligeligt virke på alle subpopulationer af vævsceller. Dette er nødvendigt for at skabe en prøve , der er upartisk i forhold til det oprindelige sæt af celler , hvor den oprindelige repræsentation af celler er bevaret, hvilket kan være vigtigt for at analysere sammensætningen af ​​subpopulationer. Det skal huskes, at betingelserne for dissociation af normalt og usundt væv kan variere, så på dette stadium er det vigtigt at vælge de passende forhold. Arbejde med hele vævsprøver er også muligt, for eksempel ved hjælp af laser capture mikrodissektion [7] .

Efter opnåelse af suspensionen kan celler isoleres ved seriel fortynding [8] , mikropipettering [9] , mikrobrøndfortynding [10] ved hjælp af en optisk pincet . Fluorescerende flowcytometri kan bruges til at isolere celler med specifikke fluorescerende egenskaber, som enten kan være naturlige eller indført af forsøgslederen. Automatiserede metoder til mikromanipulation [11] [12] har for nylig modtaget stor udvikling , herunder isolering af celler på chips ved hjælp af mikrofluidiske teknologier [13] ; at tage nanobiopsier gør det allerede muligt at studere individuelle organellers DNA [14] . De isolerede celler gennemgår efterfølgende lysering .

Helgenom-amplifikation

Det næste trin, helgenom  -amplifikation (WGA ), bruges til at generere nok DNA til at detektere signalet og ekstrahere det fra støjen i fremtiden under sekventering. Samtidig er det ønskeligt at minimere introduktionen af ​​sådanne artefakter som den foretrukne amplifikation af simple sekvenser, introduktionen af ​​tilfældige mutationer og dannelsen af ​​kimære sekvenser. For nylig er der dukket et sæt muligheder for at løse dette problem op. Brugen af ​​PCR har ikke retfærdiggjort sig selv på grund af f.eks. den øgede hyppighed af introduktion af fejl ved termostabile polymeraser . Derfor er isotermiske og hybride metoder, såsom metoden til amplifikation med multiple displacement amplification ( engelsk  Multiple displacement amplification, MDA ) og amplifikation med multiple rectification and looping ( English  Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles, MALBAC ) [15] .

MDA

MDA tillader hurtig DNA-amplifikation uden behov for PCR. Metoden er baseret på brugen af ​​fagpolymerase phi29 , som er karakteriseret ved øget processivitet (den kan syntetisere regioner over 10 kilobaser lange uden dissociation) og lav fejlrate (1 pr. 10 6-10 7 basepar ). Reaktionen forløber som følger: hexamere primere anneales på matrixen, forlænget af polymerase; når enzymet møder en anden primer (som også forlænges), fortrænger (erstatter) det den og fortsætter på sin vej gennem skabelonen. Det substituerede nyligt syntetiserede sted tjener som et landingssted for nye primere og bliver en skabelon. Der dannes således et forgrenet træ, hvor der sker syntese på hver gren. Ved afslutningen af ​​proceduren inhiberes polymerasen, nuklease S1 tilsættes for at spalte grene ved forgreningsstederne og DNA-polymerase I for at fuldende de resulterende enkeltstrengede sektioner [15] .

Fremgangsmåden har en række problemer, såsom alleltab , præferentiel amplifikation og interaktioner mellem primere. Det første problem opstår fra den tilfældige amplifikation af kun én af allelerne i heterozygoter , hvilket resulterer i, at heterozygoter forkert identificeres som homozygoter . På grund af den høje frekvens af denne effekt (0 - 60%) falder nøjagtigheden af ​​genotypebestemmelse . Det andet problem er overamplifikationen af ​​en allel frem for andre. Interaktioner mellem hexamer-primere forekommer på grund af sekvensernes tilfældige natur; de kan reduceres betydeligt ved at indføre restriktioner på syntesen af ​​disse primere [15] .

MALBACS

MALBAC er en hybrid lineær helgenomamplifikationsmetode. Metoden er baseret på specielle primere: de er 35 nukleotider lange , hvoraf 27 er ens i alle primere (GTG AGT GAT GGT TGA GGT AGT GTG GAG), og de resterende 8 nukleotider varierer. Hele amplifikationsprocessen er beskrevet som følger [9] :

  1. Smeltning (94 °C) af dobbeltstrenget DNA med dannelse af enkeltstrengede fragmenter.
  2. Afkøling (0 °C), tilsætning af primere og polymerase.
  3. Udglødningsprimere på tilfældige steder på skabelonen. Bst DNA-polymerase forlænger primere til dannelse af et halvt amplikon ved 64°C. Alle mod-primere fortrænges fra skabelonen.
  4. Smeltning (94 °C), adskillelse af semi-ampliconen fra matrixen.
  5. Afkøling (0 °C), tilsætning af primere og polymerase. Primerne binder effektivt til både skabelonen og semi-ampliconet.
  6. Bst DNA-polymerase forlænger primere ved 64°C. Semi-amplikoner syntetiseres på den indledende matrix, fulde amplikoner syntetiseres på semi-amplikoner opnået tidligere .
  7. Smeltning (94°C).
  8. Looping (58°C): 3' og 5' enderne af de fulde amplikoner er komplementære til hinanden og danner en løkke, der forhindrer brugen af ​​den fulde amplikon som skabelon.
  9. Gentag trin 5-8 fem gange.
  10. PCR ved hjælp af 27 almindelige nukleotider som primere til kun at amplificere komplette amplikoner [9] .

