Enzymatisk promiskuitet er et enzyms evne til at katalysere en tilfældig bireaktion ud over dets hovedreaktion. Selvom enzymer er ekstremt specifikke katalysatorer, kan de ofte udføre sidereaktioner ud over deres primære naturlige katalytiske aktivitet [1] . Sideaktivitet af enzymet forløber normalt langsommere sammenlignet med hovedaktiviteten og er under neutral selektion. Selvom disse aktiviteter normalt er fysiologisk irrelevante, kan disse aktiviteter under nye selektive pres være gavnlige, og derved anspore udviklingen af tidligere sekundære aktiviteter til at blive den nye primære aktivitet [2] . Et eksempel på dette er atrazin -chlorhydrolasen ( kodet af atzA ) fra Pseudomonas sp. , afledt af melamindeaminase (kodet af triA ), som har meget lille sideaktivitet på atrazin, et menneskeskabt kemikalie [3] .
Enzymer udvikles til at katalysere en specifik reaktion på et specifikt substrat med høj katalytisk effektivitet ( k cat /K M , se også Michaelis-Menten kinetik ). Men ud over denne hovedaktivitet har de sekundære aktiviteter, som normalt er flere størrelsesordener lavere i aktivitet, og som ikke er resultatet af evolutionær selektion og derfor ikke deltager i organismens fysiologi. Dette fænomen tillader enzymer at påtage sig nye funktioner, da sideaktiviteter kan drage fordel under nye selektionstryk, hvilket fører til duplikering af genet, der koder for enzymet, og selektion af sideaktiviteten som den nye primære aktivitet.
Der er flere teoretiske modeller til at forudsige rækkefølgen af duplikering og ændring af specialisering, men selve processen er mere indviklet og uklar (§ Rekonstruerede enzymer nedenfor) [4] . På den ene side fører genamplifikation til en stigning i enzymkoncentration og potentiel frihed fra restriktiv regulering, hvilket som følge heraf øger reaktionshastigheden ( v ) af enzymets sideaktivitet, hvilket gør dets virkninger mere udtalt fysiologisk ("gendosering") effekt") [5] . På den anden side kan enzymer udvikle øget sekundær aktivitet med lidt tab af primær aktivitet ("stabilitet") med lidt adaptiv konflikt (§ Stabilitet og plasticitet nedenfor) [6] .
En undersøgelse af fire forskellige hydrolaser (human serum paraoxonase (PON1), pseudomonad phosphotriesterase (PTE), protein tyrosin phosphatase (PTP) og human carbonic anhydrase II (CAII)) viste, at deres hovedaktivitet er "modstandsdygtig" over for forandringer, mens sideaktiviteter er "svagere og mere fleksible. Især valget af sideaktiviteter, (gennem rettet evolution), reducerer i starten ikke enzymets hovedaktivitet (deraf dets "stabilitet"), men påvirker i høj grad sideaktiviteterne (deraf deres "plasticitet") [6] .
Phosphotriesterase (PTE) fra Pseudomonas diminuta udviklede sig til at blive 10enarylesterase (hydrolase P-O til C-O) i atten cyklusser, meden [7] .
Det betyder for det første, at et specialiseret enzym (monofunktionelt) i evolutionsprocessen passerer gennem et universelt stadie (multifunktionelt), før det bliver specialiseret igen - formentlig efter genduplikation ifølge IAD-modellen - og for det andet er sideaktiviteterne mere plastiske, forskellig fra hovedaktiviteten.
Det seneste og mest slående eksempel på udviklingen af enzymer er fremkomsten af biologisk reparerende enzymer i løbet af de sidste 60 år. På grund af det meget lille antal aminosyresubstitutioner giver de en fremragende model til at studere udviklingen af enzymer i naturen. Men at bruge eksisterende enzymer til at bestemme, hvordan en enzymfamilie udviklede sig, har den ulempe, at et nyudviklet enzym sammenlignes med paraloger uden at kende den sande identitet af forfaderen, før de to gener divergerer. Dette problem kan løses takket være rekonstruktionen af forfædrene. Først foreslået i 1963 af Linus Pauling og Emil Zuckerkandl, forfædres rekonstruktion er afledning og syntese af et gen fra den forfædres form af en gruppe gener [8] , som for nylig er blevet genoplivet af forbedrede slutningsteknikker [9] og billige kunstige gensyntese [10] , hvilket resulterer i behovet for at studere adskillige forfædres enzymer, som nogle omtaler som "stemzymer" [11] [12] .
Beviser opnået med det omformede enzym tyder på, at rækkefølgen af begivenheder, når ny aktivitet forbedres, og et gen duplikeres, ikke er entydigt, i modsætning til hvad teoretiske modeller for genudvikling antyder.
