Golden Gate assembly , også Golden Gate-kloning , er en DNA-kloningsmetode , der giver dig mulighed for samtidigt og ordentligt at samle flere DNA- fragmenter til én ved hjælp af type IIs restriktionsendonukleaser og bakteriofag T4 DNA-ligase [1] [2] . Samlingen af molekylet udføres in vitro . De mest almindeligt anvendte type IIs restriktionsendonukleaser inkluderer Bsal, BsmBI og BbsI.
I modsætning til de mest almindelige restriktaser såsom EcoRI og BamHI , er restriktionsenzymer, der anvendes til Golden Gate, i stand til at skære DNA uden for genkendelsesstedet og dermed skabe ikke-palindromiske klæbrige ender [3] . På grund af evnen til at opnå en hvilken som helst af de 256 forskellige varianter af klæbrige ender med en længde på 4 basepar , bliver det muligt at samle et DNA-molekyle fra et stort antal fragmenter ved hjælp af kombinationer af klæbrige ender [3] . I praksis betyder det, at Golden Gate-sekvensen vil være praktisk talt problemfri. Da sekvensen af synteseproduktet ikke bærer et restriktionsenzymgenkendelsessted , kan den , når den først er samlet korrekt, ikke skæres igen af restriktionsenzymer . Det betyder, at reaktionen bliver praktisk talt irreversibel [3] .
Den sædvanlige cycler -protokol specificerer temperatursvingninger fra 16 °C (optimalt for ligaser) til 37 °C (optimalt for restriktionsenzymer) [4] . Denne syntesemetode kan bruges både til en enkelt sømløs insertion og til samling af flere DNA-fragmenter i et rør [5] .
Sekvenser indeholdende "sømme" (spor af brugen af kloningssystemer) dannes ofte som et resultat af samlingen af et stort antal fragmenter. For eksempel i Gateway multi-segment samlingsmetoden tilføjes DNA-fragmenter til donorfragmentet sammen med yderligere att -sekvenser , der matcher i tilstødende segmenter. Dette fører til, at DNA-fragmenterne i slutproduktet er adskilt af att -sekvenser [6] . I BioBrick -samlingen forbliver der mellem DNA-fragmenterne tilføjet til plasmidet en otte-nukleotid "søm", der koder for tyrosin og et stopkodon [6] .
Golden Gate-syntese bruger type IIs restriktionsenzymer , der skærer DNA-sekvensen uden for dets genkendelsessted [6] . Det samme type IIs restriktionsenzym kan skabe forskellige klæbrige ender for forskellige DNA-sekvenser. Især ved at bruge BsaI-enzymet er det teoretisk muligt at opnå hver af de 256 varianter af klæbrige ender (længde 4 bp) i nærvær af de tilsvarende DNA-fragmenter [6] . Med den korrekte syntese af klæbrige endeafsnit forbindes disse fragmenter uden "sømme" mellem delene. I nogle tilfælde kan slutproduktet være betinget sømløst - restriktionsenzymgenkendelsessteder kan efterlades på begge sider af multi-fragment-insertet i donor-DNA'et for at udskære hele fragmentet i de følgende trin [6] . Da yderligere DNA-fragmenter kan indsættes i vektorer uden "sømme" inde i den åbne læseramme , er Golden Gate-metoden meget brugt i proteinteknologi [6] .
Selvom Golden Gate syntese fremskynder multi-segment samling, er det nyttigt at bruge specielle plasmid arkitekturer til at øge udbyttet [5] . Ved hvert trin er Golden Gate-metoden i stand til at samle op til ni DNA-fragmenter. Dette kræver, at de klæbrige ender af tilstødende DNA-fragmenter, der skal kombineres, er homologe med hinanden, og restriktionsenzymgenkendelsesstederne bør ikke inkluderes i de udskårne fragmenter [5] . Efter at fragmenterne er ligeret med bakteriofag T4 DNA-ligase, vil produktet ikke indeholde restriktionsenzym IIS-genkendelsessteder og vil ikke blive omskåret i det videre forløb af reaktionen [5] . Til gengæld kan uligerede steder tværtimod interagere med restriktionsenzymet og derved tilføje flere fragmenter til reaktionsblandingen [5] . Med den korrekte indstilling af eksperimentet og valget af DNA-fragmenter kan et lineært produkt opnås i én cyklus [5] .