Fordelen ved metoden er reduktionen af ​​støjen forbundet med den eksponentielle karakter af PCR-amplifikation på grund af indførelsen af ​​foreløbig kvasi-lineær amplifikation. Dette gjorde det muligt at øge dækningen af ​​genomet (andelen af ​​genomet, der er dækket af mindst én læsning), for at reducere sandsynligheden for tab af alleler og enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP'er). Derudover kræves en meget lille mængde initial DNA for at komme ind, men enhver forurening af prøverne kan signifikant påvirke resultaterne af sekventering [9] .

Ulempen er, at for at slippe af med falsk-positive resultater, er det nødvendigt at sammenligne resultaterne af sekventering af 2-3 celler fra både samme og forskellige cellelinjer [9] . I dette tilfælde kan nogle polymorfismer gå tabt, da celler, der tilhører den samme cellelinje, stadig har nogle forskelle i genomet. Derudover har den anvendte bst DNA-polymerase en høj fejlrate (1 ud af 10 5 baser) [16] .

Sammenligning af helgenom-amplifikationsmetoder

For nylig har der været flere undersøgelser, der sammenligner disse metoder [17] [18] [19] . En undersøgelse konkluderede, at MDA giver større dækning end MALBAC (henholdsvis 84 % og 52 %), hvilket tillader mere nøjagtig påvisning af enkeltnukleotidpolymorfismer [17] . MALBAC giver dog mere ensartet dækning og tillader derfor mere nøjagtig detektion af kopiantal variationer (CNV'er) [17] . Interessant nok, når man sekventerede nogle celler, var niveauet for påvisning af kopiantal variationer ved MDA-metoden sammenligneligt med MALBAC [17] . Andre forfattere bekræfter også forskellen i dækning mellem MDA og MALBAC (84% og 72%) og den forholdsvis højere ensartethed af MALBAC-dækning ( variationskoefficient 0,10 versus 0,21 for MDA) [18] . MDA har vist sig at producere færre falske positive, men antallet af falske negativer varierer fra eksperiment til forsøg [18] . MALBAC giver en lavere alleltabsrate (21%), men dens dækning er mindre end MDA [18] . Generelt er det ikke klart, hvilken der fører til færre falske negativer, da MDA dækker mere af genomet, men mister flere alleler på grund af den foretrukne amplifikation af kun én af allelerne i heterozygoten [15] [18] .

MDA og MALBAC har således en række fordele og ulemper, og valget bør afhænge af opgaven.

Oprettelse af et bibliotek

Efter amplifikation kan biblioteker fremstilles under anvendelse af kommercielle kits. Flere muligheder er mulige her: valget af et specifikt locus , valget af et exom eller hele genomet til yderligere sekventering. Hver af disse muligheder antager visse værdier af dækning, fejltilbøjelighed og omkostninger [20] . Udvælgelsen af ​​små områder giver dig mulighed for at fokusere på områder, der yder det største biologiske bidrag til arbejdet i det undersøgte system. Dette reducerer omkostningerne til forskning og sandsynligheden for at indføre fejl i forberedelsen af ​​prøver. Brugen af ​​referencegenomet reducerer falsk-positive resultater, selvom det begrænser de påviste enkeltnukleotidpolymorfismer til dem, der er til stede i referencegenomet. Exome-sekventering gør det muligt at isolere de unikke egenskaber af celler, men med en stigning i længden af ​​den sekventerede region øges sandsynligheden for at indføre fejl under amplifikation. Brugen af ​​hele genomet gør det muligt at identificere ikke-kodende og strukturelle regioner, men omkostningerne til forskning stiger dramatisk, hvilket gør det vanskeligt at udføre hele genom-sekventering af mange celler [20] .

DNA fra biblioteker skabt på den ene eller anden måde bruges til sekventering ved en af ​​de eksisterende metoder .

Databehandling

Almindelige fejl

De fleste sekventeringsartefakter forekommer under prøveforberedelse: celleisolering, genomisk DNA-kontamination, amplifikation og biblioteksgenerering, da alle disse trin introducerer yderligere fejl, tab af dækning, reduktion i dækningshomogenitet, prøveudtagningsbias i præferenceudvælgelse af visse grupper af celler og amplifikation af visse DNA-sekvenser er årsagen til tabet af alleler i heterozygote positioner. Cellelinjer bør også tages i betragtning, hvorpå der udføres optimering af alle stadier af sekventering: ikke alle celler er diploide , der er både haploide og aneuploide populationer, og deres ploiditet kan påvirke eksperimentet væsentligt [4] . En hindring for at sammenligne forskellige resultater på dette område er nogle gange manglen på information om det samlede antal evaluerede celler og målingen af ​​sekventeringskvalitetsvurdering i specifikke undersøgelser [20] .

