Sanger - metoden er en DNA- sekventeringsmetode , også kendt som kædetermineringsmetoden. Denne sekventeringsmetode blev først foreslået af Frederick Sanger i 1977 [1] , for hvilken han blev tildelt Nobelprisen i kemi i 1980. Denne metode har været den mest almindelige i 40 år.
I den klassiske version af Sanger-metoden fungerer en af strengene i det analyserede DNA som skabelon for syntesen af en komplementær streng med DNA-polymerase -enzymet . Reaktionen med den samme matrix udføres i fire forskellige rør, der hver indeholder:
Dideoxyribonukleotider (ddATP, ddGTP, ddCTP eller ddTTP) mangler en 3'-hydroxylgruppe, så yderligere syntese afbrydes efter deres inklusion i kæden. Der dannes således i hvert rør et sæt DNA-fragmenter af forskellig længde, som ender i det samme nukleotid (ifølge det tilsatte dideoxynukleotid). Efter afslutning af reaktionen adskilles indholdet af rørene ved polyacrylamidgelelektroforese under denaturerende betingelser, og gelerne autoradiograferes . Produkterne af fire reaktioner danner en "sekventeringsstige", som giver dig mulighed for at "læse" nukleotidsekvensen af et DNA-fragment [2] [1] .
Sanger-metoden giver dig også mulighed for at bestemme nukleotidsekvensen af RNA , men den skal først "omskrives" i form af DNA ved hjælp af revers transkription .
Til dato er DNA-sekventering ifølge Sanger fuldt automatiseret og udføres på specielle enheder, sequencere. Anvendelsen af dideoxynukleotider med fluorescerende mærker med forskellige emissionsbølgelængder gør det muligt at udføre reaktionen i et reagensglas. Reaktionsblandingen adskilles ved kapillarelektroforese i opløsning, DNA-fragmenter, der kommer ud fra kapillærsøjlen, registreres af en fluorescensdetektor . Resultaterne analyseres ved hjælp af computer og præsenteres som en sekvens af farvede toppe svarende til fire nukleotider. Sekvenserer af denne type kan "læse" på et tidspunkt sekvenser på 500-1000 nukleotider lange. Til sammenligning tillader pyrosequencing- metoden , udviklet i 1996, et trin til at bestemme sekvensen af et meget mindre antal nukleotider. Automatisering har i høj grad fremskyndet sekventeringsprocessen og muliggjort sekventering af hele genomer , inklusive det menneskelige genom [2] .