En undersøgelse viste, at stamgenet fra pattedyrs immunforsvarsproteasefamilie havde bredere specificitet og højere katalytisk effektivitet end den moderne paralogfamilie [11], hvorimod en anden undersøgelse viste, at den forfædres hvirveldyrsteroidreceptor var en østrogenreceptor med ringe substrat-tvetydighed for andre . hormoner, hvilket indikerer, at de sandsynligvis ikke var syntetiseret på det tidspunkt [13] .
Denne variation i arvelig specificitet er blevet observeret ikke kun mellem forskellige gener, men også inden for den samme genfamilie. I lyset af det store antal paraloge svampe-a-glucosidase-gener med en række specifikke maltose-lignende (maltose, turanose, maltotriose, maltulose og saccharose) og isomaltose-lignende (isomaltose og palatinose) substrater, rekonstruerede undersøgelsen alle nøgleforfædre og fandt ud af, at paralogernes sidste fælles forfader for det meste var aktiv på maltoselignende substrater med kun sporaktivitet for isomaltoselignende sukkerarter, selvom det førte til en linje af isomaltoseglucosidaser og en linje, der spaltede yderligere i maltoseglucosidaser og isomaltoseglucosidaser. I modsætning hertil havde forfaderen før den sidste spaltning en mere udtalt isomaltose-lignende glucosidaseaktivitet [4] .
Roy Jensen foreslog i 1976, at primære enzymer skal være meget promiskuøse, for at metaboliske netværk kan samles på en patchwork-måde (deraf navnet, patchwork-modellen ). Denne oprindelige katalytiske alsidighed gik senere tabt til fordel for stærkt katalytiske specialiserede orthologe enzymer. [14] Som en konsekvens heraf har mange enzymer af centralt stofskifte strukturelle homologer , der divergerede før fremkomsten af den sidste universelle fælles forfader [15] .
Promiskuitet er ikke kun en primordial egenskab, men en meget almindelig egenskab i moderne genomer. En række eksperimenter blev udført for at evaluere fordelingen af promiskuitetsenzymaktivitet i E. coli . I E. coli kunne 21 ud af 104 testede enkeltgener (fra Keio-samlingen [16] ) elimineres ved at overudtrykke et ikke-kognat E. coli-protein (ved at bruge et samlet sæt plasmider fra ASKA-samlingen [17] ). Mekanismerne, hvorved en ikke-kognat ORF kan genoprette knockout, kan grupperes i otte kategorier: isoenzym-overekspression (homologer), substrat-fletydighed, transport-fletydighed (oprensning), katalytisk promiskuitet, opretholdelse af metabolisk flux (herunder overekspression af en stor syntasekomponent i fraværet af en aminotransferase-underenhed), bypass, regulatoriske effekter og ukendte mekanismer [5] . På samme måde tillod overekspression af ORF-samlingen E. coli at øge resistensen med mere end en størrelsesorden i 86 ud af 237 giftige miljøer [18] .
Det er kendt, at homologer nogle gange er promiskuøse i forhold til hinandens basale reaktioner [19] . Denne krydspromiskuitet er mest undersøgt med medlemmer af alkalisk phosphatase-superfamilien , som katalyserer den hydrolytiske reaktion ved sulfat-, phosphonat-, monophosphat-, diphosphat- eller triphosphatesterbindingen af flere forbindelser [20] . På trods af divergensen har homologer forskellige grader af gensidig promiskuitet: forskelle i promiskuitet er relateret til de involverede mekanismer, især det nødvendige mellemliggende [20] .
Enzymer har en tendens til at være i en tilstand, der ikke kun er en afvejning mellem stabilitet og katalytisk effektivitet, men dette gælder også for specificitet og evolverbarhed, hvor de to sidstnævnte bestemmer, om et enzym er alsidigt (højt udviklet på grund af stor promiskuitet, men lav hovedaktivitet) eller speciel (høj hovedaktivitet, dårligt udviklet på grund af høj forståelighed) [21] . Eksempler er enzymer til primær og sekundær metabolisme i planter (§ Sekundær plantemetabolisme nedenfor). Andre faktorer kan spille ind, for eksempel viser glycerophosphodiesterase ( gpdQ ) fra Enterobacter aerogenes forskellige værdier af sin promiskuøse aktivitet afhængigt af de to metalioner, den binder, som dikteret af iontilgængelighed [22] .v I nogle tilfælde, promiskuitet kan øges ved at svække specificiteten af det aktive sted ved at øge det med en enkelt mutation, som det var tilfældet for D297G-mutanten af E. coli L-Ala-D/L-Glu- epimerase (ycjG ) og E323G-laktoniserende enzym II mutant af Pseudomonas muconate, hvilket tillader dem tilfældigt at katalysere aktivitet O-succinylbenzoatsyntase ( menC ) [23] . Omvendt kan promiskuiteten reduceres, som det var tilfældet for γ-humulensyntase (sesquiterpensyntase) fra Abies grandis, som er kendt for at producere 52 forskellige sesquiterpener fra farnesyldiphosphat efter flere mutationer [24] .