Enkeltnukleotidpolymorfismer

Enkeltnukleotidpolymorfier bringer ifølge 1000 genom-projektet den største mangfoldighed til det menneskelige genom [21] : 38 millioner enkeltnukleotidpolymorfier, 1,4 millioner insertioner / deletioner og mere end 14 tusinde store deletioner [21] blev bekræftet på haplotypekortet . Det antages også, at mange komplekse sygdomme, såsom Alzheimers sygdom [22] , forskellige former for cancer [23] , autoimmune sygdomme [24] netop kan associeres med tilstedeværelsen af ​​polymorfismer.

I dag er søgningen efter polymorfier i enkeltcelle-sekventeringsdata baseret på de samme algoritmer som analysen af ​​konventionelle sekventeringsresultater: GATK [25] , SNPdetector [26] , SOAPsnp [27] , VarScan [28] . Der er dog forskelle mellem cellepopulationssekventering og enkeltcellesekventering: sidstnævnte har mindre genomdækning og en højere falsk positiv rate.

Variation i kopiantal af DNA-segmenter

Variationer i kopiantallet af DNA-fragmenter fører til et unormalt antal kopier af disse fragmenter; mangfoldigheden af ​​denne type genetisk polymorfi påvirker også menneskers sundhed [29] [30] . Nogle undersøgelser understreger deres sammenhæng med udviklingen af ​​tumorer [31] , autoimmune sygdomme [24] , autisme [32] osv. Her, som i søgningen efter enkeltnukleotidpolymorfier, anvendes stort set de samme algoritmer som til konventionel sekventering: CNV -seq [33] , PenCNV [34] , CNAseg [35] , ReadDepth [36] og cn.MOPS [37] . For at tage højde for den indførte støj er det nødvendigt at analysere effekten af ​​amplifikationsmetoder på forekomsten og forsvinden af ​​variationer i DNA-kopiantal [38] .

Sammenlignende analyse af celler

En strategi for celleklyngning baseret på genomiske data er indførelsen af ​​en afstandsfunktion, der kvantificerer forskelle mellem par af prøver [39] . I dette tilfælde anses Jaccard -målet for at være det mest passende på grund af de genetiske datas binære karakter (se nedenfor) [40] . Et alternativ til distancefunktionsbaserede metoder er modelbaseret clustering , som antager en sandsynlighedstilgang: i stedet for "hårde" afstande introduceres "bløde" sandsynligheder for oprindelse af celler fra forskellige kloner.

Efter at have præsenteret dataene for enkeltcellesekventering som en matrix , hvor mutationer af interesse er markeret lodret, og celler er markeret vandret, udfylder vi det med 0 og 1 afhængigt af tilstedeværelsen af ​​en bestemt mutation i en bestemt celle. Hvis en tumor undersøges, er den over tid karakteriseret ved udvidelsen af ​​nogle kloner og forsvinden af ​​andre [41] . Samtidig ved vi ikke, hvor mange af hvilke kloner der er til stede, og vi antager, at en del af dataene gik tabt under prøveforberedelsen.

Modelparametre, såsom sandsynligheden for, at en celle kommer ned fra en bestemt klon, såvel som den falske negative rate, kan estimeres ved hjælp af en forventningsmaksimeringsalgoritme [42] . Derefter reduceres problemet med at bestemme antallet af kloner til valget af en statistisk model, der bedst beskriver sekventeringsdataene; evalueringen udføres ved hjælp af Bayes og Akaikes informationskriterier [43] . Der er også en hybrid tilgang, der tillader indledende klyngedannelse ved hjælp af en afstandsfunktion, som øger hastigheden af ​​modelbaseret klyngedannelse, som kræver stor computerkraft [44] . Baseret på resultaterne af klyngedannelse opbygges en profil af konsensus klonale mutationer [45] . Ifølge den, ved hjælp af forskellige metoder til at konstruere træer , er det muligt at identificere forholdet mellem forskellige kloner. For eksempel er det muligt at påvise en tumors evolutionære historie [45] .

Præstationer

Klonal udvikling af brystkræftceller

Analyse af mutationsmønstre (insertioner, deletioner, enkelte nukleotidsubstitutioner, genkopiantal variationer ) af forskellige populationer af brystkræftceller gjorde det muligt at identificere både et sæt mutationer, der er karakteristiske for hver af populationerne (klonale mutationer) og dem, der forekom i flere celler (subklonale mutationer). Dataene blev opnået ved hjælp af enkeltcelle exome-sekventering, verificeret ved dyb sekventering. Undersøgelsen brugte celler af aneuploide populationer af ERBC (ER + /PR + /Her2 - ) og TNBC (ER - /PR - /Her2 - ), som adskiller sig i tilstedeværelsen af ​​visse receptorer (ER/PR/Her2) på membranen overflade, såvel som normale diploide celler. Resultatet var identifikation af signifikant flere klonale mutationer i TNBC-populationen sammenlignet med ERBC og normale celler. I TNBC-cellepopulationen er eksistensen af ​​tre subpopulationer af cancerceller, identificeret ved mønstre af subklonale mutationer, blevet vist. Der er opnået beviser for, at TNBC har en højere mutationshastighed, og deres akkumulering kan ikke kun forekomme på grund af fejl under accelereret spredning [4] .

