Metoden til lokal fiksering af potentialet , patch-clamp ( eng. patch - fragment, clamp here - fixation) - en elektrofysiologisk teknik til at studere egenskaberne af ionkanaler , bestående i det faktum, at et fragment af cellemembranenisoleret med en speciel mikropipette. Denne teknik giver forsøgslederen mulighed for at kontrollere potentialforskellen mellem siderne af membranen, samt placere den i et miljø med en bestemt kemisk sammensætning. Under disse velkontrollerede forhold måles ionstrømmene, der passerer gennem membranen, hvilket i sidste ende fører til konklusioner om, hvordan ionkanaler reagerer på elektrisk og kemisk stimulering. Metoden er så følsom, at den giver mulighed for at observere adfærd og kemiske transformationer af enkelte molekyler, der interagerer med membranen. [1] Der er udviklet eksperimentelle protokoller til at måle ionkanalernes egenskaber på en optimal måde. De tyske opdagelsesrejsende Erwin Neher og Bert Sakmansom udviklede denne teknik modtog Nobelprisen i 1991.
Levende celler er dækket af en membran , hvis strukturelle basis er et dobbelt lag af lipider , let gennemtrængeligt for vand og praktisk talt uigennemtrængeligt for ioner. Hver celle skal udveksle forskellige stoffer og især ioner med det ydre miljø. Transporten af ioner over membranen spiller en vigtig rolle i processerne af celleexcitation og signaltransmission. Ioner kommer ind i cellen og forlader den gennem proteinstrukturer indbygget i membranen - kanaler og transportører [2]
Transportører er membranproteiner , der binder til et transporteret stof på den ene side af membranen, fører dette stof hen over membranen og derefter frigiver det. En sådan overførsel bliver mulig, fordi transportøren som følge af forbindelse med et stof ændrer konformation (det vil sige form, orientering). Den vigtigste transportør i eukaryote celler er natrium-kalium-pumpen . For at denne pumpe skal fungere, kræves der energi, som den trækker fra den ATP , der er lagret i cellen . I løbet af en cyklus af dens drift fjerner pumpen 3 Na + -ioner fra cellen og indfører 2 K + -ioner i den . Et molekyle af denne transportør laver omkring 10³ cyklusser i sekundet. En lignende frekvens af cyklusser er typisk for andre typer transportører [3] .
Kanaler er proteiner , der fungerer som membranporer, da de danner åbninger, som ioner kan passere igennem. Membrankanaler er selektive - kun permeable for visse stoffer. Selektivitet skyldes poreradius og fordelingen af ladede funktionelle grupper i dem. Der er kanaler, der selektivt passerer natriumioner (natriumkanaler), såvel som kalium-, calcium- og chloridkanaler. For hver type ion er der ikke én, men ganske få typer kanaler [4] . 10 6 - 10 7 ioner passerer gennem en kanal pr. sekund [3] .
På trods af fundamentale forskelle i transportmekanismen gennem kanaler og transportører, kan de dannes af meget homologe proteiner. Så for nylig modtagne data om, at mutationen af en enkelt aminosyre i proteinet af den divalente metaltransportør DMT1 fører til dens transformation til en calciumkanal . Derudover er der mindst én transportør (en erytrocytchlorid-bicarbonat-udveksler), der udfører 10 5 overførsler pr . kanalerne og mekanismetransportørerne.
Da ioner er elektrisk ladede molekyler, når de passerer gennem membrankanalerne, overføres ladningen også, hvilket betyder, at der løber en elektrisk strøm gennem membranen. Denne strøm kan måles. Jo større potentialeforskellen er mellem siderne af membranen, jo større er strømmen. Konduktivitet (forholdet mellem strøm og potentialforskel) af en enkelt kanal i åben tilstand varierer afhængigt af typen af kanal, fra 4–5 (i CFTR [5] og ENaC [6] ) til 30–50 (f.eks. en nikotinfølsom cholinerg receptor [7] ) picosiemens . Det betyder, at der med en potentialforskel på 100 mV vil strømme en strøm på flere picoampere gennem kanalen.