Restriktionsenzymsamling af DNA-sekvensen reguleres af forskellige kloningsstandarder for at minimere nedbrydning af kloningseffektivitet og forstyrrelse af plasmidfunktionen. Sådanne effekter kan være forårsaget af ukorrekt samling, for eksempel hvis der er utilsigtede restriktionssteder i insertet eller vektoren [7] .
Der er to trin til kloning af Golden Gate [7] . I det første trin samles en monogen sekvens fra sådanne elementer som en promotor , åbne læserammer og en terminator [7] . Derefter kombineres adskillige monogene sekvenser opnået i det første trin på det andet trin af samlingen [7] . For at implementere Golden Gate-samlingen, som består af 2 trin eller flere, bruges standardsystemerne MoClo (modulær kloning) og GoldenBraid [7] .
MoClo-standarden opdeler genetiske elementer i 4 forskellige niveauer:
MoClo bruger en parallel tilgang, hvor alle resulterende niveau 0-moduler har BpiI-restriktionssteder på begge sider af indsatsen. Vektoren, som generne vil blive tilføjet til, har to inverterede Bsal-restriktionsenzymgenkendelsessteder og en udskåret selektionsmarkør mellem dem. [7] Ofte fungerer lacZ -genet som en sådan markør , hvilket muliggør negativ udvælgelse af plasmider, hvori reportergenet er blevet erstattet med det samlede DNA [7] . De klæbrige ender af hvert niveau 0-modul og målvektor må kun være komplementære til de klæbrige ender af det tilstødende fragment, hvor sekvensen af kombinationer af klæbrige ender bestemmer arkitekturen af det endelige produkt [7] . En Golden Gate-bygning starter normalt med niveau 0-moduler, der indeholder individuelle gener [5] . For at identificere utilsigtede restriktionssteder er det nødvendigt at udføre sekventering af niveau 0-moduler [5] . Men hvis niveau 0 modulerne er for store, skal samlingen starte med niveau −1 sekvenser, som også skal sekvenseres [5] . Hvis samlingen blev startet fra niveau −1 fragmenter, behøver niveau 0 modulerne ikke at blive sekvenseret igen [5] .
Niveau -1Niveau −1 fragmenter bruges i samlingen af lange niveau 0 moduler [5] . For at opnå og udvikle sådanne fragmenter anvendes sædvanligvis ligering af sekvenser med stumpe ender og efterfølgende PCR [5] . Målvektoren bør ikke indeholde restriktionsenzym type II'er, som bruges i næste samlingstrin [5] .
Niveau 0Niveau 0-moduler er rygraden i MoClo-systemet, da de indeholder komplette genetiske elementer såsom promotor , 5' utranslateret region (UTR) , proteinkodende sekvens og terminator [5] . For vellykket Golden Gate-samling må de interne sekvenser af niveau 0-moduler ikke indeholde BsaI-, BpiI- og Esp3I-restriktionsenzymgenkendelsesstederne II'er, men skal flankeres (dvs. flankeret) af to BsaI-restriktionssteder i omvendt orientering [5] .
Hvis det, som et resultat af sekventering, blev fundet, at niveau 0-modulet indeholder et uønsket restriktionssted, så kan det muteres i silico ved at fjerne eller erstatte ét nukleotid [5] . Samtidig er det nødvendigt at sikre sig, at den introducerede mutation ikke vil påvirke egenskaberne af produktet syntetiseret fra DNA (normalt RNA eller protein) [5] . Synonyme mutationer anbefales at blive introduceret i proteinkodende sekvens, da de ikke ændrer sekvensen af det syntetiserede protein og derfor ikke påvirker genets funktion [5] .