Det er endnu ikke klart, hvordan tumorer præcist bliver resistente over for kemoterapi . Enten er der allerede sjældne resistente celler i befolkningen, eller også opstår responsen spontant efter stoffernes virkning. Derudover er det ikke altid klart, hvorfor mutationer akkumuleres: enten er det en accelereret mutationshastighed, som i tilfældet med TNBC, eller også er det akkumulering af mutationer med en normal hastighed, men i stort antal på grund af accelereret proliferation [4] .

Perspektiver

I øjeblikket er hovedproblemet tilstedeværelsen af ​​et genomisk DNA-amplifikationstrin, der er ansvarligt for at introducere det største antal artefakter. Kravene til mængden af ​​DNA i forberedelsen af ​​biblioteker er i stigende grad faldende, og den direkte oprettelse af biblioteker fra isoleret DNA er allerede blevet demonstreret [46] [47] . Desuden blev det vist, at det er muligt at undvære biblioteker helt ved at indsende DNA isoleret fra en celle til sekventering [48] . Der er også mulighed for at afsløre epigenetisk information, såsom at søge efter methyleringsmønstre [49] [50] og fange kromosomernes konformationelle tilstand [51] . I dag opererer forskere typisk på ti til hundredvis af celler, men udviklingen af ​​automatiserede platforme til celleindfangning, DNA-amplifikation og biblioteksforberedelse vil markant øge omfanget og tilgængeligheden af ​​enkeltcelleanalyse, hvilket gør det muligt at udføre større eksperimenter på kortere tid. [52] .

Brugen af ​​enkeltcellet DNA-sekventering vil sammen med epigenomiske og transkriptomundersøgelser gøre det muligt at klassificere celler nøjagtigt og komplementere det eksisterende syn på cellepopulationer. Det bliver også muligt at etablere relationer mellem genomsekvensen, epigenetisk status og genekspression og at bestemme cellernes funktionalitet [52] .

