Virale vektorer er værktøjer, der almindeligvis bruges af molekylærbiologer til at levere genetisk materiale ind i celler . Denne proces kan udføres inde i en levende organisme ( in vivo ) eller i cellekultur ( in vitro ). Vira har specialiserede molekylære mekanismer til effektivt at transportere deres genomer inden for de celler, de inficerer. Leveringen af gener eller andet genetisk materiale af en vektor kaldes transduktion , og inficerede celler beskrives som værende transduceret. Molekylærbiologer brugte først denne mekanisme i 1970'erne. Paul Berg brugte en modificeret SV40 indeholdende bakteriofag λ DNA til at inficere dyrkede abe nyreceller [1] .
Ud over deres anvendelse i molekylærbiologisk forskning, bruges virale vektorer til genterapi og vaccineudvikling .
Virale vektorer er skræddersyet til deres specifikke anvendelse, men deler typisk nogle få nøgleegenskaber.
Virale vektorer blev oprindeligt udviklet som et alternativ til naturlig DNA- transfektion til molekylærgenetiske eksperimenter . Sammenlignet med traditionelle metoder såsom calciumphosphatudfældning , kan transduktion sikre, at næsten 100 % af cellerne er inficeret uden alvorligt at påvirke cellernes levedygtighed. Derudover integreres nogle vira i cellegenomet , hvilket fremmer stabil ekspression.
Proteiner kodet af gener kan udtrykkes ved hjælp af virale vektorer, normalt for at studere funktionen af et bestemt protein. Virale vektorer, især retrovira, der stabilt udtrykker markørgener såsom GFP , bruges i vid udstrækning til permanent at mærke celler for at spore dem og deres afkom, såsom i xenotransplantationsforsøg , hvor celler inficeret in vitro implanteres i et værtsdyr.
Genindsættelse er billigere end gen-knockout . Men dette giver mindre pålidelige resultater, fordi det nogle gange er uspecifikt og har off-target-effekter på andre gener. Værtsdyrsvektorer spiller også en vigtig rolle.
Genterapi er en metode til at korrigere defekte gener, der er ansvarlige for udviklingen af en sygdom. I fremtiden kan genterapi være en måde at behandle genetiske lidelser på, såsom alvorlig kombineret immundefekt , cystisk fibrose eller endda hæmofili A. Fordi disse sygdomme skyldes mutationer i DNA-sekvensen for visse gener, har genterapiforsøg brugt vira til at levere vildtype kopier af disse gener ind i celler i patientens krop. Der har været en enorm mængde laboratoriesucces med genterapi. Imidlertid skal adskillige problemer med viral genterapi overvindes, før den anvendes i vid udstrækning. Immunresponset på vira forhindrer ikke kun levering af gener til målceller, men kan forårsage alvorlige komplikationer for patienten. I et af de tidlige genterapiforsøg i 1999 resulterede dette i Jesse Gelsinger 's død , som blev behandlet med en adenoviral vektor. [2]
Nogle virale vektorer, såsom gamma retrovira, indsætter deres genomer på et tilsyneladende tilfældigt sted på en af værtens kromosomer , hvilket kan forstyrre cellulær genfunktion og føre til cancer. I 2002, i et alvorligt kombineret immundefekt retroviral genterapi- studie, udviklede fire patienter leukæmi som følge af behandlingen; [3] tre patienter kom sig efter kemoterapi. [4] Vektorer baseret på adeno-associerede vira er meget sikrere i denne henseende, da de altid integreres på samme sted i det menneskelige genom, og bruges i forskellige lidelser såsom Alzheimers sygdom [5] .
Vira, der udtrykker patogene proteiner, udvikles i øjeblikket som vacciner mod disse patogener baseret på samme rationale som DNA-vacciner . T-lymfocytter genkender celler inficeret med intracellulære parasitter baseret på fremmede proteiner produceret i cellen. T -celleimmunitet er afgørende for beskyttelse mod virusinfektioner og sygdomme som malaria . Den virale vaccine inducerer ekspressionen af patogene proteiner i værtsceller på en måde svarende til Sabins poliovaccine og andre svækkede vacciner. Men da virusvacciner kun indeholder en lille del af patogenets gener, er de meget sikrere, og sporadisk infektion med patogenet er ikke mulig.
