Sekvensering

Sekventering af biopolymerer ( proteiner og nukleinsyrer  - DNA og RNA ) - bestemmelse af deres aminosyre- eller nukleotidsekvens (fra latin  sequentum  - sekvens). Som et resultat af sekventering opnås en formel beskrivelse af den primære struktur af et lineært makromolekyle i form af en sekvens af monomerer i tekstform. Størrelsen af ​​de DNA-segmenter, der skal sekventeres, overstiger normalt ikke 100 basepar (næste generations sekventering) og 1000 basepar for Sanger-sekventering. Som et resultat af sekventering af overlappende DNA-sektioner opnås sekvenser af gensektioner, hele gener, totalt mRNA eller komplette genomer af organismer [1] [2] .

Til sekventering bruges metoderne fra Edman , Sanger og andre; i øjeblikket bruges Sanger-metoden med dideoxynukleosidtrifosfater ( ddNTP ) almindeligvis til gensekventering. Sædvanligvis, før sekventering, amplificeres DNA-sektionen, der skal sekventeres, ved anvendelse af PCR . Helgenomsekventering udføres normalt ved hjælp af næste generations sekventeringsteknologier .

Sanger-sekventering

Dideoxynukleotidmetoden eller "kædetermineringsmetoden" blev udviklet af F. Sanger i 1977 og er i øjeblikket meget brugt til at bestemme nukleotidsekvensen af ​​DNA. Sanger-sekventering hybridiserer et syntetisk oligonukleotid 17-20 nt langt med et specifikt sted i en af ​​kæderne af det sekventerede sted. Dette oligonukleotid er en primer , der tilvejebringer en 3'-hydroxylgruppe til at initiere syntesen af ​​en kæde, der er komplementær til templaten.

Primeropløsningen er opdelt i fire rør, der hver indeholder fire deoxynukleotider, dATP, dCTP, dGTP og dTTP (hvoraf det ene er radioaktivt mærket) og et af fire 2',3'-dideoxynukleotider (ddATP, ddTTP, ddGTP eller ddCTP) . Dideoxynukleotidet er inkluderet i alle positioner i blandingen af ​​voksende kæder, og efter dets vedhæftning stopper kædevæksten øjeblikkeligt.

Som et resultat dannes der i hvert af de fire reagensglas, med deltagelse af DNA-polymerase , et unikt sæt oligonukleotider af forskellig længde, inklusive primersekvensen. Yderligere tilsættes formamid til reagensglassene for at adskille kæderne, og elektroforese udføres i en polyacrylamidgel i fire baner. Udfør autoradiografi , som giver dig mulighed for at "læse" nukleotidsekvensen af ​​det sekventerede DNA-segment.

I en mere moderne version er dideoxynukleotider mærket med fire forskellige fluorescerende farvestoffer og PCR udføres i et rør. Derefter, under polyacrylamidgelelektroforese, exciterer en laserstråle på et bestemt punkt i gelen fluorescensen af ​​farvestoffer, og detektoren bestemmer, hvilket nukleotid der i øjeblikket migrerer gennem gelen. Moderne instrumenter bruger kapillær elektroforese til DNA-sekventering . [3]

Højeffektiv sekvensering

Se også

• Edman metode
• Bisulfit-sekventering
• Pyrosequencing
• Næste generations sekventeringsmetoder
• Enkeltcelle DNA-sekventering

Noter

1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Molecular biology of the cell: in three volumes. - 2. - Moskva: Mir, 1994. - T. 1. - 517 s. — 10.000 eksemplarer.  — ISBN 5030019855 .
2. ↑ Knorre D. G., Myzina S. D. Biologisk kemi. - 3. - Moskva: Higher School, 2000. - 479 s. - 7000 eksemplarer.  — ISBN 5060037207 .
3. ↑ Glik B., Pasternak J. Molecular biotechnology. Principper og anvendelse. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Litteratur

• Glick B., Pasternak J. Molekylær bioteknologi. Principper og anvendelse. - Moskva: Mir, 2002. - 589 s. — ISBN 5030033289 .

Links

• Livskodeks: at læse er ikke at forstå
• UniProt.Protein sekvens og funktionel information.
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/
• https://www.longdom.org/open-access/generations-of-sequencing-technologies-from-first-to-next-generation-0974-8369-1000395.pdf
• https://www.creative-biogene.com/blog/index.php/2016/11/01/brief-introduction-on-three-generations-of-genome-sequencing-technology/
• https://www.nature.com/articles/nbt1486 (2008)

Ordbøger og encyklopædier	Stor russer