DNA-fodaftryk

DNA -fodaftryk er en  metode til at søge i DNA -strukturen efter bindingssekvenser af DNA-bindende proteiner . Denne metode bruges til at studere interaktionen af ​​proteiner med DNA både in vitro (med DNA-proteinkomplekser isoleret fra celler) og in vivo (under fysiologiske forhold , inde i cellen).

For eksempel binder transkriptionsfaktorer sig til promotorer , forstærkere eller lyddæmpere og regulerer ekspressionen af ​​individuelle gener i genomet . DNA-footprinting-metoden gør det muligt at etablere de DNA-sekvenser, som disse regulatoriske proteiner binder til. Metoden er også velegnet til en hurtig søgning ( screening ) efter specifikke proteiner, der binder til en specifik DNA-sekvens.

Metoden har fået sit navn fra det engelske ord "footprint", der betegner et footprint eller footprint. [1] .

Historie

I 1978 udviklede David Galas og Albert Schmitz en DNA-fodaftryksteknik til at studere bindingsspecificiteten af ​​et repressorprotein til lactoseoperonen . Footprinting-metoden var baseret på Maxam-Gilbert-sekventeringsmetoden. [2]

Metode

Den enkleste anvendelse af denne metode er at bestemme, om et protein binder til en bestemt region af DNA. [3]

1. Ved hjælp af polymerasekædereaktionen (PCR) amplificeres og mærkes den ønskede DNA-sekvens, som er det sandsynlige proteinbindingssted. Den ideelle amplikonstørrelse i dette tilfælde er mellem 50 og 200 baser .
2. Proteinet af interesse tilsættes, mens en del af DNA'et efterlades intakt til senere sammenligning.
3. Et skæremiddel tilsættes - kemisk eller enzymatisk natur. Skæremidlet indfører tilfældigt brud i DNA'et. Reaktionsbetingelserne er valgt således, at hver DNA-streng kun skæres ét sted. Et protein, der specifikt binder til en DNA-nukleotidsekvens, beskytter bindingsstedet mod at blive skåret.
4. DNA-nedbrydningsprodukter adskilles ved polyacrylamidgelelektroforese . DNA-fragmenter, der ikke har været bundet til et protein, vil blive skåret tilfældige steder og vil blive fordelt i gelen i form af en "stige". De DNA-fragmenter, som proteinet binder sig til, vil være beskyttet mod skæring og vil danne et aftryk, et spor ( engelsk  footprint ) på sådan en "stige". Samtidig med footprinting kan DNA-sekventering udføres ved Maxam-Gilbert-metoden , og sekvensen af ​​nukleotider, som det tilsvarende protein binder til, vil blive etableret.

Mærkning

Analyserede DNA-molekyler for at bestemme placeringen af ​​proteinbindingsstedet kan mærkes separat fra 3'- og fra 5'-enden. Tags bruges:

• Radioaktive mærker bruges traditionelt til at mærke DNA-fragmenter til fodaftryk, denne metode til mærkning blev udviklet på metoderne til DNA-sekventering ifølge Maxam-Gilbert . Denne variant er meget følsom; små mængder DNA kan visualiseres med et radioaktivt mærke.
• Fluorescerende etiketter er en erstatning for farlig radioaktiv. Imidlertid er fluorescerende mærkning mindre følsom for DNA-billeddannelse, og lave koncentrationer af fodaftryksprodukter kan ikke påvises. Sekvenseringsgeler og kapillærelektroforeseteknikker bruges til at visualisere produkter mærket med fluoroforer . [3]

Skæremiddel

Som skæremiddel til nedbrydning af det undersøgte DNA anvendes type I DNase [3] [4] , Fentons reagens [5] , ultraviolet bestråling [6] .

Noter

1. ↑ Cellens molekylære biologi. M.: Mir, 1994.
2. ↑ Galas D og Schmitz A. (1978) DNAse footprinting: en simpel metode til påvisning af protein-DNA-bindingsspecificitet. Nukleinsyreforskning. 5(9):3157-70.
3. ↑ 1 2 3 Hampshire A, Rusling D, Broughton-Head V og Fox K. (2007) Footprinting: En metode til at bestemme sekvensselektiviteten, affiniteten og kinetikken af ​​DNA-bindende ligander. metoder. 42:128-140.
4. ↑ LeBlanc B og Moss T. (2001) DNase I Footprinting. Metoder i molekylærbiologi. 148:31-8.
5. ↑ Zaychikov E, Schickor P, Denissova L, og Heumann H. (2001) Hydroxyl radical footprinting. Metoder i molekylærbiologi. 148:49-61.
6. ↑ Geiselmann J og Boccard F. (2001) Ultraviolet-laser footprinting. Metoder i molekylærbiologi. 148:161-73.