Se også

Noter

  1. ↑ Tringe SG , von Mering C. , Kobayashi A. , Salamov AA , Chen K. , Chang HW , Podar M. , Short JM , Mathur EJ , Detter JC , Bork P. , Hugenholtz P. , Rubin EM Comparative metagenomics of microbial fællesskaber.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 2005. - Bd. 308, nr. 5721 . - S. 554-557. - doi : 10.1126/science.1107851 . — PMID 15845853 .
  2. ↑ Marcy Y. , Ouverney C. , Bik EM , Lösekann T. , Ivanova N. , Martin HG , Szeto E. , Platt D. , Hugenholtz P. , Relman DA , Quake SR Dissekere biologisk "mørk stof" med enkeltcelle genetisk analyse af sjældne og udyrkede TM7-mikrober fra den menneskelige mund.  (engelsk)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - Bd. 104, nr. 29 . - P. 11889-11894. - doi : 10.1073/pnas.0704662104 . — PMID 17620602 .
  3. ↑ McConnell MJ , Lindberg MR , Brennand KJ , Piper JC , Voet T. , Cowing-Zitron C. , Shumilina S. , Lasken RS , Vermeesch JR , Hall IM , Gage FH Mosaikkopinummervariation i menneskelige neuroner.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 2013. - Bd. 342, nr. 6158 . - s. 632-637. - doi : 10.1126/science.1243472 . — PMID 24179226 .
  4. ↑ 1 2 3 4 Wang Y. , Waters J. , Leung ML , Unruh A. , Roh W. , Shi X. , Chen K. , Scheet P. , Vattathil S. , Liang H. , Multani A. , Zhang H. . , Zhao R. , Michor F. , Meric-Bernstam F. , Navin NE Klonal evolution i brystkræft afsløret ved enkeltkernegenomsekventering.  (engelsk)  // Nature. - 2014. - Bd. 512, nr. 7513 . - S. 155-160. - doi : 10.1038/nature13600 . — PMID 25079324 .
  5. ↑ Wen L. , Tang F. Enkeltcelle-sekventering i stamcellebiologi.  (engelsk)  // Genombiologi. - 2016. - Bd. 17, nr. 1 . - S. 71. - doi : 10.1186/s13059-016-0941-0 . — PMID 27083874 .
  6. ↑ Bacher R. , Kendziorski C. Design og beregningsmæssig analyse af enkeltcellede RNA-sekventeringseksperimenter.  (engelsk)  // Genombiologi. - 2016. - Bd. 17, nr. 1 . - S. 63. - doi : 10.1186/s13059-016-0927-y . — PMID 27052890 .
  7. ↑ Emmert-Buck MR , Bonner RF , Smith PD , Chuaqui RF , Zhuang Z. , Goldstein SR , Weiss RA , Liotta LA Laser capture microdissection.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 1996. - Bd. 274, nr. 5289 . - S. 998-1001. — PMID 8875945 .
  8. ↑ HAM RG KLONAL VÆKST AF PATTEdyrCELLER I ET KEMISK DEFINERET, SYNTETISK MEDIUM.  (engelsk)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1965. - Bd. 53. - S. 288-293. — PMID 14294058 .
  9. ↑ 1 2 3 4 5 Zong C. , Lu S. , Chapman AR , Xie XS Genom-dækkende påvisning af enkeltnukleotid- og kopinummervariationer af en enkelt human celle.  (engelsk)  // Science (New York, NY). - 2012. - Bd. 338, nr. 6114 . - S. 1622-1626. - doi : 10.1126/science.1229164 . — PMID 23258894 .
  10. ↑ Gole J. , Gore A. , Richards A. , Chiu YJ , Fung HL , Bushman D. , Chiang HI , Chun J. , Lo YH , Zhang K. Massivt parallel polymerasekloning og genomsekventering af enkeltceller ved hjælp af nanolitermikrobrønde.  (engelsk)  // Nature biotechnology. - 2013. - Bd. 31, nr. 12 . - S. 1126-1132. - doi : 10.1038/nbt.2720 . — PMID 24213699 .
  11. ↑ White AK , VanInsberghe M. , Petriv OI , Hamidi M. , Sikorski D. , Marra MA , Piret J. , Aparicio S. , Hansen CL High-throughput microfluidic single-cell RT-qPCR.  (engelsk)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Bd. 108, nr. 34 . - P. 13999-14004. - doi : 10.1073/pnas.1019446108 . — PMID 21808033 .
  12. ↑ Macosko EZ , Basu A. , Satija R. , Nemesh J. , Shekhar K. , Goldman M. , Tirosh I. , Bialas AR , Kamitaki N. , Martersteck EM , Trombetta JJ , Weitz DA , Sanes JR , Shalek AK , Regev A. , McCarroll SA Meget parallel genomomspændende ekspressionsprofilering af individuelle celler ved hjælp af nanoliter-dråber.  (engelsk)  // Cell. - 2015. - Bd. 161, nr. 5 . - S. 1202-1214. - doi : 10.1016/j.cell.2015.05.002 . — PMID 26000488 .
  13. ↑ Thompson AM , Paguirigan AL , Kreutz JE , Radich JP , Chiu DT Microfluidics for single-cell genetisk analyse.  (engelsk)  // Lab on a chip. - 2014. - Bd. 14, nr. 17 . - s. 3135-3142. - doi : 10.1039/c4lc00175c . — PMID 24789374 .
  14. ↑ Actis P. , Maalouf MM , Kim HJ , Lohith A. , Vilozny B. , Seger RA , Pourmand N. Compartmental genomics i levende celler afsløret ved enkeltcellet nanobiopsi.  (engelsk)  // ACS nano. - 2014. - Bd. 8, nr. 1 . - S. 546-553. doi : 10.1021 / nn405097u . — PMID 24279711 .
