Helicase-afhængig amplifikation ( engelsk Helicase-dependent amplificatio, HDA ), også Helicase-afhængig isoterm amplifikation , er en in vitro DNA- amplifikationsmetode (svarende til polymerasekædereaktion ), som udføres ved en konstant temperatur.
Polymerasekædereaktionen er den mest udbredte in vitro DNA-amplifikationsteknik med henblik på molekylærbiologi og biomedicinsk forskning [1] . Denne proces involverer adskillelse af dobbeltstrenget DNA ved høj temperatur til enkeltstrenget ( denatureringstrin , normalt opnået ved 95-97 °C), annealing af primere til enkeltstrenget DNA (annealingstrin) og kopiering af det enkeltstrengede DNA for at skabe nyt dobbeltstrenget DNA (forlængelsetrin, som kræver DNA-polymerase), som kræver, at reaktionen udføres i en termisk cykler . Disse bordmaskiner er store, dyre og kræver høje drifts- og vedligeholdelsesomkostninger, hvilket begrænser den potentielle anvendelse af DNA-amplifikation i situationer uden for laboratoriet (f.eks. identifikation af potentielt farlige mikroorganismer på stedet for en undersøgelse eller patientbehandling). Selvom PCR almindeligvis er forbundet med termisk cykling, er den originale Mullis et al. beskrevet er anvendelsen af helicase som et middel til denaturering af dobbeltstrenget DNA, hvilket indbefatter isotermisk amplifikation af nukleinsyrer . Under naturlige forhold replikeres DNA af DNA-polymeraser med forskellige hjælpeproteiner, herunder DNA-helikaser, som virker til at adskille DNA ved at afvikle DNA-dobbelthelixen [2] . HDA blev udviklet ud fra dette koncept ved at bruge helicase (et enzym) til at denaturere DNA.
Strenge af dobbeltstrenget DNA adskilles først af DNA-helicase og belægges med enkeltstrenget DNA (ssDNA)-bindende proteiner. I det andet trin hybridiseres to sekvensspecifikke primere til hver kant af DNA-skabelonen. DNA-polymeraserne bruges derefter til at forlænge primerne, der er annealet på skabelonerne, for at producere dobbeltstrenget DNA, og de to nysyntetiserede DNA-produkter bruges derefter som substrater af DNA-helikaserne for at gå ind i den næste runde af reaktionen. Der udvikles således en samtidig kædereaktion, der fører til eksponentiel amplifikation af den valgte målsekvens (se Vincent et al. , 2004 [3] for et skema ).
Siden offentliggørelsen af sin opdagelse er HDA-teknologi blevet brugt til "en enkel, meget tilpasningsdygtig nukleinsyretest til at påvise Clostridium difficile" [4] . Andre anvendelser omfatter hurtig påvisning af Staphylococcus aureus ved amplifikation og påvisning af en kort DNA-sekvens, der er specifik for denne bakterie. Fordelen ved HDA er, at det giver en hurtig metode til at amplificere en specifik målnukleinsyre ved isotermisk temperatur uden at kræve brug af en termisk cycler. Forskeren kræver dog forudgående optimering af primere og nogle gange buffere. Typisk verificeres og opnås optimering af primere og buffere ved PCR, hvilket rejser spørgsmålet om behovet for ekstra omkostninger til et separat system til selve amplifikationen. Selvom HDA ikke kræver brug af en termisk cycler og derfor tillader feltforskning, udføres det meste af det arbejde, der kræves for at identificere potentielt skadelige mikroorganismer, i forsknings-/hospitalslaboratorier. På nuværende tidspunkt kan massediagnostik på et stort antal prøver endnu ikke opnås med HDA, mens PCR-reaktioner udført i en termisk cycler, der rummer flerbrøndsprøveplader, tillader amplifikation og påvisning af mål-DNA-målet fra maksimalt 96 prøver. HDA-reagenser er også relativt dyrere end PCR-reagenser, især da de kommer som et sæt.