I det 21. århundrede bliver vacciner baseret på adenovirusvektorer aktivt udviklet [6] .
Retrovira er et af grundlaget for moderne genterapitilgange. Rekombinante retrovira, såsom Moloneys murine leukæmivirus, er i stand til stabilt at integrere i værtsgenomet. De indeholder omvendt transkriptase for at skabe en DNA-kopi af RNA-genomet og integrase, som tillader integration i værtsgenomet . De er blevet brugt i en række FDA-godkendte kliniske forsøg, såsom SCID-X1-studiet [7] .
Retrovirale vektorer kan enten være replikationskompetente eller replikationsdefekte. Replikationsdeficiente vektorer er det mest almindelige valg i forskning, fordi vira har de kodende regioner for gener, der er nødvendige for ekstra replikationsrunder, og virionpakning erstattet af andre gener eller slettet. Disse vira er i stand til at inficere målceller og levere den virale nyttelast, men kan derefter ikke fortsætte den typiske lytiske vej, der fører til cellelyse og død.
Omvendt indeholder replikationskompetente virale vektorer alle de nødvendige gener til virionsyntese og fortsætter med at proliferere, så snart infektion opstår. Da det virale genom for disse vektorer er meget længere, er længden af det faktiske indsatte gen af interesse begrænset sammenlignet med den mulige længde af insertet for replikationsdefekte vektorer. Afhængig af den virale vektor er den typiske maksimale længde af et gyldigt DNA-insert i en replikationsdefekt viral vektor typisk omkring 8-10 kB. [8] Selvom dette begrænser introduktionen af mange genomiske sekvenser, kan de fleste cDNA-sekvenser stadig rummes.
Den største ulempe ved at bruge retrovira såsom Moloney retrovirus er behovet for aktiv celledeling til transduktion . Som et resultat er celler såsom neuroner meget modstandsdygtige over for infektion og transduktion af retrovira.
Der er bekymring for , at insertionsmutagenese på grund af integration i værtsgenomet kan føre til cancer eller leukæmi . Dette problem forblev teoretisk, indtil genterapi for ti patienter med SCID-X1 ved hjælp af Maloney-mus leukæmivirus [9] resulterede i to tilfælde af leukæmi forårsaget af aktivering af LMO2- onkogenet på grund af tæt integration af vektoren. [ti]
Lentivira er en underklasse af retrovira. De bruges nogle gange som genterapivektorer på grund af deres evne til at integrere sig i genomet af ikke-delende celler, hvilket er unikt for lentivira, fordi andre retrovira kun kan inficere delende celler. Det virale genom, i form af RNA , gennemgår omvendt transkription , når virussen kommer ind i cellen for at producere DNA , som derefter indsættes i genomet på en tilfældig position (nylige fund tyder faktisk på, at indsættelsen af viralt DNA ikke er tilfældig, men er rettet mod specifikke aktive gener og forbundet med genomorganisation [ 11] ) af et viralt integraseenzym . Vektoren, nu kaldet en provirus , forbliver i genomet og sendes videre til cellens afkom, når den deler sig. Integrationssiden er uforudsigelig, hvilket kan skabe et problem. Proviruset kan forstyrre funktionen af cellulære gener og føre til aktivering af kræftfremmende onkogener , hvilket giver anledning til bekymring over den mulige brug af lentivirus i genterapi. Undersøgelser har imidlertid vist, at lentivirale vektorer har mindre tendens til at integreres på steder, der kan forårsage cancer end gamma-retrovirale vektorer. [12] Mere specifikt viste en undersøgelse, at lentivirale vektorer hverken forårsagede en stigning i forekomsten af tumorer eller en tidligere opstået tumor hos mus med en signifikant højere forekomst af tumorer. [13] Derudover blev der ikke observeret nogen stigning i mutagene eller onkologiske hændelser i kliniske undersøgelser med lentivirale vektorer til at levere genterapi til behandling af HIV.