  15. ↑ 1 2 3 4 Paez JG , Lin M. , Beroukhim R. , Lee JC , Zhao X. , Richter DJ , Gabriel S. , Herman P. , Sasaki H. , Altshuler D. , Li C. , Meyerson M. , Sellers WR -genomdækning og sekvenstroskab af phi29 polymerase-baseret multiple streng forskydning helgenomamplifikation.  (engelsk)  // Nukleinsyreforskning. - 2004. - Bd. 32, nr. 9 . — P. e71. - doi : 10.1093/nar/gnh069 . — PMID 15150323 .
  16. ↑ Ausubel, FM et al. Vol. I., John Wiley & Songs, Inc. AKTUELLE PROTOKOLLER I MOLEKYLÆR BIOLOGI. - 1995.
  17. ↑ 1 2 3 4 Hou Y. , Wu K. , Shi X. , Li F. , Song L. , Wu H. , Dean M. , Li G. , Tsang S. , Jiang R. , Zhang X. , Li B. , Liu G. , Bedekar N. , Lu N. , Xie G. , Liang H. , Chang L. , Wang T. , Chen J. , Li Y. , Zhang X. , Yang H. , Xu X. , Wang L. , Wang J. Sammenligning af variationsdetektion mellem hel-genom-amplifikationsmetoder, der anvendes i enkeltcelle-resekventering.  (engelsk)  // GigaScience. - 2015. - Bd. 4. - S. 37. - doi : 10.1186/s13742-015-0068-3 . — PMID 26251698 .
  18. ↑ 1 2 3 4 5 Huang L. , Ma F. , Chapman A. , Lu S. , Xie XS Encellet helgenomforstærkning og sekventering: Metodologi og applikationer.  (engelsk)  // Årlig gennemgang af genomik og human genetik. - 2015. - Bd. 16. - S. 79-102. - doi : 10.1146/annurev-genom-090413-025352 . — PMID 26077818 .
  19. ↑ Chen M. , Song P. , Zou D. , Hu X. , Zhao S. , Gao S. , Ling F. Sammenligning af multiple displacement amplification (MDA) og multiple annealing og looping-based amplification cycles (MALBAC) in single -cellesekvensering.  (engelsk)  // Public Library of Science ONE. - 2014. - Bd. 9, nr. 12 . - P. e114520. - doi : 10.1371/journal.pone.0114520 . — PMID 25485707 .
  20. ↑ 1 2 3 Gawad C. , Koh W. , Quake SR Enkeltcellet genomsekventering: videnskabens nuværende tilstand.  (engelsk)  // Naturanmeldelser. genetik. - 2016. - Bd. 17, nr. 3 . - S. 175-188. - doi : 10.1038/nrg.2015.16 . — PMID 26806412 .
  21. ↑ 1 2 Abecasis GR , Auton A. , Brooks LD , DePristo MA , Durbin RM , Handsaker RE , Kang HM , Marth GT , McVean GA Et integreret kort over genetisk variation fra 1.092 menneskelige genomer.  (engelsk)  // Nature. - 2012. - Bd. 491, nr. 7422 . - S. 56-65. - doi : 10.1038/nature11632 . — PMID 23128226 .
  22. ↑ Martin ER , Lai EH , Gilbert JR , Rogala AR , Afshari AJ , Riley J. , Finch KL , Stevens JF , Livak KJ , Slotterbeck BD , Slifer SH , Warren LL , Conneally PM , Schmechel DE,, Pericavis I - k . Vance MA , Roses AD , Vance JM SNP Afhjælpning af komplekse sygdomme: analyse af enkeltnukleotidpolymorfismer omkring APOE i Alzheimers sygdom.  (engelsk)  // American journal of human genetics. - 2000. - Vol. 67, nr. 2 . - S. 383-394. - doi : 10.1086/303003 . — PMID 10869235 .
  23. ↑ Zhu Y. , Spitz MR , Lei L. , Mills GB , Wu X. En enkelt nukleotidpolymorfi i matrixmetalloproteinase-1-promotoren øger modtageligheden for lungekræft.  (engelsk)  // Kræftforskning. - 2001. - Bd. 61, nr. 21 . - P. 7825-7829. — PMID 11691799 .
  24. ↑ 1 2 Schaschl H. , Aitman TJ , Vyse TJ Kopinummervariation i det menneskelige genom og dets implikation i autoimmunitet.  (engelsk)  // Klinisk og eksperimentel immunologi. - 2009. - Bd. 156, nr. 1 . - S. 12-16. - doi : 10.1111/j.1365-2249.2008.03865.x . — PMID 19220326 .
  25. ↑ McKenna A. , Hanna M. , Banks E. , Sivachenko A. , Cibulskis K. , Kernytsky A. , Garimella K. , Altshuler D. , Gabriel S. , Daly M. , DePristo MA The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce ramme for analyse af næste generations DNA-sekventeringsdata.  (engelsk)  // Genomforskning. - 2010. - Bd. 20, nr. 9 . - S. 1297-1303. - doi : 10.1101/gr.107524.110 . — PMID 20644199 .
  26. ↑ Zhang J. , Wheeler DA , Yakub I. , Wei S. , Sood R. , Rowe W. , Liu PP , Gibbs RA , Buetow KH SNP- detektor: et softwareværktøj til følsom og nøjagtig SNP-detektion.  (engelsk)  // Public Library of Science for Computational Biology. - 2005. - Bd. 1, nr. 5 . - P. e53. - doi : 10.1371/journal.pcbi.0010053 . — PMID 16261194 .
  27. ↑ Li R. , Li Y. , Fang X. , Yang H. , Wang J. , Kristiansen K. , Wang J. SNP-detektion for massivt parallel hel-genom-resekventering.  (engelsk)  // Genomforskning. - 2009. - Bd. 19, nr. 6 . - S. 1124-1132. - doi : 10.1101/gr.088013.108 . — PMID 19420381 .