Elektriske fænomener på cellemembraner kan måles ved hjælp af skarpe glasmikroelektroder , der indsættes i cellen. Teknikken med én intracellulær elektrode gør det muligt at måle potentialforskellen ved en fast strøm. Mindre almindeligt kan denne teknik måle strømmen ved et fast potentiale ved hjælp af switching clamp-teknikken. Alle målinger foregår udelukkende på hele cellen, hvorved man studerer hele cellemembranens elektriske egenskaber.
Det faktum, at fikseringen af det transmembrane potentiale vil gøre det muligt at måle membranens ledningsevne fra ændringer i strøm ved en konstant spænding, blev først erkendt i 1940'erne. århundrede, og snart begyndte de engelske forskere Alan Hodgkin og Andrew Huxley ( Alan Hodgkin og Andrew Huxley ) eksperimenter med to-elektrode potentialklemme (2-elektrode spændingsklemme). [8] Essensen af metoden er som følger. To elektroder indsættes i cellen, en mere - referenceelektroden - forbliver uden for cellen. Den første intracellulære elektrode tjener til at måle den transmembrane potentialforskel (det vil sige potentialforskellen mellem den og referenceelektroden), den anden kan levere strøm. Det er ikke muligt at bruge den samme skarpe elektrode til strømforsyning og potentialforskelmåling. Faktum er, at en sådan elektrode har en indgangs elektrisk modstand i størrelsesordenen 100-200 MΩ, hvilket er sammenligneligt med modstanden af cellemembranen, derfor, hvis strømmen løber gennem "elektrode-celle" systemet, så spændingsfaldet på elektroden vil stå i forhold til spændingsfaldet på selve membranen, og der er ingen måde at adskille disse to dele [8] . Yderligere indstiller en speciel enhed - en signalgenerator - kommandopotentialet , som skal være lig med transmembranpotentialet. Det målte transmembranpotentiale føres til indgangen på sammenligningsanordningen , som trækker det målte potentiale fra kommandoen en og, afhængigt af størrelsen af forskellen, tilfører strøm til strømelektroden på en sådan måde, at den kompenserer for denne forskel. Strømmonitoren måler til gengæld konstant mængden af strøm, der kræves til dette. I 1940'erne og 50'erne, da Hodgkin og Huxley arbejdede, var der ingen mikroelektroder, så tynde ledninger blev brugt som intracellulære elektroder. Dette afgjorde valget af objektet - en gigantisk blæksprutteaxon på 1 mm i diameter, hvori disse ledninger blev indsat. På dette objekt udførte forskere ved hjælp af metoden med to-elektrodepotentialefiksering eksperimenter, hvor den ioniske natur af aktionspotentialet blev fastslået, og eksistensen af ionkanaler først blev postuleret (Nobelprisen i 1963 , delt med J. Eccles , som modtaget det til forskning inden for synaptisk transmission). To-elektrode potentialklemning bruges stadig i dag ved hjælp af skarpe glasmikroelektroder, men selv med dem har denne teknik betydelige begrænsninger: to elektroder kan kun indsættes i en meget stor celle (for eksempel en frøoocyt).
I slutningen af halvfjerdserne af det XX århundrede. Erwin Neher (E.Neher) og Bert Sakman (B.Sakmann) fandt ud af, at kegleformede glaspipetter med en spidsdiameter på 1-2 mikron kan danne kontakter med cellemembranen (membran-glas-grænsen) med en modstand på flere gigaohm - dette er en såkaldt gigaohm-kontakt . Det giver dig mulighed for at isolere fra det ydre miljø og fra resten af membranen det fragment, der er inde i pipetten. Fragmentet af membranen afgrænset af pipetten kaldes patch - "fragment", ordet klemme (fiksering) i metodens navn kan tolkes både som indfangning og isolering af dette fragment, og som fiksering af transmembranpotentialet i en isoleret fragment eller, som det vil blive beskrevet senere, potentiale eller strøm på hele cellen. [9] En sølv-klor elektrode placeres i en pipette fyldt med en elektrolytopløsning, den anden elektrode placeres ekstracellulært i vaskevæsken. Det elektriske kredsløb adskiller sig fra det tidligere beskrevne for to-elektrode fiksering ved, at den samme elektrode bruges både til at måle potentialforskellen og til at påføre strøm, hvilket er muligt på grund af pipettens relativt lave modstand.
Foto 1 viser en del af sådan et setup.