Niveau 1Niveau 1 målvektoren bestemmer placeringen og retningen af den indsatte konstruktion [8] . I en sådan vektor er selektionsmarkørgenet ( lacZ ) flankeret af to restriktionssteder på hver side. I dette tilfælde er det interne sted (BsaI) inverteret, og det eksterne sted (BpiI) er placeret i en direkte orientering. Der er 14 varianter af niveau 1-vektoren, der adskiller sig i de klæbrige endesekvenser for eksterne steder, men som ikke adskiller sig i de klæbrige endesekvenser af interne steder [8] . Således kan et korrekt sammensat sæt af niveau 0-moduler klones ind i enhver af disse vektorer [8] .
Niveau 1-vektorer bruges til forbigående ekspression i planter drevet af Agrobacterium [8] .
Niveau 2Niveau 2 målvektorer har 2 inverterede BpiI restriktionsenzymgenkendelsessteder til indsættelse af niveau 1 moduler [8] . Restriktionsstedet i vektoren før insertionsstedet skal være komplementært til stedet før starten af genet i niveau 1 modulet, restriktionsstedet efter insertionsstedet er universelt [8] . Med hver kloning kan 2 til 6 gener indsættes i vektoren [8] .
Tilføjelse af flere gener i ét trin er uønsket, da det sandsynligvis vil føre til fejlmontering på grund af forkerte sticky-end-kombinationer [8] .
Samlingen af konstruktioner bestående af mere end 6 gener skal således udføres i flere trin. Dette kræver linkerendesekvenser, der indeholder Bsal- eller BsmBI-restriktionsenzymgenkendelsesstederne i en omvendt position og en ny selektionsmarkør (blå eller lilla) [8] . På hvert trin er det nødvendigt at ændre restriktionsenzymet og markøren [8] . Når de screenes , vil kolonier, der indeholder en korrekt samlet vektor, skifte farve ved hvert samlingstrin (blå til lilla), men på det sidste trin, når der bruges en lukkeende linker, vil farven på kolonierne være hvid [8] .
Niveau MM-niveau-målvektorerne ligner niveau 2-vektorerne bortset fra tilstedeværelsen af et Bsal-sted før parret af inverterede BpiI-steder [9] . Når et eller flere gener klones ind i en vektor på M-niveau, tilføjes et andet Bsal-restriktionssted med en specifik (M) linkerendesekvens. På grund af dette kan fragmentet, der indeholder alle de samlede gener, udskæres og bruges i det næste kloningstrin (P-niveau) [8] .
Niveau PP-niveau-målvektorerne ligner dem for M-niveauet, men BpiI-stederne er erstattet med BsaI, og Bsal-stederne er erstattet med BpiI. Multiple M-niveaukonstruktioner med kompatible klæbrige ender kan klones ind i mål-P-vektoren i et enkelt trin. I teorien er det muligt at samle op til 36 gener i én konstruktion, når man kører 6 parallelle reaktioner af M-niveauet (6 gener hver), men i praksis samles der normalt færre gener på grund af det faktum, at så store konstruktioner ikke er nødvendige i de fleste projekter [8] . På trods af dette er M- og P-niveauvektorerne designet på en sådan måde, at gener klonet ind i P-niveauvektoren kan klones yderligere ind i M-niveauvektoren og omvendt [8] .
Ifølge standard Golden Gate-protokollen bliver de restriktionssteder, der blev brugt i det foregående kloningstrin, utilgængelige [10] . Samling af mere end 6 gener kræver et andet type IIs restriktionsenzym og introduktionen af dets tilsvarende genkendelsessteder [10] . Dette kan gøres med vektorer på niveau 2 eller niveauer M og P. GoldenBraid giver en variation af M- og P-niveausystemet.
Til kloning ifølge GoldenBraid-metoden anvendes et system med 4 plasmider, der er i stand til at danne en dobbeltløkke (de såkaldte "guirlander" - "fletninger"). Et sådant system tillader binær samling af flere strukturer på én gang [10] .
Golden Gate-samlingsmetoden kan også bruges til at udføre mutagenese (Golden Mutagenese). Denne teknologi er nem at anvende takket være online primervalgværktøjer ( GoldenMutagenesis webværktøj ) og vektorer [11] .