  28. ↑ Koboldt DC , Chen K. , Wylie T. , Larson DE , McLellan MD , Mardis ER , Weinstock GM , Wilson RK , Ding L. VarScan: variantdetektion i massivt parallel sekventering af individuelle og poolede prøver.  (engelsk)  // Bioinformatik. - 2009. - Bd. 25, nr. 17 . - s. 2283-2285. - doi : 10.1093/bioinformatics/btp373 . — PMID 19542151 .
  29. ↑ Redon R. , Ishikawa S. , Fitch KR , Feuk L. , Perry GH , Andrews TD , Fiegler H. , Shapero MH , Carson AR , Chen W. , Cho EK , Dallaire S. , Freeman JL , González JR , Gratacòs M. , Huang J. , Kalaitzopoulos D. , Komura D. , MacDonald JR , Marshall CR , Mei R. , Montgomery L. , Nishimura K. , Okamura K. , Shen F. , Somerville MJ , Tchinda J. , Valsesia A. . , Woodwark C. , Yang F. , Zhang J. , Zerjal T. , Zhang J. , Armengol L. , Conrad DF , Estivill X. , Tyler-Smith C. , Carter NP , Aburatani H. , Lee C. , Jones KW , Scherer SW , Hurles ME Global variation i kopiantal i det menneskelige genom.  (engelsk)  // Nature. - 2006. - Bd. 444, nr. 7118 . - S. 444-454. - doi : 10.1038/nature05329 . — PMID 17122850 .
  30. ↑ Zhang F. , Gu W. , Hurles ME , Lupski JR Kopinummervariation i menneskers sundhed, sygdom og evolution.  (engelsk)  // Årlig gennemgang af genomik og human genetik. - 2009. - Bd. 10. - S. 451-481. - doi : 10.1146/annurev.genom.9.081307.164217 . — PMID 19715442 .
  31. ↑ Frank B. , Bermejo JL , Hemminki K. , Sutter C. , Wappenschmidt B. , Meindl A. , Kiechle-Bahat M. , Bugert P. , Schmutzler RK , Bartram CR , Burwinkel B. Kopinummervariant i kandidattumoren suppressorgenet MTUS1 og risiko for familiebrystkræft.  (engelsk)  // Carcinogenese. - 2007. - Bd. 28, nr. 7 . - S. 1442-1445. - doi : 10.1093/carcin/bgm033 . — PMID 17301065 .
  32. ↑ Glessner JT , Wang K. , Cai G. , Korvatska O. , Kim CE , Wood S. , Zhang H. , Estes A. , Brune CW , Bradfield JP , Imielinski M. , Frackelton EC , Reichert J. , Crawford EL , Munson J. , Sleiman PM , Chiavacci R. , Annaiah K. , Thomas K. , Hou C. , Glaberson W. , Flory J. , Otieno F. , Garris M. , Soorya L. , Klei L. , Piven J. . , Meyer KJ , Anagnostou E. , Sakurai T. , Game RM , Rudd DS , Zurawiecki D. , McDougle CJ , Davis LK , Miller J. , Posey DJ , Michaels S. , Kolevzon A. , Silverman JM , Bernier R. , Levy SE , Schultz RT , Dawson G. , Owley T. , McMahon WM , Wassink TH , Sweeney JA , Nurnberger JI , Coon H. , Sutcliffe JS , Minshew NJ , Grant SF , Bucan M. , Cook EH , B , Devlin B. , Schellenberg GD , Hakonarson H. Autisme-genom-dækkende kopiantal variation afslører ubiquitin og neuronale gener.  (engelsk)  // Nature. - 2009. - Bd. 459, nr. 7246 . - S. 569-573. - doi : 10.1038/nature07953 . — PMID 19404257 .
  33. ↑ Xie C. , Tammi MT CNV-seq, en ny metode til at detektere kopiantal variation ved hjælp af high-throughput sekventering.  (engelsk)  // BMC bioinformatik. - 2009. - Bd. 10. - S. 80. - doi : 10.1186/1471-2105-10-80 . — PMID 19267900 .
  34. ↑ Wang K. , Li M. , Hadley D. , Liu R. , Glessner J. , Grant SF , Hakonarson H. , Bucan M. PennCNV: en integreret skjult Markov-model designet til registrering af kopinummervariationer i høj opløsning i hel- genom SNP genotypedata.  (engelsk)  // Genomforskning. - 2007. - Bd. 17, nr. 11 . - S. 1665-1674. - doi : 10.1101/gr.6861907 . — PMID 17921354 .
  35. ↑ Ivakhno S. , Royce T. , Cox AJ , Evers DJ , Cheetham RK , Tavaré S. CNAseg - en ny ramme til identifikation af kopinummerændringer i cancer fra andengenerations sekventeringsdata.  (engelsk)  // Bioinformatik. - 2010. - Bd. 26, nr. 24 . - s. 3051-3058. - doi : 10.1093/bioinformatics/btq587 . — PMID 20966003 .
  36. ↑ Miller CA , Hampton O. , Coarfa C. , Milosavljevic A. ReadDepth: en parallel R-pakke til at detektere kopinummerændringer fra korte sekvenslæsninger.  (engelsk)  // Public Library of Science ONE. - 2011. - Bd. 6, nr. 1 . - P. e16327. - doi : 10.1371/journal.pone.0016327 . — PMID 21305028 .
  37. ↑ Klambauer G. , Schwarzbauer K. , Mayr A. , Clevert DA , Mitterecker A. , Bodenhofer U. , Hochreiter S. cn.MOPS: blanding af Poissons til at opdage kopiantal variationer i næste generations sekventeringsdata med en lav falsk opdagelse sats.  (engelsk)  // Nukleinsyreforskning. - 2012. - Bd. 40, nr. 9 . — P. e69. - doi : 10.1093/nar/gks003 . — PMID 22302147 .