En enorm kugle, hvoraf en del er synlig på monitoren i midten af billedet, er en celle (en oocyt af frøen Xenopus laevis ), som i øjeblikket er på mikroskopstadiet, en patchpipette er forbundet til den, dens diameter ved næsen er omkring 3 mikron. Efter etablering af en gigaohm-kontakt isolerer den et fragment af membranen med et areal på cirka 7 μm², strømmen fra ionkanalerne i dette fragment kan registreres.
Den netop beskrevne konfiguration kaldes celle-attached patch-clamp (patch-clamp). Det er illustreret i figur 2.
Denne konfiguration har imidlertid to ulemper.
For det første tillader det ikke måling med tilstrækkelig pålidelighed og som følge heraf indstilling af transmembranpotentialforskellen, da begge elektroder, både pipette og eksterne, er på samme side af membranen. Generelt er det muligt, ved at anvende en vaskeopløsning med en ionsammensætning, der efterligner cytoplasmaets sammensætning , at depolarisere membranen uden for pipetten, så potentialforskellen mellem den eksterne elektrode og cytoplasmaet forsvinder, og derefter potentialforskellen. mellem elektroderne vil være lig med det transmembrane potentiale - men alt dette er meget omtrentligt, da den nøjagtige sammensætning af cytoplasmaet er ukendt for os.
For det andet tillader denne konfiguration ikke at kontrollere sammensætningen af mediet uden for pipetten - cytoplasmaet forbliver der, hvis sammensætning ikke er fuldstændig bestemt.
Men til en vis grad er denne egenskab ved den celletilknyttede konfiguration også en fordel: denne konfiguration giver dig mulighed for at arbejde under forhold, der er tættest på fysiologiske.
Men hvis pipetten tages væk fra cellen med en hurtig bevægelse, så vil det "indvendige" stykke af membranen komme af cellen, og der opnås en inderside-ud-konfiguration (ydre side indeni), så navngivet, fordi den indre side af membranen, som normalt vender mod cytoplasmaet, vil være udenfor - i vaskeopløsningen, og den ydre er inde i pipetten. (Skema 3.) En alternativ metode til overgang til konfigurationen indefra og ud er som følger: fra den celle-tilsluttede konfiguration trækkes pipetten jævnt tilbage og danner en lukket vesikel på begge sider; løft derefter pipetten op i luften og sænk den ned i det andet bad med intracellulær opløsning. Under overførslen ødelægges den ydre membran af vesiklen, hvilket resulterer i dannelsen af en indefra-ud-konfiguration.
Nu er potentialforskellen over membranfragmentet strengt taget lig med potentialforskellen mellem elektroderne. Når man bruger denne modifikation, fyldes pipetten naturligvis med en opløsning, der efterligner det ekstracellulære miljø, mens vaskeopløsningen laves tæt i sammensætningen til cytoplasmaet . Samtidig er det ved at ændre sammensætningen af vaskeopløsningen muligt at studere, hvordan sådanne ændringer i cytoplasmaet påvirker strømmen af de kanaler, der er interessante for os - vaskeopløsningen kommer trods alt i kontakt med den cytoplasmatiske side af membranen) . Samtidig kender vi nøjagtigt både væskens sammensætning på begge sider af membranen og potentialforskellen, hvilket giver os mulighed for præcist at karakterisere kanalerne ved hjælp af Nernsts og Goldman-Hodgkin-Katz ' biofysiske ligninger . På samme tid, hvis en kanal kom ind i en isoleret sektion af membranen, så observerer vi opførselen af et enkelt molekyle, og hvis det er en ligand-reguleret kanal -receptor , så dets interaktion med andre enkelte molekyler.
Hvis det i henhold til eksperimentets betingelser er nødvendigt at ændre sammensætningen af det ekstracellulære medium , kan hele cellekonfigurationen bruges . I dette tilfælde trækkes pipetten ikke tilbage fra cellen, men der påføres negativt tryk på den, og dermed ødelægges det isolerede fragment af membranen.