Undersøgelser af enzymer med bred specificitet – ikke promiskuøse, men konceptuelt beslægtede – såsom trypsin og chymotrypsin fra pattedyr og den bifunktionelle isopropylmalat-isomerase/homoaconitase fra Pyrococcus horikoshii har vist, at mobilitet i det aktive sted i høj grad bidrager til den katalytiske elasticitet af enzymet [25 ] 26] .
Promiskuitetsaktivitet er en ikke-nativ aktivitet, for hvilken enzymet ikke har udviklet sig, som stammer fra den akkomodative konformation af det aktive sted. Enzymets hovedaktivitet er imidlertid ikke kun resultatet af selektion mod en høj katalytisk hastighed i forhold til et bestemt substrat for at opnå et bestemt produkt, men også for at undgå dannelsen af giftige eller uønskede produkter [2] . For eksempel, hvis tRNA-syntese indlæser den forkerte aminosyre i tRNA'et, vil det resulterende peptid have uventet ændrede egenskaber, hvorfor flere yderligere domæner er til stede for at forbedre nøjagtigheden [27] . I lighed med tRNA-syntesereaktionen adenylerer den første thyrocidinsynthetase ( tyrA ) underenhed fra Bacillus brevis phenylalaninmolekylet for at bruge adenyldelen som løftestang til at producere thyrokidin, et cyklisk ikke -ribosomalt peptid . Da enzymets specificitet blev undersøgt, viste det sig at have høj selektivitet for naturlige aminosyrer, der ikke er phenylalanin, men meget mere tolerante over for ikke-naturlige aminosyrer [28] . Især blev de fleste aminosyrer ikke katalyseret, mens den næstmest katalyserede native aminosyre var tyrosin i strukturen, men en tusindedel mere end phenylalanin, mens flere ikke-kodende aminosyrer katalyserede bedre end tyrosin, nemlig D-phenylalanin, β-cyclohexyl - L-alanin, 4-amino-L-phenylalanin og L-norleucin [28] .
Et specifikt tilfælde af udvalgt sekundær aktivitet er restriktionspolymeraserne og endonukleaserne, hvor den ukorrekte aktivitet faktisk er resultatet af et kompromis mellem nøjagtighed og evolverbarhed. For eksempel, for restriktionsendonukleaser, er forkert aktivitet ( stjerneaktivitet ) ofte dødelig for organismen, men en lille mængde af denne aktivitet tillader udviklingen af nye funktioner til at modvirke patogener [29] .
Planter producerer et stort antal sekundære metabolitter på grund af enzymer, der i modsætning til dem, der er involveret i primær metabolisme, er mindre katalytisk effektive, men har større mekanisk elasticitet (typer af reaktioner) og bredere specificitet. Den liberale drifttærskel (forårsaget af lavt selektionstryk på grund af lille befolkningsstørrelse) tillader, at den konditionsgevinst, som én fødevare giver, understøtter andre aktiviteter, selvom de kan være fysiologisk ubrugelige [30] .
I biokatalyse søger de efter mange reaktioner, som ikke findes i naturen. Til dette identificeres og udvikles enzymer med ringe promiskuøs aktivitet i forhold til den ønskede reaktion gennem rettet evolution eller rationelt design [31] .
Et eksempel på et bredt udviklet enzym er ω-transaminase, som kan erstatte en keton med en chiral amin [32] , og derfor er biblioteker af forskellige homologer kommercielt tilgængelige til hurtig biomining (f.eks . Codexis ).
Et andet eksempel er muligheden for at bruge den tilfældige aktivitet af cysteinsyntase ( cysM ) over for nukleofiler for at opnå ikke-proteinogene aminosyrer [33] .
Ligheden mellem enzymatiske reaktioner ( EC ) kan beregnes ved hjælp af koblingsændringer, reaktionscentre eller substrukturscores ( EC-BLAST ) [34] .
Mens promiskuitet for det meste studeres med hensyn til standard enzymkinetik, er lægemiddelbinding og deres efterfølgende reaktion en promiskuøs aktivitet, da enzymet katalyserer en inaktiveringsreaktion mod et nyt substrat, det ikke har udviklet sig til at katalysere [6] . Dette kan skyldes det faktum, at proteiner kun har et lille antal forskellige ligandbindingssteder.
På den anden side er metabolismen af pattedyrxenobiotika designet til at have en bred specificitet til oxidation, binding og fjernelse af fremmede lipofile forbindelser, der kan være giftige, såsom plantealkaloider, så deres evne til at afgifte menneskeskabte xenobiotika er en forlængelse af dette. [35] .
| Enzymer | |
|---|---|
| Aktivitet | |
| Regulering | |
| Klassifikation | |
| Typer |
|