DNA -kloning (genkloning) er processen med at isolere en given DNA-sekvens og opnå mange kopier af den in vitro . DNA-kloning bruges ofte til at amplificere fragmenter, der indeholder gener såvel som andre sekvenser, såsom promotorer , ikke-kodende sekvenser , kemisk syntetiserede oligonukleotider og tilfældige sektioner af DNA.
I klassiske restriktions- og ligeringsteknikker omfatter kloningen af et DNA-fragment fire trin: skæring af DNA'et med restriktionsendonukleaser , ligering af DNA'et med en vektor , transfektion og efterfølgende screening (selektion).
I første omgang er det nødvendigt at isolere et stykke DNA til kloning. Ofte opnås et DNA-præparat til kloning ved hjælp af en polymerasekædereaktion , såvel som at skære DNA med restriktionsenzymer , sonikere DNA og fraktionere ved hjælp af agarose -DNA-elektroforese . Isolering af indsatsen kan udføres ved hjælp af haglgeværkloningsteknologi, komplementært DNA , kunstig kemisk syntese.
Efter ligering med plasmidet transformeres bakterierne til at vokse. Bakterierne dyrkes derefter på et selektivt medium for at udvælge kolonier, der indeholder indsatsen. Individuelle kolonier udvælges og undersøges for tilstedeværelsen af insertion.
Efter ligering anbringes reaktionsblandingen med vektoren indsat i den nødvendige orientering i cellerne. Afhængigt af celletypen anvendes kemisk cellesensibilisering, elektroporation eller genkanoner . Kemisk sensibilisering kræver ikke specielt udstyr. Elektroporation anvendes, når høj transfektionseffektivitet er påkrævet. Genkanoner bruges i tilfælde af planteceller og væv, da plantecellevæggen ikke tillader fremmed DNA at trænge ind i cytoplasma og kerne.
Få kulturen af transficerede celler. Da de ovenfor beskrevne procedurer ofte har lav effektivitet, kræves der metoder til at identificere celler, der indeholder det ønskede insert i den korrekte orientering, og til at adskille sådanne celler fra dem, der ikke indeholder insertet. Moderne kloningsvektorer indeholder selekterbare markører (normalt antibiotikaresistensgener), der tillader kun celler med det korrekte insert at vokse på det selektive medium (med antibiotikummet). Kloningsvektorer indeholder også ofte kolonifarvemarkører, for eksempel når de dyrkes på medium indeholdende X-gal . Nøjagtig bekræftelse af vellykket kloning kræver verifikation ved polymerasekædereaktion (PCR), restriktionsfragmentlængdepolymorfi (RFLP) eller DNA-sekventering .
Genterapi involverer indførelse af et fungerende gen i celler, der ikke har det, hvilket fører til en kur mod sygdommen, der er forbundet med fravær eller funktionsfejl af genet. Genterapi er klassificeret i to kategorier. I det første tilfælde er mutationer indeholdt i stam- eller kønsceller , så har hele organismen og alle efterkommere en defekt. I det andet tilfælde forekommer mutationen i somatiske celler , transplantation af modificerede celler eller væv er mulig. Kliniske forsøg med somatisk cellegenterapi begyndte i slutningen af 1990'erne for at behandle kræft i blod, lever og lunger.