Derefter forbindes pipetten til det intracellulære miljø; da cellen sædvanligvis er lille, så på grund af diffusion viser sammensætningen af cytoplasmaet sig snart at være identisk med sammensætningen af pipetteopløsningen, derfor kender vi som i det foregående tilfælde både sammensætningen af væskerne og potentiel forskel. Bemærk, at hvis pipetteelektroden var "ekstracellulær" og den indre elektrode var "intracellulær" i konfigurationen indefra og ud, har de nu vendt deres roller. Fra synspunktet om at studere strøm gennem kanaler er fordelen ved denne metode, at cellulære strukturer og reguleringsmekanismer er bevaret her. Sandt nok kan stoffer med lav molekylvægt diffundere fra cytoplasmaet ind i pipetten og omvendt, således at den fuldstændige bevarelse af de regulatoriske mekanismer i denne konfiguration ikke kan opnås. En vis ulempe ved konfigurationen kan betragtes som, at den samlede strøm af alle kanaler i cellen måles, og ikke strømmene gennem enkelte kanaler, det vil sige, at opløsningen af denne metode er lavere end for konfigurationer med en revet membran.
For at løse problemet med den reducerede opløsning af metoden tillader ude-ud- konfigurationen (ydre side udenfor). Hvis pipetten efter at have skiftet til helcelletilstand langsomt fjernes fra cellen, vil membranen ikke straks slippe af, men begynder at strække sig ind i røret - dette kan ses på foto 5.
Bemærk venligst, at stykker af cytoplasma er tydeligt synlige i pipetten , som kom der efter ødelæggelsen af membranen under overgangen til helcellen.
Den næste fase af processen er vist på billede 6.
Membranrøret er blevet meget tyndt og næsten usynligt (“ prominens ” på celleoverfladen er en lille del af cytoplasmaet , der er tilbage i membranrøret). I næste øjeblik vil røret gå i stykker, og membranen vil lukke på pipetten i en "omvendt" form - vi vil befinde os i en "udefra-ud" konfiguration
Så pipetten og dens elektrode er, ligesom helcellekonfigurationen, intracellulære, vi ændrer frit sammensætningen af den ekstracellulære opløsning, arealet af membranen under undersøgelse er lille, så vi igen kan studere enkeltkanaler.
Perforeret plaster er en specifik variant af patch-clamp i helcelletilstand. I dette tilfælde indeholder pipetteopløsningen en lille mængde af et specielt antibiotikum , for eksempel amphotericin-B eller gramicidin . Antibiotika af denne klasse danner ionkanaler i cellemembranen på det sted, der er knyttet til mikropipetten.
Denne tilgang gør det muligt at undgå at erstatte cellens indre miljø med en opløsning fra en pipette-elektrode, det vil sige, at cellen forbliver i live med så lidt skade som muligt. Således er cellens reaktioner på stimuli så tæt som muligt på naturlige. Samtidig har denne metode en række ulemper. For det første, sammenlignet med den klassiske helcelle-mode, er den elektriske input-modstand (som hovedsageligt består af pipettens modstand og modstanden ved pipettens forbindelse med membranen) betydeligt højere. Dette sænker kvaliteten af potentiel fastspænding, øger støjniveauet under optagelse og øger værdierne af alle fejl forbundet med ændringer i modstanden af det komplette kredsløb (fra elektroden i den eksterne opløsning til elektroden i pipetten). For det andet tager det ret lang tid (op til 30 minutter) for antibiotikaen at virke, hvilket reducerer eksperimentets brugstid markant. Og for det tredje beskadiger antibiotikummet også membranen ved overgangen til pipettespidsen, hvilket fører til accelereret ødelæggelse af gigaohm-kontakten og yderligere reducerer den effektive eksperimentelle tid. Således kan denne version af metoden med succes kun bruges i eksperimenter, der ikke kræver lang tid at studere de fænomener, der undersøges.
En interessant variation af patch-clamp er den nucleated patch. (Fiksering af potentialet med cellekernen [11] ).
Metoden er som følger. Pipetten bringes til cellen, og bryder derefter med et ryk gennem membranen. Derefter bringes pipettens spids til cellekernen, et let undertryk påføres pipetten. Som et resultat klæber pipetten til kernen. Derefter trækkes pipetten med kernen for enden glat tilbage og fjernes fra buret. Pipetten skal tages ud af cellen på en sådan måde, at sektionen af membranen ved udgangspunktet "sætter på" den vedhæftede kerne og brækker af og vikler sig rundt om den. Resultatet er en specifik version af det udvendige plaster, hvor en meget større del af membranen end i den sædvanlige version af metoden er fastgjort til enden af pipetten, der er viklet rundt om cellekernen.