  38. ↑ Ning L. , Liu G. , Li G. , Hou Y. , Tong Y. , He J. Aktuelle udfordringer i bioinformatik af enkeltcelle-genomik.  (engelsk)  // Frontiers in oncology. - 2014. - Bd. 4. - S. 7. - doi : 10.3389/fonc.2014.00007 . — PMID 24478987 .
  39. ↑ Eisen MB , Spellman PT , Brown PO , Botstein D. Klyngeanalyse og visning af genomomfattende ekspressionsmønstre.  (engelsk)  // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1998. - Bd. 95, nr. 25 . - P. 14863-14868. — PMID 9843981 .
  40. ↑ Prokopenko D. , Hecker J. , Silverman EK , Pagano M. , Nöthen MM , Dina C. , Lange C. , Fier HL . Udnyttelse af Jaccard-indekset til at afsløre befolkningsstratificering i sekventeringsdata: en simuleringsundersøgelse og en applikation til 1000 Genom projekt.  (engelsk)  // Bioinformatik. - 2016. - Bd. 32, nr. 9 . - S. 1366-1372. - doi : 10.1093/bioinformatics/btv752 . — PMID 26722118 .
  41. ↑ Greaves M. , Maley C. C. Clonal evolution in cancer.  (engelsk)  // Nature. - 2012. - Bd. 481, nr. 7381 . - S. 306-313. - doi : 10.1038/nature10762 . — PMID 22258609 .
  42. ↑ A.P. Dempster; NM Laird; D.B. Rubin. Maksimal sandsynlighed fra ufuldstændige data via EM-algoritmen  // Journal of the Royal Statistical Society. Serie B (metodologisk). - 1977. - Bd. 39, nr. 1 . - S. 1-38. - doi : 10.2307/2984875 . Arkiveret fra originalen den 11. december 2015.
  43. ↑ C. Fraley, A. E. Raftery. Hvor mange klynger? Hvilken klyngemetode?  Svar via modelbaseret klyngeanalyse . - 1998. - doi : 10.1093/comjnl/41.8.578 . Arkiveret fra originalen den 22. februar 2017.
  44. ↑ Chris Fraley, Adrian E. Raftery. MCLUST: Software til modelbaseret klyngeanalyse  (engelsk)  // Journal of Classification. - 1999. - doi : 10.1007/s003579900058 . Arkiveret fra originalen den 22. juli 2017.
  45. ↑ 1 2 Kim KI , Simon R. Brug af enkeltcellesekvenseringsdata til at modellere en tumors evolutionære historie.  (engelsk)  // BMC bioinformatik. - 2014. - Bd. 15. - S. 27. - doi : 10.1186/1471-2105-15-27 . — PMID 24460695 .
  46. ↑ Falconer E. , Hills M. , Naumann U. , Poon SS , Chavez EA , Sanders AD , Zhao Y. , Hirst M. , Lansdorp PM DNA-skabelonstrengsekventering af enkeltceller kortlægger genomiske omarrangementer ved høj opløsning.  (engelsk)  // Nature methods. - 2012. - Bd. 9, nr. 11 . - S. 1107-1112. - doi : 10.1038/nmeth.2206 . — PMID 23042453 .
  47. ↑ Falconer E. , Lansdorp PM Strand-seq: et samlende værktøj til studier af kromosomadskillelse.  (engelsk)  // Seminarer i celle- og udviklingsbiologi. - 2013. - Bd. 24, nr. 8-9 . - S. 643-652. - doi : 10.1016/j.semcdb.2013.04.005 . — PMID 23665005 .
  48. ↑ Coupland P. , Chandra T. , Quail M. , Reik W. , Swerdlow H. Direkte sekventering af små genomer på Pacific Biosciences RS uden biblioteksforberedelse.  (engelsk)  // BioTechniques. - 2012. - Bd. 53, nr. 6 . - S. 365-372. - doi : 10.2144/000113962 . — PMID 23227987 .
  49. ↑ El Hajj N. , Trapphoff T. , Linke M. , May A. , Hansmann T. , Kuhtz J. , Reifenberg K. , Heinzmann J. , Niemann H. , Daser A. , Eichenlaub-Ritter U. , Zechner U. . , Haaf T. Begrænsende fortyndingsbisulfit (pyro)-sekventering afslører forældrespecifikke methyleringsmønstre i enkelte tidlige museembryoner og bovine oocytter.  (engelsk)  // Epigenetik. - 2011. - Bd. 6, nr. 10 . - S. 1176-1188. - doi : 10.4161/epi.6.10.17202 . — PMID 21937882 .
  50. ↑ Guo H. , Zhu P. , Wu X. , Li X. , Wen L. , Tang F. Enkeltcellede methylomlandskaber af embryonale museembryonale stamceller og tidlige embryoner analyseret ved hjælp af reduceret repræsentation af bisulfit-sekventering.  (engelsk)  // Genomforskning. - 2013. - Bd. 23, nr. 12 . - S. 2126-2135. - doi : 10.1101/gr.161679.113 . — PMID 24179143 .
  51. ↑ Nagano T. , Lubling Y. , Yaffe E. , Wingett SW , Dean W. , Tanay A. , Fraser P. Enkeltcellet Hi-C til genom-dækkende påvisning af kromatin-interaktioner, der forekommer samtidigt i en enkelt celle.  (engelsk)  // Naturprotokoller. - 2015. - Bd. 10, nr. 12 . - S. 1986-2003. - doi : 10.1038/nprot.2015.127 . — PMID 26540590 .
  52. ↑ 1 2 Macaulay IC , Voet T. Enkeltcelle-genomik: fremskridt og fremtidsperspektiver.  (engelsk)  // PLoS genetik. - 2014. - Bd. 10, nr. 1 . — P. e1004126. - doi : 10.1371/journal.pgen.1004126 . — PMID 24497842 .