Af sikkerhedsmæssige årsager bærer lentivirale vektorer aldrig de gener, der er nødvendige for deres replikation. For at opnå lentivirus transficeres flere plasmider ind i en såkaldt pakningscellelinje, sædvanligvis HEK 293 . Et eller flere plasmider, almindeligvis omtalt som pakningsplasmider, koder for virionproteiner , såsom capside og revers transkriptase . Det andet plasmid indeholder det genetiske materiale, som vil blive leveret af vektoren. Det transskriberes for at producere det virale enkeltstrengede RNA-genom og er markeret ved tilstedeværelsen af ψ (psi)-sekvensen. Denne sekvens bruges til at pakke genomet ind i et virion.
I modsætning til lentivirus integreres adenoviralt DNA ikke i genomet og replikeres ikke under celledeling. Dette begrænser deres anvendelse i grundforskning, selvom adenovirale vektorer stadig bruges i in vitro- eksperimenter såvel som in vivo . [14] Deres hovedanvendelse er i genterapi og vaccination [15] [16] . Sådan bruges human adenovirus til Sputnik V-vaccinen. Da mennesker almindeligvis kommer i kontakt med adenovira , der forårsager luftvejs-, mave-tarm- og øjeninfektioner, har de fleste patienter allerede udviklet neutraliserende antistoffer, som kan inaktivere virussen, før den når målcellen. For at overvinde dette problem er forskere i gang med at undersøge adenovira , der inficerer forskellige arter, som mennesker ikke har nogen immunitet over for.
Adeno-associeret virus (AAV) er en lille virus, der inficerer mennesker og nogle andre primatarter. Det er i øjeblikket kendt, at AAV ikke forårsager sygdom og fremkalder et meget svagt immunrespons. AAV kan inficere både delende og ikke-delende celler og kan inkorporere dets genom i værtscellens genom. Desuden forbliver AAV for det meste episomal (replikation uden inklusion i kromosomet); opfylder et langt og stabilt udtryk. [17] Disse egenskaber gør AAV til en meget attraktiv kandidat til udvikling af virale vektorer til genterapi. [1] AAV kan dog kun indbringe op til 5 KB, hvilket er væsentligt mindre end AAVs oprindelige kapacitet. [17]
På grund af dets potentielle brug som genterapivektor har forskere desuden skabt en ændret AAV kaldet selvsupplerende adeno-associeret virus (scAAV). Mens AAV pakker en DNA-streng og kræver en anden strengsynteseproces, pakker scAAV begge strenge, som anneales sammen for at danne dobbeltstrenget DNA. Ved at springe anden strengsyntese over muliggør scAAV hurtig ekspression i cellen. [18] Ellers deler scAAV mange af egenskaberne fra sin AAV-modpart.
Hybridvektorer er vektorvira , der er gensplejset til at have egenskaberne af mere end én vektor. Vira er modificeret for at undgå manglerne ved typiske virale vektorer, som kan have begrænset belastningskapacitet, immunogenicitet, genotoksicitet og muligvis ikke understøtter langsigtet tilstrækkelig transgenekspression . Ved at erstatte uønskede elementer med ønskværdige evner kan hybridvektorer i fremtiden udkonkurrere standard transfektionsvektorer med hensyn til sikkerhed og terapeutisk effektivitet. [19]
Valget af en viral vektor til at levere genetisk materiale ind i celler er forbundet med nogle logistiske problemer. Der er et begrænset antal virale vektorer tilgængelige til terapeutisk brug. Enhver af disse få virale vektorer kan fremkalde et immunrespons fra værten, hvis vektoren betragtes som en fremmed angriber. [20] [21] Når den er brugt, kan den virale vektor ikke bruges effektivt igen i en patient, fordi den vil blive genkendt af kroppen. Hvis en vaccine eller genterapi mislykkes i kliniske forsøg , kan virussen ikke bruges igen hos en patient til en anden vaccine eller genterapi i fremtiden. Forud-eksisterende immunitet mod den virale vektor kan også være til stede i patienten, hvilket gør terapien ineffektiv for denne patient. [20] [22] Det er muligt at modvirke allerede eksisterende immunitet ved brug af en viral vektor til vaccination ved at prime med en ikke -viral DNA-vaccine , men denne metode udgør et andet problem og en hindring i vaccinedistributionsprocessen. [23] Eksisterende immunitet kan også udfordres ved at øge dosis af vaccinen eller ændre vaccinationsvejen . [24] Nogle ulemper ved virale vektorer (såsom genotoksicitet og lav transgenekspression) kan overvindes ved hjælp af hybridvektorer.