Når man studerer ændringer i konduktansen af kanaler af samme type som reaktion på en eller anden kemisk påvirkning eller afhængigheden af deres konduktans af potentialforskellen over membranen, er det praktisk at fiksere potentialet og måle kanalstrømmen, som vi har beskrevet. indtil nu. Denne, den mest almindelige type patch-clamp, kaldes en spændingsklemme. Men nogle gange er en forsker interesseret i processerne af transmembran iontransport forbundet med en ændring i membranpotentialet - for eksempel ledningen af en nerveimpuls. I sådanne tilfælde kan du gøre det modsatte: fastgør strømmen på et konstant niveau og studere ændringerne i den potentielle forskel i dette tilfælde. Denne mulighed kaldes strømklemme (strømfiksering).
Registrering af en enkelt kanal af glycinreceptoren . To tilstande er tydeligt synlige: lukket (det svarer til nulstrøm) og åbent (det svarer til en strøm på omkring 7 picoampere). Kanalen skifter spontant fra en tilstand til en anden fra tid til anden, der er ingen mellemtilstande. Optagelse giver dig mulighed for at få to af kanalens vigtigste egenskaber: ledningsevne (baseret på værdierne af transmembranpotentialet og strømmen) og sandsynligheden for at være i åben tilstand (defineret som forholdet mellem det tidspunkt, hvor kanalen er åben til det tidspunkt, hvor strømmen er optaget). Forresten er kanalens aktivitet oftest fysiologisk reguleret ved at ændre denne sandsynlighed.
Indtastning i helcellekonfigurationen. Opsamlingskanalepitelcelle. Transmembranpotentiale -60 mV. Med intervaller på 1 minut i 30 sekunder injiceres amilorid, en hæmmer af den epiteliale natriumkanal, i vaskeopløsningen (tidspunktet for administration er vist med mørke rektangler). Forresten er følsomhed over for inhibitorer en anden af kanalens vigtigste egenskaber. Indførelsen af amilorid fører hver gang til et fald i strømmen til nul, hvilket indebærer, at næsten al ledningsevnen ved -60 mV i denne celle er ledningsevnen af den epiteliale natriumkanal . I modsætning til den tidligere optagelse ser de aktuelle ændringer ud til at være kontinuerlige - dette skyldes, at mange kanaler optages på samme tid (ca. 2000), henholdsvis er der cirka 2000 aktuelle niveauer - fra "alle åbne" til "alt lukket".
Dette er en teknik udviklet til at øge produktiviteten inden for elektrofysiologi, når bulkmålinger af transmembrankonduktans er påkrævet. Denne metode finder især anvendelse i farmakologisk forskning. Hvis pipetten med en klassisk patch-clamp placeres på en stationær celle, så påføres cellesuspensionen tværtimod med en plan celle på en mikrochip med ordnede huller med subcellulær diameter. Cellen sætter sig på hullet, suger til det ved hjælp af en pumpe, som et resultat af hvilken en gigaohm-kontakt dannes. Endvidere udføres undersøgelsen efter samme princip som i den traditionelle patch-clamp. [12] [13]
Den største fordel ved den plane patch-clamp er, at eksperimentet er meget enklere, kræver mindre dygtighed fra forskeren og tager mindre tid. En hel del målinger kan udføres automatisk efter hinanden. Ifølge forfatterne af teknikken gør denne metode det lettere at perfundere det intracellulære indhold samt mere nøjagtigt dosere de undersøgte eller testfarmakologiske stoffer. Med denne metode er det relativt nemt at arbejde med celler, der normalt er i suspension – i særdeleshed med blodceller.
Imidlertid har den plane patch-clamp-metode en række væsentlige begrænsninger. Det vigtigste er, at de undersøgte celler skal være i suspension. Derfor er det ikke muligt at arbejde med vævsfragmenter, det er umuligt at studere interaktionen af celler med hinanden. For at mobilisere celler er det nødvendigt at bruge proteaseenzymer, der kan modificere adfærden af de undersøgte ionkanaler.
Alt det ovenstående fører til, at den plane patch-clamp hovedsageligt finder anvendelse i farmakologiske screeningsundersøgelser, hvor massemålinger er påkrævet, men ikke er så almindelig inden for grundvidenskab.